一种卟啉连香豆素衍生物及其制备方法和用途

1.本发明涉及药物化学领域，具体地涉及一类卟啉连香豆素衍生物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.光动力疗法(pdt)早在100多年前就已被发现，并已成为治疗癌症和包括感染在内的各种非恶性疾病的一种被广泛研究的疗法。到目前为止，此疗法已成功地用于治疗多种恶性肿瘤。pdt的基本要素可分为：光敏剂(ps)、特定激发光、分子氧。光敏剂在适当能量的波长光进行照射，形成激发单重态，然后转变为长寿命的激发三重态。这种三重态可以在氧气存在的情况下发生光化学反应，将能量传递给周围氧分子，形成活性氧(ros)，从而杀伤癌细胞、病原微生物和不需要的组织。同手术、放射治疗和药物治疗等更传统的癌症疗法相比，pdt具有非侵入性，副作用小等优点，在肿瘤治疗研究领域颇具吸引力。
3.随着pdt的发展，制备光敏剂，特别是卟啉类光敏剂是研究取得了令人瞩目的进展。大多数用于癌症治疗的光敏剂都具有以卟啉为基础的大环骨架，卟啉类化合物在光动力学研究中的主要优点包括：1)芳香族化合物的稳定性；2)对可见光的有效吸收；3)活性氧产率高；4)易于官能化修饰和结构多样性；5)三重态寿命较长和暗毒性较低。美国fda批准的第一个上市的光敏药物photofri就是经典的卟啉结构药物。
4.li等(chinese chemical letters,2007,18(11):1331-1334)设计合成了一种基于卟啉和5-氟尿嘧啶的新型潜在靶向抗癌药物，并采用mtt法对人肝癌细胞smcc-7721的体外抗癌活性进行了评价。初步结果表明，耦合物的抗癌活性均达5-氟尿嘧啶抗癌活性的2倍以上。卟啉在无光照条件下对肿瘤细胞无杀伤作用，表明耦合物实际上是提高了5-氟尿嘧啶对肿瘤组织的靶向性，从而增强了抗癌活性。s.weimin等(bioorg med chem,2008,16(10):5665-5671)将5-氟尿酸/boc-l-苯丙氨酸与氨基卟啉偶联，合成了一系列含5-氟尿嘧啶/l-苯丙氨酸的卟啉类化合物。体外抗癌活性研究结果表明，5-氟尿嘧啶和l-苯丙氨酸的引入能显著提高卟啉的光毒性。卟啉类化合物对肿瘤组织的高度选择性，为抗癌药物键连卟啉类化合物的研究拓宽了前景。
5.本发明人前期对卟啉类化合物已经进行了大量的研究，例如将卟啉与白杨素、氨基酸进行键连，合成了一系列具有良好抗癌活性的新型pdt类化合物，但前期工作主要集中在卟啉键连抗癌活性药物来增强药物抗肿瘤活性这一方面，对如何提高卟啉类化合物的1o2产生能力来增强抗肿瘤活性的相关研究甚少。
6.香豆素类因具有抗癌潜力引起了人们的广泛关注。它们的结构从简单的单取代、双取代香豆素到呋喃、吡喃香豆素衍生物，这类化合物可以抑制不同类型的癌细胞。从几种ferula sp.中分离得到的伞形花青素能诱导肺癌细胞凋亡，而从ferula diversivittataregel&schmalh.中分离到的分歧素和从seseli libanotis subsp.中分离到的7-异戊烯氧基香豆素对膀胱癌有细胞毒性作用。geiparvarin是从geijeraparviflora lindl.中分离得到的一种香豆素衍生物，能够靶向微管蛋白并改变微管组织，以及从
erythrina variegata l.中分离得到的花青素对胃癌细胞具有抗增殖活性。诸多香豆素类化合物的抗癌活性表明，香豆素在癌症治疗研究领域具有广阔的前景。
7.fan cheng等(j.phys.chem.b 2018,122,7797-7810)报道了一种香豆素连卟啉衍生物然而该化合物对肿瘤细胞具有低毒性，难以用作抗癌试剂。
8.带有卟啉结构的化合物是一类非常具有研究前景的抗肿瘤潜在药物，从本身结构，单线态氧生成能力以及肿瘤定位，抗肿瘤机制上，科学家们都已对其作了深入的研究并还在积极开发中；而香豆素作为一种天然的黄酮类活性物质，其活性作用广泛，其抗肿瘤细胞增殖方面值得深入探索。本发明将卟啉和香豆素通过适当的方法进行有效的结合，制备得到了一类新型卟啉连香豆素衍生物。该化合物能够在卟啉肿瘤靶向性和光动力效应的基础上，发挥7-羟基香豆素的抗肿瘤活性；同时利用7-羟基香豆素优异的光敏特性，将其吸收的能量转移给卟啉，以提高卟啉的1o2产生能力，最终增强化合物的抗肿瘤效果，为抗肿瘤药物的研究提供一个新的方向。


技术实现要素：

9.本发明所要解决的技术问题是：提供了一种卟啉连香豆素衍生物，该化合物能够在卟啉肿瘤靶向性和光动力效应的基础上，发挥7-羟基香豆素的抗肿瘤活性；同时利用7-羟基香豆素优异的光敏特性，将其吸收的能量转移给卟啉，以提高卟啉的1o2产生能力，最终增强化合物的抗肿瘤效果。
10.本发明的第一个方面，是提供一种式i或式ii所示化合物及其药学上可接受的盐，其具有如下结构：
[0011][0012]
其中，n选自1-8的整数；
[0013]
r选自h，卤素，羟基，硝基，cn，c1-6烷基，c2-c6烯基，c2-c6炔基，c6-10芳基，c2-c10杂芳基；
[0014]
r’选自h，卤素，羟基，硝基，cn，c1-6烷基，c2-c6烯基，c2-c6炔基；
[0015]
m选自zn，ni，mn。
[0016]
优选地，n选自1、2、3、4或5。
[0017]
优选地，r选自h，卤素，羟基，硝基，cn，c1-6烷基；更优选地，r选自h或cl；
[0018]
优选地，r’选自h，卤素，羟基，硝基，cn，c1-6烷基；更优选地，r选自h或甲基；
[0019]
优选地，m选自zn。
[0020]
本发明的另一方面提供一种制备式i化合物的方法，其合成路线如下：
[0021][0022]
其中，n、r、r’的定义如前所述。
[0023]
具体反应步骤如下：
[0024]
在有机溶剂中，加入碱和卟啉1，加热搅拌，将香豆素衍生物2加入反应体系，直至反应完毕，经后处理得到式i的卟啉连香豆素衍生物。
[0025]
优选地，卟啉衍生物1与香豆素衍生物2的摩尔比为：1:(1-1.5)，优选为1:1-1.2，更优选为1:1.2
[0026]
所述碱选自氢氧化钾、三乙胺或碳酸钾，更优选为三乙胺。
[0027]
本发明的另一方面提供一种制备式ii化合物的方法，其合成路线如下：
[0028][0029]
其中，n、r、r’和m的定义如前所述。
[0030]
具体反应步骤如下：
[0031]
将式i化合物用有机溶剂溶解，加入m金属盐，回流反应，tlc监控至反应完全，经后处理得到式ii的卟啉连香豆素衍生物。
[0032]
优选地，式i化合物与m金属盐的摩尔比为：1:3-7，优选为1:5。
[0033]
本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含式i或式ii所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂。
[0034]
本发明另一方面涉及一种式i或式ii化合物及其药学上可接受的盐或包含其药物组合物在制备抗癌药物中的用途；
[0035]
优选地，所述癌症选自肺癌或肝癌；尤其是，人非小细胞肺癌细胞a549和人肝癌细胞hepg2。
[0036]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0037]
(1)本发明提供了一类新的具有抗癌活性的卟啉连香豆素衍生物，拓宽了现有抗癌化合物的范围，可作为先导化合物继续优化；
[0038]
(2)本发明化合物以卟啉分子为载体，利用其肿瘤组织聚集的效应，对肿瘤细胞具有靶向性，减少了对正常细胞的灭杀副作用。
[0039]
(3)本发明的卟啉连香豆素类化合物可以实现光疗和化疗的协同治疗，除此之外，在卟啉中插入金属zn也能够增强化合物的抗肿瘤活性。
附图说明
[0040]
图1化合物4a-4e实验组和对照组的荧光强度随光照时间的变化趋势图。
[0041]
图2化合物4f-4j实验组和对照组的荧光强度随光照时间的变化趋势图。
[0042]
图3化合物5a-5e实验组和对照组的荧光强度随光照时间的变化趋势图。
[0043]
图4化合物5a-5e实验组和对照组的荧光强度随光照时间的变化趋势图。
具体实施方式
[0044]
下面通过实施例来具体说明本发明的内容。在本发明中，以下实施例是为了更好
地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]
实施例1卟啉1、2的合成
[0046][0047]
将20ml吡咯加入到50ml圆底烧瓶中，搭好装置(直形冷凝管、温度计)，分别用毛巾和锡箔纸进行保温、避光，140℃冷凝回流，去掉沸点前馏分，收集新蒸吡咯。将2.44g对羟基苯甲醛和6.12ml苯甲醛加至250ml三颈烧瓶中，加入120ml丙酸溶解，135℃冷凝回流30min。5.5ml新蒸吡咯用等体积丙酸混匀后加入恒压分液漏斗中，缓慢加至反应体系中，20min滴完，继续冷凝回流1h，反应结束。加入60ml无水乙醇，4℃冰箱中存放24h，析出蓝紫色颗粒状固体。减压抽滤，干燥，得粗产品。选择展开剂(二氯甲烷：正己烷＝3:1)柱层析纯化，收集第二条色带，减压旋蒸出溶剂，得蓝紫色晶体，即卟啉1。1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.89
–
8.83(m,8h),8.25
–
8.21(m,6h),8.06(d,j＝8.3hz,2h),7.80
–
7.73(m,9h),7.16(d,j＝8.3hz,2h),-2.76(s,2h)ppm.
[0048]
将2.4g对羟基苯甲醛和8.4g对氯苯甲醛加至250ml三颈烧瓶中，加入120ml丙酸溶解，135℃冷凝回流30min。5.5ml吡咯用等体积丙酸混匀后加入恒压分液漏斗中，缓慢加至反应体系中，20min滴完，继续冷凝回流1h，反应结束。加入60ml无水乙醇，4℃冰箱中存放24h，析出蓝紫色颗粒状固体。减压抽滤，干燥，得粗产品。用二氯甲烷柱层析纯化，收集第二条色带，减压旋蒸出溶剂，得蓝紫色晶体，即卟啉2。1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ8.92
–
8.81(m,8h),8.14(d,j＝7.8hz,6h),8.06(d,j＝8.0hz,2h),7.75(d,j＝7.8hz,6h),7.22(d,j＝8.0hz,2h),-2.84(s,2h)ppm.
[0049]
实施例2香豆素衍生物3a-3e的合成
[0050][0051]
准确称取500mg 7-羟基香豆素、2142mg k2co3于150ml三颈烧瓶中，用60ml丙酮作为溶剂，于60℃条件下冷凝回流20min。向反应体系中缓慢加入685μl溴乙酸乙酯，继续反应1.5h，冷却，抽滤，收集滤液，减压旋干得黄色固体。将上一步产物用60ml甲醇溶解至150ml三颈烧瓶中，向反应体系中加入12.5ml 1mol/l koh溶液，60℃条件下冷凝回流1h，结束反应。用10％hcl溶液调节ph＝2-3，减压旋蒸出甲醇，析出白色固体，4℃冰箱中存放3h，抽滤，蒸馏水洗涤3次，干燥即得化合物3a。
[0052][0053]
产率:95％.1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ13.15(s,1h),8.00(d,j＝9.5hz,1h),7.64(d,j＝8.3hz,1h),6.98
–
6.94(m,2h),6.31(d,j＝9.4hz,1h),4.84(s,2h)ppm.
[0054]
准确称取500mg 7-羟基香豆素、2142mg k2co3和515mg ki于150ml三颈烧瓶中，用60ml丙酮作为溶剂，于60℃条件下冷凝回流20min。向反应体系中缓慢加入794μl 2-溴丙酸乙酯，继续反应3.5h，冷却，抽滤，收集滤液，减压旋干得黄色固体。将上一步产物用60ml甲醇溶解至150ml三颈烧瓶中，向反应体系中加入12.5ml 1mol/l koh溶液，60℃条件下冷凝回流3h，结束反应。用10％hcl溶液调节ph＝2-3，减压旋蒸出甲醇，析出白色固体，4℃冰箱中存放3h，抽滤，蒸馏水洗涤3次，干燥即得化合物3b。
[0055][0056]
产率:93％.1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.01(d,j＝9.6hz,1h),7.66(d,j＝8.6hz,1h),6.98
–
6.87(m,2h),6.33(d,j＝9.5hz,1h),5.08(q,j＝6.8hz,1h),1.57(d,j＝6.7hz,3h)ppm.
[0057]
准确称取500mg 7-羟基香豆素、2142mg k2co3和515mg ki于150ml三颈烧瓶中，用60ml丙酮作为溶剂，于60℃条件下冷凝回流20min。向反应体系中缓慢加入887μl 4-溴丁酸乙酯，继续反应6.5h，冷却，抽滤，收集滤液，减压旋干得黄色固体。将上一步产物用60ml甲醇溶解至150ml三颈烧瓶中，向反应体系中加入12.5ml 1mol/l koh溶液，60℃条件下冷凝回流5h，结束反应。用10％hcl溶液调节ph＝2-3，减压旋蒸出甲醇，析出白色固体，4℃冰箱中存放3h，抽滤，蒸馏水洗涤3次，干燥即得化合物3c。
[0058][0059]
产率:93％.1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.01(d,j＝9.5hz,1h),7.65(d,j＝8.6hz,1h),7.03
–
6.95(m,2h),6.31(d,j＝9.5hz,1h),4.13(t,j＝6.5hz,2h),2.43(t,j＝7.3hz,2h),2.00(p,j＝7.0hz,2h)ppm.
[0060]
准确称取500mg 7-羟基香豆素、2142mg k2co3和515mg ki于150ml三颈烧瓶中，用60ml丙酮作为溶剂，于60℃条件下冷凝回流20min。向反应体系中缓慢加入981μl 5-溴戊酸乙酯，继续反应10.5h，冷却，抽滤，收集滤液，减压旋干得黄色固体。将上一步产物用60ml甲醇溶解至150ml三颈烧瓶中，向反应体系中加入12.5ml 1mol/l koh溶液，60℃条件下冷凝回流7h，结束反应。用10％hcl溶液调节ph＝2-3，减压旋蒸出甲醇，析出白色固体，4℃冰箱中存放3h，抽滤，蒸馏水洗涤3次，干燥即得化合物3d。
[0061][0062]
产率:95％.1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.01(d,j＝9.4hz,1h),7.65(d,j＝8.5hz,1h),7.02
–
6.95(m,2h),6.31(d,j＝9.4hz,1h),4.11(t,j＝6.4hz,2h),2.33(t,j＝7.4hz,2h),1.81
–
1.76(m,2h),1.71
–
1.65(m,2h)ppm.
[0063]
准确称取500mg 7-羟基香豆素、2142mg k2co3和515mg ki于150ml三颈烧瓶中，用60ml丙酮作为溶剂，于60℃条件下冷凝回流20min。向反应体系中缓慢加入1.1ml 6-溴己酸乙酯，继续反应9h，冷却，抽滤，收集滤液，减压旋干得黄色固体。将上一步产物用60ml甲醇溶解至150ml三颈烧瓶中，向反应体系中加入12.5ml 1mol/l koh溶液，60℃条件下冷凝回流5h，结束反应。用10％hcl溶液调节ph＝2-3，减压旋蒸出甲醇，析出白色固体，4℃冰箱中存放3h，抽滤，蒸馏水洗涤3次，干燥即得化合物3e。
[0064][0065]
产率:94％.1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.01(d,j＝9.5hz,1h),7.64(d,j＝8.5hz,
1h),7.03
–
6.93(m,2h),6.31(d,j＝9.5hz,1h),4.09(t,j＝6.5hz,2h),2.27(t,j＝7.3hz,2h),1.79
–
1.73(m,2h),1.63
–
1.57(m,2h),1.48
–
1.42(m,2h)ppm。
[0066]
实施例3卟啉连香豆素衍生物的合成
[0067][0068]
称取200mg香豆素衍生物3a/3b/3c/3d/3e于50ml圆底烧瓶中，25ml二氯甲烷作为溶剂，加入3滴dmf，6～9滴氯化亚砜，40℃条件下冷凝回流反应5h(溶液澄清)，减压旋蒸除去溶剂，加入5ml二氯甲烷重新溶解。预先将430μl三乙胺和180mg卟啉1/200mg卟啉2加至150ml三颈烧瓶中，60ml二氯甲烷作为溶剂，40℃冷凝回流反应30min。将酰氯化后的香豆素衍生物缓慢加入反应体系，40℃反应45min，停止反应，减压旋干，选择展开剂(二氯甲烷：丙酮＝250:1)柱层析纯化，收集第二条色带，减压旋蒸出溶剂，得蓝紫色晶体，即化合物4a-4e、5a-5e。将上一步产物用60ml二氯甲烷溶解于150ml三颈烧瓶中，加入5倍当量的二水合醋酸锌，40℃条件下冷凝回流，tlc点板监控至反应完全。停止反应，加入100ml去离子水于反应液中，水洗除去多余的金属盐，有机层用无水na2so4干燥，减压旋干，得亮紫色晶体，即化合物4f-4j、5f-5j。
[0069]
相应的化合物的收率及表征数据如下：
[0070][0071]
产率:88％,纯度:98.8％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.86(s,8h),8.26
–
8.21(m,8h),7.81
–
7.74(m,9h),7.65(d,j＝9.5hz,1h),7.55(d,j＝7.7hz,2h),7.46(d,j＝8.5hz,1h),7.07
–
6.98(m,2h),6.32(d,j＝9.4hz,1h),5.13(s,2h),-2.79(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
55h36
n4o
5+
832.27[m+h]
+
,found833.3969.
[0072][0073]
产率:92％,纯度:92.1％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.89
–
8.83(m,8h),8.25
–
8.20(m,8h),7.80
–
7.73(m,9h),7.63(d,j＝9.5hz,1h),7.49(d,j＝7.9hz,2h),7.44(d,j＝8.3hz,1h),7.06
–
7.00(m,2h),6.30(d,j＝9.4hz,1h),5.23(q,j＝6.9hz,1h),2.00(d,j＝6.9hz,3h),-2.79(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
56h38
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+
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[0074][0075]
产率:90％,纯度:97.6％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.85(d,j＝6.2hz,8h),8.25
–
8.20(m,8h),7.80
–
7.74(m,9h),7.65(d,j＝9.5hz,1h),7.51(d,j＝8.0hz,2h),7.41(d,j＝8.4hz,1h),6.96
–
6.90(m,2h),6.27(d,j＝9.5hz,1h),4.27(t,j＝6.0hz,2h),3.01(t,j＝7.2hz,2h),2.43(p,j＝6.6hz,2h),-2.79(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
57h40
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+
,found 861.3020.
[0076][0077]
产率:91％,纯度:98.3％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.86(d,j＝6.3hz,8h),8.25
–
8.19(m,8h),7.81
–
7.73(m,9h),7.64(d,j＝9.5hz,1h),7.50(d,j＝7.9hz,2h),7.39(d,j＝8.6hz,1h),6.93
–
6.86(m,2h),6.26(d,j＝9.4hz,1h),4.17(t,j＝5.6hz,2h),2.87(t,j＝6.8hz,2h),2.16
–
2.08(m,4h),-2.79(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
58h42
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+
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[0078][0079]
产率:89％,纯度:98.6％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.86(d,j＝6.2hz,8h),8.22(d,j＝7.1hz,8h),7.80
–
7.74(m,9h),7.61(d,j＝9.4hz,1h),7.50(d,j＝7.9hz,2h),7.36(d,j＝8.5hz,1h),6.90
–
6.84(m,2h),6.24(d,j＝9.4hz,1h),4.12(t,j＝6.4hz,2h),2.81(t,j＝7.4hz,2h),2.04
–
1.97(m,4h),1.78
–
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59h44
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+
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产率:98％,纯度:98.8％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.96
–
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–
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–
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–
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+
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[0082][0083]
产率:96％,纯度:98.4％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.96
–
8.92(m,8h),8.24
–
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–
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–
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–
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+
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产率:97％,纯度:98.9％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.96(d,j＝5.8hz,8h),8.25
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7.73(m,9h),7.65(d,j＝9.5hz,1h),7.50(d,j＝8.2hz,2h),7.41(d,j＝8.6hz,1h),6.95
–
6.89(m,2h),6.27(d,j＝9.5hz,1h),4.28(t,j＝6.1hz,2h),3.01(t,j＝7.3hz,2h),2.43(p,j＝7.0hz,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
57h38
n4o5zn
+
922.18[m+h]
+
,found 923.2227.
[0086][0087]
产率:97％,纯度:97.4％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.96(d,j＝5.9hz,8h),8.22(d,j＝7.1hz,8h),7.79
–
7.73(m,9h),7.64(d,j＝9.4hz,1h),7.49(d,j＝7.8hz,2h),7.40(d,j＝8.7hz,1h),6.93
–
6.85(m,2h),6.25(d,j＝9.5hz,1h),4.18(t,j＝4.8hz,2h),2.87(t,j＝6.2hz,2h),2.15
–
2.07(m,4h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
58h40
n4o5zn
+
936.18[m+h]
+
,found 937.2388.
[0088][0089]
产率:98％,纯度:99.4％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.88(d,j＝5.5hz,8h),8.15(d,j＝7.2hz,8h),7.73
–
7.67(m,9h),7.55(d,j＝9.5hz,1h),7.41(d,j＝8.0hz,2h),7.29(d,j＝8.6hz,1h),6.82
–
6.76(m,2h),6.16(d,j＝9.5hz,1h),4.05(t,j＝6.4hz,2h),2.74(t,j＝7.4hz,2h),1.96
–
1.90(m,4h),1.72
–
1.66(m,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
59h42
n4o5zn
+
950.18[m+h]
+
,found 951.2609.
[0090][0091]
产率:91％,纯度:91.5％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.84(s,8h),8.24(d,j＝7.4hz,2h),8.14(d,j＝7.0hz,6h),7.75(d,j＝6.8hz,6h),7.70(d,j＝9.2hz,1h),7.56(d,j＝6.8hz,2h),7.51(d,j＝8.9hz,1h),7.12
–
7.04(m,2h),6.34(d,j＝9.5hz,1h),5.15(s,2h),-2.87(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
55h33
cl3n4o
5+
934.15[m+h]
+
,found 935.1606.
[0092][0093]
产率:88％,纯度:99.2％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.84(s,8h),8.21(d,j＝6.9hz,2h),8.13(d,j＝7.8hz,6h),7.75(d,j＝7.1hz,6h),7.69(d,j＝9.7hz,1h),7.52
–
7.48(m,3h),7.08
–
7.01(m,2h),6.32(d,j＝9.6hz,1h),5.25(q,j＝6.9hz,1h),2.01(d,j＝6.5hz,3h),-2.88(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
56h35
cl3n4o
5+
948.17[m+h]
+
,found 949.1754.
[0094][0095]
产率:87％,纯度:96.8％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.83
–
8.75(m,8h),8.14(d,j＝7.9hz,2h),8.06(d,j＝7.8hz,6h),7.68(d,j＝7.7hz,6h),7.59(d,j＝9.4hz,1h),7.45(d,j＝7.9hz,2h),7.35(d,j＝8.4hz,1h),6.89
–
6.82(m,2h),6.21(d,j＝9.4hz,1h),4.21(t,j＝6.0hz,2h),2.94(t,j＝7.3hz,2h),2.36(p,j＝6.1hz,2h),-2.94(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
57h37
cl3n4o
5+
962.15[m+h]
+
,found 963.1927.
[0096][0097]
产率:90％,纯度:91.9％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.89
–
8.83(m,8h),8.21(d,j＝8.0hz,2h),8.14(d,j＝7.8hz,6h),7.75(d,j＝7.8hz,6h),7.65(d,j＝9.7hz,1h),7.51(d,j＝7.7hz,2h),7.40(d,j＝8.5hz,1h),6.93
–
6.87(m,2h),6.26(d,j＝9.5hz,1h),4.18(t,j＝5.6hz,2h),2.88(t,j＝6.8hz,2h),2.16
–
2.07(m,4h),-2.86(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
58h39
cl3n4o
5+
976.15[m+h]
+
,found 977.2055.
[0098][0099]
产率:88％,纯度:90.6％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.89
–
8.83(m,8h),8.21(d,j＝8.1hz,2h),8.14(d,j＝7.9hz,6h),7.75(d,j＝8.0hz,6h),7.63(d,j＝9.5hz,1h),7.50(d,j＝8.0hz,2h),7.38(d,j＝8.5hz,1h),6.91
–
6.83(m,2h),6.25(d,j＝9.6hz,1h),4.12(t,j＝6.3hz,2h),2.82(t,j＝7.4hz,2h),2.04
–
1.97(m,4h),1.80
–
1.73(m,2h),-2.86(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
59h41
cl3n4o
5+
990.15[m+h]
+
,found 991.2203.
[0100][0101]
产率:97％,纯度:95.4％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.98
–
8.92(m,8h),8.23(d,j＝8.1hz,2h),8.14(d,j＝7.9hz,6h),7.75(d,j＝7.8hz,6h),7.70(d,j＝9.5hz,1h),7.56(d,j＝8.2hz,2h),7.51(d,j＝8.7hz,1h),7.09
–
7.01(m,2h),6.33(d,j＝9.6hz,1h),5.15(s,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
55h31
cl3n4o5zn
+
996.07[m+h]
+
,found 997.4057.
[0102][0103]
产率:96％,纯度:98.2％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.96
–
8.92(m,8h),8.21(d,j＝8.2hz,2h),8.13(d,j＝6.8hz,6h),7.74(d,j＝7.8hz,6h),7.69(d,j＝9.8hz,1h),7.52
–
7.48(m,3h),7.08
–
7.02(m,2h),6.31(d,j＝9.4hz,1h),5.25(q,j＝7.0hz,1h),2.01(d,j＝7.1hz,3h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
56h33
cl3n4o5zn
+
1010.08[m+h]
+
,found 1011.0514.
[0104][0105]
产率:97％,纯度:97.5％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.99
–
8.93(m,8h),8.22(d,j＝7.9hz,2h),8.14(d,j＝7.9hz,6h),7.75(d,j＝7.8hz,6h),7.66(d,j＝9.5hz,1h),7.51(d,j＝8.0hz,2h),7.42(d,j＝8.5hz,1h),6.96
–
6.90(m,2h),6.27(d,j＝9.5hz,1h),4.28(t,j＝6.1hz,2h),3.01(t,j＝7.3hz,2h),2.44(p,j＝6.4hz,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
57h35
cl3n4o5zn
+
1024.07[m+h]
+
,found 1025.0914.
[0106][0107]
产率:98％,纯度:95.1％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ9.01
–
8.91(m,8h),8.21(d,j＝8.0hz,2h),8.14(d,j＝8.0hz,6h),7.75(d,j＝8.0hz,6h),7.65(d,j＝9.5hz,1h),7.50(d,j＝7.9hz,2h),7.40(d,j＝8.6hz,1h),6.93
–
6.86(m,2h),6.25(d,j＝9.4hz,1h),4.18(t,j＝5.6hz,2h),2.87(t,j＝6.9hz,2h),2.16
–
2.07(m,4h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
58h37
cl3n4o5zn
+
1038.07[m+h]
+
,found1039.1195.
[0108][0109]
产率:98％,纯度:95.3％.1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ9.01
–
8.01(m,8h),8.21(d,j＝8.2hz,2h),8.14(d,j＝7.9hz,6h),7.75(d,j＝7.9hz,6h),7.63(d,j＝9.6hz,1h),7.50(d,j＝8.0hz,2h),7.38(d,j＝8.1hz,1h),6.91
–
6.83(m,2h),6.24(d,j＝9.5hz,1h),4.13(t,j＝6.4hz,2h),2.82(t,j＝7.4hz,2h),2.04
–
1.98(m,4h),1.80
–
1.74(m,2h)ppm.hrms-esi:m/z calcd for c
59h39
cl3n4o5zn
+
1052.07[m+h]
+
,found 1053.1342.
[0110]
实施例4单线态氧检测实验
[0111]
光敏剂在适当能量的波长光照射下，形成激发单重态，然后转变为长寿命的激发三重态，这种三重态可以在氧气存在的情况下发生光化学反应，将能量传递给周围氧分子，产生1o2，进而杀伤癌细胞、病原微生物和不需要的组织。为了验证本发明的化合物是否能够作为光敏剂应用于光动力治疗，特此检测了化合物的1o2产生能力。1，3-二苯基异苯并呋喃
(dpbf)是一种常用的1o2捕获剂，对1o2具有高度特异性。dpbf本身在463nm处有较强的荧光，与1o2反应生成更加稳定的邻二苯基甲酰基苯，dpbf自身荧光发生猝灭。因此通过检测dpbf在463nm处的荧光强度变化即可间接测出化合物的1o2产生能力。
[0112]
用电子分析天平精确称取dpbf和待测化合物各10μmol，用三氯甲烷分别溶解至1ml，稀释成20μmol/l的dpbf溶液和8μmol/l的待测样品溶液。将dpbf溶液和待测样品溶液等体积混合，418nm波长光照射10s后测定其荧光强度，同一待测样品溶液重复进行5次实验。设置10μmol/l的dpbf溶液组(空白组)，相同条件下测定其荧光强度。激发波长：418nm；波长扫描范围：200-800nm；扫描速度：1200nm/min。待测化合物在463nm处均无荧光。
[0113]
dpbf在418nm光照条件下其荧光强度会出现轻微的下降；7-羟基香豆素的存在会造成dpbf荧光强度有一定幅度的降低；卟啉1和卟啉2的存在使dpbf的荧光强度急剧下降。化合物4a-4j、5a-5j对dpbf的荧光强度的影响更为显著。在光照射时间为10s的情况下，dpbf的荧光强度均下降到200左右；在光照射时间为30s时，dpbf的荧光几乎消失。
[0114]
结果表明dpbf在418nm的光照条件下会发生轻微的分解，致使荧光强度出现轻微的下降。卟啉1和卟啉2能够使dpbf的荧光强度显著降低，这归因于卟啉能够产生1o2。7-羟基香豆素在光照条件下对dpbf有一定程度的影响，可能是7-羟基香豆素在418nm光照条件下也能够产生1o2，从而使dpbf的荧光强度降低。将卟啉和7-羟基香豆素进行连接后，1o2的产率得到提升，使dpbf的荧光强度下降的更快。出现这种情况的原因可能有两种：第一，卟啉和香豆素在418nm光照条件下都能够产生1o2，最终使的1o2产率升高；第二，香豆素能够在光照时吸收光能并传递给卟啉，最终提高化合物的1o2产生效率。因此，将卟啉和香豆素进行连接，能够发挥两者的光敏优势，最终提高1o2产生效率。
[0115]
实施例4mtt比色法检测体外抗肿瘤细胞活性
[0116]
含双抗培养基的配制：胎牛血清和dmem培养基以1：10的比例进行混合，再加入1％青、链霉素(双抗)混合液配制而成。
[0117]
磷酸缓冲盐溶液(pbs)的配制：将pbs粉剂(0.01m，ph＝7.2-7.4)用蒸馏水溶解至2000ml，制得pbs溶液，用经过高压灭菌的玻璃瓶分装，再经过高压蒸汽灭菌后即可使用。
[0118]
mtt溶液的配制：称取mtt粉末250mg，用pbs溶解至50ml，将配制好的mtt溶液用0.22μm滤膜过滤，15ml的离心管进行分装，用锡箔纸避光处理后放入4℃冰箱保存待用。
[0119]
细胞复苏和培养：将冻存的人非小细胞肺癌细胞a549/人肝癌细胞hepg2从-80℃的冰箱中取出，放入37℃的温水中解冻。待冻存液溶解后，将冻存管转移到经紫外照射的超净工作台，用移液枪将细胞悬浮液转移到15ml的离心管中，离心后去掉上清液。往沉淀中加入2～3ml细胞培养基，用移液枪吹打，使细胞分散均匀。细胞培养瓶中加入3ml的培养基，将细胞悬浮液转移至培养瓶中，放入到37℃，5％co2的细胞培养箱中进行培养。显微镜下观察，细胞长满培养瓶，弃去培养基，加入2～3ml pbs清洗，1ml trypsin-edta消化30s，往培养瓶中加2ml培养基，用移液枪吹打，使细胞分散均匀。离心后去掉上清液，加入3ml的细胞培养基，混匀制成细胞悬浮液，分开加入到培养瓶中，细胞培养箱中进行培养。
[0120]
细胞接种：显微镜下观察，细胞长满培养瓶，弃去培养基，加入2～3ml pbs清洗，1ml trypsin-edta消化30s，往培养瓶中加2ml培养基，用移液枪吹打，使细胞分散均匀。离心后去掉上清液，加入3ml的细胞培养基，混匀制成细胞悬浮液。加样槽中加入13ml培养基，吸取200μl细胞悬浮液加入到加样槽中，排枪混匀。取出96孔板，四周每孔加入200μl pbs，
剩余孔均加入100μl细胞悬浮液，放入培养箱中培养24h。
[0121]
加药和od值的测定：取出96孔板，弃去培养基，化合物浓度设置为128μmol/l、64μmol/l、32μmol/l、16μmol/l，每个浓度设置三个复孔，每孔加入150μl含药培养基。另外设置空白对照组(纯培养基)和阴性对照组(含dmac培养基)，对照组均设置6个复孔。标记a板(光照组)、b板(黑暗组)，放入细胞培养箱中进行培养。36h后，取出a、b板，a板用近红外光照射10min，b板不光照。光照结束后，将a、b板每孔吸去20μl培养基，加入20μl新配制的mtt溶液，继续培养4h。取出a、b板，弃去培养基，每孔加入150μl dmso，摇床摇晃10min，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值(od值)。通过graphpad prism 6.0软件计算化合物的ic
50
值，每组实验平行进行三次。ic
50
＝平均值
±
标准偏差。
[0122][0123]
化合物抗肿瘤细胞活性数据
[0124]
[0125][0126]“n.d”未得出有效数据。
[0127]
由上表可知，合成的20个卟啉-香豆素类化合物在有无光照条件下对a549细胞和hepg2细胞表现出不同的抑制作用。在光照条件下，该类化合物对肿瘤细胞都有一定的抑制作用。这是因为卟啉类化合物在光照条件下能够产生1o2对肿瘤细胞起到杀伤作用。在黑暗条件下，较短烷烃链的化合物(4a、4f、5a、5f)有一定的抗肿瘤活性。支链和烷烃链的延长会降低化合物的活性，例如化合物4a》化合物4b(增加支链)，化合物4a》化合物4c》化合物4d(增长烷烃链)。活性数据表明，将香豆素接入卟啉能够增强化合物的抗肿瘤活性。原因可能有两点：第一，香豆素类化合物具有一定的抗癌作用，接入卟啉可以实现光疗和化疗的协同作用；第二，香豆素的接入能够增强卟啉的1o2产生效率，最终增强化合物的光疗效果。除此之外，在卟啉中插入金属zn也能够增强化合物的抗肿瘤活性。如在体外抗a549细胞增殖活性实验结果中，化合物4f和化合物5f表现出较好的活性。ic
50
值分别为59.08μmol/l和52.37μmol/l，均优于阳性对照药物5-fu(ic
50
＝80.86μmol/l)。

技术特征：
1.一种卟啉连香豆素衍生物及其药学上可接受的盐，其具有式i或式ii所示结构：其中，n选自1-8的整数；r选自h，卤素，羟基，硝基，cn，c1-6烷基，c2-c6烯基，c2-c6炔基，c6-10芳基，c2-c10杂芳基；r’选自h，卤素，羟基，硝基，cn，c1-6烷基，c2-c6烯基，c2-c6炔基；m选自zn，ni，mn。2.根据权利要求1所述的卟啉连香豆素衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于：n选自1、2、3、4或5。r选自h，卤素，羟基，硝基，cn，c1-6烷基；优选地，r选自h或cl；r’选自h，卤素，羟基，硝基，cn，c1-6烷基；优选地，r选自h或甲基；m选自zn。3.一种制备如权利要求1所述的式i化合物的方法，其反应路线如下：
其中，n、r、r’的定义如权利要求1所述。具体反应步骤如下：在有机溶剂中，加入碱和卟啉1，加热搅拌，将香豆素衍生物2加入反应体系，直至反应完毕，经后处理得到式i的卟啉连香豆素衍生物。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：卟啉衍生物1与香豆素衍生物2的摩尔比为：1:(1-1.5)；所述碱选自氢氧化钾、三乙胺或碳酸钾，更优选为三乙胺。。5.一种制备如权利要求1所述的式ii化合物的方法，其反应路线如下：
其中，n、r、r’和m的定义如权利要求1所述。具体反应步骤如下：将式i化合物用有机溶剂溶解，加入m金属盐，回流反应，tlc监控至反应完全，经后处理得到式ii的卟啉连香豆素衍生物。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：式i化合物与m金属盐的摩尔比为：1:3-7，优选为1:5。7.一种药物组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述卟啉连香豆素衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。8.权利要求1-2中任一项所述的卟啉连香豆素衍生物或其药学上可接受的盐或权利要求7所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。9.如权利要求8所述的用途，其中所述癌症选自肺癌或肝癌。。10.如权利要求8所述的用途，所述癌症为人非小细胞肺癌细胞a549和人肝癌细胞hepg2导致的癌症。

技术总结
本发明提供了一种卟啉连香豆素衍生物，该化合物能够在卟啉肿瘤靶向性和光动力效应的基础上，发挥7-羟基香豆素的抗肿瘤活性；同时利用7-羟基香豆素优异的光敏特性，将其吸收的能量转移给卟啉，以提高卟啉的1O2产生能力，最终增强化合物的抗肿瘤效果。终增强化合物的抗肿瘤效果。


技术研发人员：刘运美 田泽杰 刘振华 李辉 何军 彭俊梅
受保护的技术使用者：南华大学
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/7/21