细菌的冻干溶解产物在制备治疗肺结节的药物中的应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种细菌的冻干溶解产物，具体来说是细菌的冻干溶解产物在制备治疗肺结节的药物中的应用。


背景技术：

2.细菌冻干溶解产物作为一种已上市的口服免疫刺激剂，含有来自八种常见致病细菌物种(流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌)的提取物，临床上主要用于预防呼吸道感染，是一种很有前途的化学预防策略。其原理是刺激外周血单核细胞和肺泡中巨噬细胞活性，加快t淋巴细胞成熟，纠正失衡的t抑制/t辅助细胞的比例，提高t淋巴细胞反应性，提高nk细胞活性。
3.细菌的冻干溶解产物中的活性成分提取自八种呼吸道常见致病菌，它经由黏膜免疫系统激活宿主防御机制，具有特异和非特异的免疫刺激作用，刺激激活体内细胞免疫及体液免疫应答，能激活黏膜源性淋巴组织，刺激补体及细胞活素生成及促进气管黏膜分泌分泌型免疫球蛋白。临床上可以作为一种口服免疫刺激剂，预防呼吸道的反复感染及慢性支气管炎急性发作。在人体实验中，能刺激外周血单核细胞和肺泡中巨噬细胞活性，加快t淋巴细胞成熟，提高唾液siga和支气管肺泡灌洗中siga水平，还可纠正失衡的t抑制/t辅助细胞的比例，提高t淋巴细胞反应性及抗病毒干扰素活性。国内外已有多项研究报道口服泛福舒治疗慢性支气管炎急性发作取得良好疗效，可增强患者机体免疫力，减少慢性支气管炎急性发作次数、缩短病程、减轻症状，减少患支气管肺炎或肺炎的人次和住院人次，达到防治慢性支气管炎急性发作的目的，显著降低了有慢性支气管炎病史和轻度copd患者的急性加重发生率，并且耐受性良好。
4.但对于肺结节的治疗作用目前尚未见报道。
5.肺部磨玻璃样结节(ground glass opacity,ggo)正在成为肿瘤学中的一个重要临床困境，因为它在临床实践中的诊断正在增加。一般而言，ct上持续发现ggo可能提示肿瘤性疾病，当存在实体成分时，恶性肿瘤的可能性更高。临床上对ggo的诊断与干预措施目前没有规则，并且很难简化，因为观察者之间总是存在变异性，并且测量再现性特别困难。根据临床目前的基本共识，更高的恶性肿瘤风险将自动触发更积极的随访，包括更多的诊断检查，增加患者的焦虑，增加额外的辐射暴露和成本。肺组织切除术引起的肺组织丢失和切除潜在恶性结节并发症的风险也受到人们关注。然而，迄今为止，尚无完善的临床试验用于提供化学方法治疗癌前病变的初步证据。过去的研究大多聚焦于基于分子途径的化合物，很少涉及免疫治疗。
6.本试验首次提出了免疫刺激药物通过促进人体自身免疫以杀灭癌细胞，阻止癌前病变进展的可能性。目前的试验代表了这类主题的化学免疫干预的第一阶段ii期研究。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供细菌的冻干溶解产物在制备治疗肺结节的药物中的应用，所述的细菌的冻干溶解产物在制备治疗肺结节的药物中的应用要解决现有技术中治疗肺结节的药物效果不佳的技术问题。
8.本发明提供了细菌的冻干溶解产物在制备治疗肺结节的药物中的应用，所述的细菌为流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷白菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌的组合。
9.进一步的，所述的细菌的冻干溶解产物的制备方法为：以流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷白菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌为原料，经发酵扩增、灭菌浓缩、脱毒破壁，提取细菌的细胞壁、细胞膜和荚膜，获得细菌的冻干溶解产物。
10.进一步的，所述的细菌的冻干溶解产物来自瑞士欧姆制药有限公司，其商品为泛福舒，注册证号为s20150041。
11.本发明为一项ii期、回顾性、开放标签、单中心、随机对照的临床研究。入组103例慢性支气管炎合并肺小结节患者(慢性支气管炎由有经验的临床医生结合病史诊断，肺小结节经高分辨率ct扫描确诊)，排除含“合并药物过敏者”。入组患者中，有44名患者接受了规范的口服细菌的冻干溶解产物治疗，其余患者按照临床常规方案治疗，所有患者在治疗期间规律随访，并有留存的胸部ct影像记录，采集的数据均系2022年1月至2023年3月之间完成并记录于我院的数据。
12.本发明将基于肺结节智能辅助检测平台(target call lung nodule analysis platform)进行，运用计算机机器学习技术和深度卷积神经元网络(deep convolutional neural network,dcnn)，对胸部薄层ct扫描影像实现肺部医学影像自动三维重建及分割，利用深度学习技术自动检出、标识、分析肺结节，支持同步载入患者多次检查影像(随访)，前后影像中肺结节自动配准、定位，显示和比较肺结节大小、形状、位置、良恶性概率判断等信息。
13.这是一项由中国肺癌防治联盟官方技术支持的，已开发的自动诊断平台，包括基于深度学习的ai算法和三阶段端到端深度常规神经网络(dcnn)，以分析患者的ldct图像。这个3d u-net分割网络最初使用公开可用的肺图像数据库联盟和图像数据库资源倡议(lidc-idri)数据集进行训练，然后在来自美国和中国医院的大约20,000个样本的数据集上进一步训练组织病理学结果。通过经验丰富的放射科医师进一步评估，人工标记临床上真阳性结节和假阳性结节，对第一阶段u-net识别的斑块进行分割。随后fprn和恶性/良性(m/b)分类器根据病理结果确认的真实恶性状态在补丁级别进行训练。
14.对图像进行分析后，ai算法将每个参与者提供发展为肺癌的风险评分(范围从0到100％)和诊断声明。前期文献证据显示，当将ai风险评分与放射学特征相结合时，auc在诊断早期肺癌的能力方面已经有所改善。敏感性超过80％，特异性在62.52％和65.96％之间。算法系专属本地服务器分析计算，我们将患者影像信息经过匿名化处理后上传分析。
15.本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明通过细菌的冻干溶解产物治疗慢性支气管炎合并肺结节患者的回顾性临床观察，比较对照组和治疗组6个月随访后基线薄层ct扫描中检测到的高风险磨玻璃结节的变化，明确了口服细菌的冻干溶解产物
对高危肺结节具有抑制侵袭与恶变的作用。口服细菌的冻干溶解产物可以改善ct筛查发现的高危肺结节患者临床结局，减缓侵袭趋势。这些高危结节很可能是腺癌的前体，因此细菌的冻干溶解产物对此类结节的生物活性有可能成为未来化学预防试验的中间终点，并且对早期肺癌诊断与治疗以及未来的实践指南产生影响。
附图说明
16.图1是受试者入组筛选流程图。
17.图2是ai分析计算得出的治疗组与对照组风险概率改变瀑布图。
具体实施方式
18.实施例1
19.本实施例涉及的细菌的冻干溶解产物的制备方法，包括如下步骤：
20.1)组成混合菌液
21.备好流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌，按照1:1:1:1:1:1:1:1的细菌数量比组成混合菌液；
22.2)耐药菌种扩增
23.将上述八个菌种的混合菌液种入发酵罐扩增；得到细菌培养物；
24.3)然后经高温(121℃)使其失活后，离心收集，取沉淀物，沉淀物经破壁分离，提取细菌的细胞壁、细胞膜和荚膜，在萃取过程中生物质被化学裂解，获得裂解物，然后结合形成多聚裂解物；
25.4)最后进行净化和消毒，然后将多聚裂解物浓缩物在-40℃冻干，获得细菌的冻干溶解产物，备用。
26.本药品为免疫调节剂，其去除了细菌中的有害成分脂多糖，保留了免疫活性物质，可有效激活人体固有及适应性免疫，与黏膜相关淋巴组织相互作用，产生能直接起到对抗感染的作用的lga抗体。
27.实施例2
28.下述实施例采用的细菌的冻干溶解产物来自泛福舒，注册证号为s20150041(其制备方法同实施例1)；也可以采用本发明实施例1的产品进行试验(效果相同)。
29.一、研究设计和受试者
30.1.1研究设计
31.本研究为一项单中心回顾性临床研究，旨在通过回顾性数据分析探讨细菌的冻干溶解产物在慢性支气管炎合并肺小结节患者病情稳定期间口服治疗对于此类患者肺部结节的效果和不良反应。
32.1.2研究人群
33.(1)入选标准：
34.患者必须满足以下所有条件：
35.1.受试者在2022年1月至2023年3月之间就诊于我院，电子病历诊断记录为“慢性支气管炎”，同时，经胸部ct确诊为“肺结节”。
36.2.受试者签署书面知情同意书，或拒绝来院签署书面知情同意书但以电话形式口头同意，或联系三次仍然无法联系到受试者。
37.3.受试者的既往胸部x线影像记录可获得。
38.4.ct图像质量符合ai诊断系统需要，无明显呼吸运动伪影者。
39.5.受试者年龄在18至80周岁之间。
40.6.受试者接受泛福舒片或临床常规方案治疗慢性支气管炎，并在治疗期间按照医生建议的周期规律随访。
41.(2)排除标准：
42.1.合并症：在筛选时存在临床上显著异常的实验室值或病症(例如心血管、肺、胃肠道、肝、肾、神经、肌肉骨骼、内分泌、代谢、精神、身体损伤或肺移植)，从而可能干扰治疗或评估、影响研究结果。
43.2.对细菌的冻干溶解产物过敏的患者。
44.3.有自身免疫性疾病的患者。
45.4.3个月内曾接受过免疫抑制剂或免疫调节治疗(如胸腺肽、干扰素、匹多莫德等)的患者。
46.5.在拟入组前6周内出现需要住院或额外抗生素疗程的呼吸系统恶化者。
47.6.在拟入组前3个月内参加过任何其他介入性临床研究并接受过任何其他在研药物治疗者。
48.7.拟入组时为孕妇、哺乳期妇女者。
49.8.研究者认为不适合参加研究的其他情况。
50.1.3病例数及分组方法
51.本研究系回顾性研究，在取得伦理委员会批准同意后，将根据入排标准筛选并随机回顾性收集2022年1月至2023年3月间就诊于复旦大学附属中山医院呼吸与危重症医学科的患者数据。在14个月期间，共收集到103例符合入排标准的患者数据。(见图1)
52.(1)治疗组：44例患者既往因辅助治疗而口服细菌的冻干溶解产物，经电话随访确认服药情况。
53.(2)空白对照组：59例患者未接受任何干预治疗，仅进行定期随访。
54.1.4签署知情同意书
55.经预留的联系方式，通过电话随访的形式联系受试者或受试者家属，为其解释、提供研究目的相关的信息和可能发生的后果，并尽可能邀请其回院签署知情同意书。如联系到受试者，但受试者不愿回院签署书面知情同意书，则在进行电话知情，获得口头同意后，使用其样本或数据；三次及以上联系不到受试者，方可使用其样本或数据。以上过程将全程保存记录。
56.1.5数据收集
57.(1)基本信息
58.此部分信息将直接在复旦大学附属中山医院病历系统中采集。包括：性别、年龄、住院号、医技号、住址、邮政编码。
59.(2)既往史
60.此部分信息将直接在复旦大学附属中山医院病历系统中采集。包括：发现肺结节
年限、呼吸系统既往病史、是否有手术史、既往病史、合并症。
61.(3)个人史
62.此部分信息将在电话随访中询问受试者后收集。包括：吸烟史、饮酒史、住地100米之内有无高架桥或高速公路、住地离最近交通主干道的距离、住地有无室内装修、是否做饭、使用什么燃料做饭、如需要取暖，如何供暖、饮用水来源、家或工作单位附近有无污染相关企业。
63.(4)生化指标
64.此部分信息将直接在复旦大学附属中山医院病历系统中采集。包括：化验是否有肺癌七种自身抗体，免疫细胞百分比。若患者在治疗期间未做上述指标检测，则记为“未检”。
65.(5)合并用药和治疗
66.允许合并使用支持、对症治疗。研究过程中，任何合并用药或治疗方式都应准确地记录到病例报告表中，记录内容包括药物名称(治疗方法)、起止日期、用法用量等。
67.(6)影像学数据
68.此部分信息将直接在复旦大学附属中山医院病历系统中采集。接受泛福舒治疗的患者需采集用药前的基线胸部ct影像记录，以及治疗后随访的胸部ct影像记录(随访周期由临床医生评估病情个体化制定)，并且两次胸部ct影像的拍摄时间应当都在2022年1月至2023年3月之间；对照组患者需采集2022年1月至2023年3月之间的两次肺结节随访胸部ct影像记录。将患者的基线及随访ct数据分别上传至独立服务器进行半自动化ai读片分析，输出目标肺结节的直径、密度、距离胸膜距离，并提供发展为肺癌的风险评分(范围从0到100％)和诊断声明。
69.1.6终点指标
70.1.主要终点：ai软件评定下，从基线到随访日患者肺结节的风险概率改变。
71.2.次要终点：ai软件评定下，从基线到随访日患者肺结节的直径、体积、密度大小改变。
72.1.7统计分析
73.1.7.1样本含量估计
74.目前尚未有过大规模回顾性研究报道肺小结节患者结节未经治疗自发缩小的数据报告，根据临床医生的经验性评价，估算结节未经治疗自发缩小概率为10％；假设使用泛福舒后慢性支气管炎合并肺小结节患者的结节缩小率为50％。经统计分析，预计纳入63名受试者，其中21名为接受泛福舒规范治疗慢性支气管炎的患者，42名为经临床常规治疗、未使用过泛福舒的患者。此样本量提供0.8的检验效能验证泛福舒规范治疗慢性支气管炎合并肺小结节患者，随访时其肺部结节较基线有所缩小的概率非劣效于50％。(α＝0.05,1-β＝0.8,双侧)
75.样本含量估计与效能分别使用以下公式计算：
76.[0077][0078][0079]
na＝κnb[0080]
δ：容许误差；
[0081]
α：i类错误的最大概率，本例取值0.05；
[0082]
β：ii类错误的最大概率，本例取值0.2；
[0083]
z：z值，即标准分数；
[0084]
pa：对照组结节缩小率，本例取0.1；
[0085]
pb：治疗组结节缩小率，本例取0.5；
[0086]
κ：对照组样本量与治疗组样本量的比值，本例取2；
[0087]
na：对照组样本量；
[0088]
nb：治疗组样本量。
[0089]
1.7.2研究数据的统计与分析
[0090]
所有分析均将使用spss软件20.0版进行。配对student检验将被用于比较定量数据；mann-whitney u检验通过分析受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic，roc)比较不同类型肺结节患者的临床表现差异及对临床诊断的判断效力。在所有统计学分析中，设定当p《0.05时，具有统计学意义。
[0091]
1.8研究相关伦理学
[0092]
1.8.1伦理委员会审核
[0093]
本方案和书面知情同意书及与受试者直接相关的资料必须提交伦理委员会，获得伦理委员会书面批准后方可正式开展研究。研究者必须至少每年(如果适用)向伦理委员会提交研究年度报告。在研究中止和/或完成时，研究者必须书面通知伦理委员会；研究者必须及时向伦理委员会报告所有研究工作中发生的变化(如方案和/或知情同意书修订)，并且在未获得伦理委员会批准之前不得执行这些变动，除非是为了消除对受试者明显且直接的风险而做出的变更。在发生这类情况时，将通知伦理委员会。
[0094]
1.8.2书面知情同意
[0095]
本发明获伦理批准后，在使用受试者数据或样本前，将通过电话随访的形式联系受试者或受试者家属，为其解释、提供研究目的相关的信息和可能发生的后果，并尽可能邀请其回院签署知情同意书。知情同意书应作为临床试验的重要文档保留备查。如联系到受试者，但受试者不愿回院签署书面知情同意书，则在进行电话知情，获得口头同意后，使用其样本或数据；三次及以上联系不到受试者，方可使用其样本或数据以上过程将全程保存记录，对于联系不上的人群依据卫计委《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》第三十八条和三十九条，利用可识别身份信息的人体材料或者数据进行研究，已无法找到该受试者，且研究发明不涉及个人隐私和商业利益的，可以免除签署同意书。
[0096]
1.8.3保密措施
[0097]
通过本发明研究的结果可能会在医学杂志上发表，但是参与研究受试者的个人信
[0109]
表2参考recist标准所测量的患者随访时目标结节反应，分析对照组与治疗组，表内显示的患者的单独观察随访期超过6个月。pd：临床进展，dcr：疾病控制率。
[0110] 对照组(n＝31)治疗组(n＝12)p值直径改变,％(sem)2.48(4.56)2.83(4.10)0.412体积改变,％(sem)6.94(8.62)1.42(2.88)0.023密度改变,％(sem)-3.13(1.69)5.17(4.46)0.134风险概率改变,％(sem)-2.48(2.97)-8.67(5.14)0.648

技术特征：
1.细菌的冻干溶解产物在制备治疗肺结节的药物中的应用，所述的细菌为流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷白菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌的组合。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的细菌的冻干溶解产物的制备方法为：以流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷白菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌为原料，经发酵扩增、灭菌浓缩、脱毒破壁，提取细菌的细胞壁、细胞膜和荚膜，获得细菌的冻干溶解产物。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的细菌的冻干溶解产物来自瑞士欧姆制药有限公司，其商品为泛福舒，注册证号为s20150041。

技术总结
本发明提供了细菌的冻干溶解产物在制备治疗肺结节的药物中的应用，所述的细菌为流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷白菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌的组合。所述的细菌的冻干溶解产物的制备方法为：以流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷白菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌为原料，经发酵扩增、灭菌浓缩、脱毒破壁，提取细菌的细胞壁、细胞膜和荚膜，获得细菌的冻干溶解产物。本发明明确了口服细菌的冻干溶解产物对高危肺结节具有抑制侵袭与恶变的作用。物对高危肺结节具有抑制侵袭与恶变的作用。物对高危肺结节具有抑制侵袭与恶变的作用。


技术研发人员：宋元林 杨达伟 倪雨清 张勇 尹俊 周建 童琳 刘洁 闫宇 田昊 孙梦婷
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/7/21