利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法。


背景技术：

2.普鲁兰酶是一类重要的淀粉脱支酶，能专一性水解支链淀粉和普鲁兰多糖的糖苷键形成直链淀粉和麦芽三糖，能够协同糖化酶或淀粉酶提高葡萄糖或麦芽糖的含量，在淀粉加工业中有着重要的用途。此外，普鲁兰酶在饲料、纺织等行业，也有着巨大的市场和应用前景。
3.但是，如何获得高活性的普鲁兰酶是该应用领域发展的难题。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，能够保证发酵液中普鲁兰酶的高活性。
5.本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌接种到活化培养基中进行活化，得活化菌种培养液；将所述活化菌种培养液转入发酵培养基中，控制培养条件：温度36～38℃，ph为5.6～5.8，进行初级发酵，得初级发酵产物液；向所述初级发酵产物液中持续流加补料培养基，进行补料发酵，直至发酵液的ph升至5.9～6.1，停止补料并结束发酵，放罐，得普鲁兰酶产物液。
7.优选地，所述发酵培养基和所述补料培养基的组分均包含：葡萄糖、糖蜜、淀粉、玉米浆、尿素和硅油，且所述发酵培养基中葡萄糖、糖蜜的浓度低于所述补料培养基中葡萄糖、糖蜜的浓度，所述发酵培养基中其余组分的浓度高于所述补料培养基中相应组分的浓度。
8.优选地，所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖5wt％，糖蜜5wt％、淀粉5wt％，玉米浆3wt％，尿素2wt％，磷酸二氢铵0.6wt％，磷酸氢二钾0.3wt％，硅油0.02wt％，余量水。
9.优选地，所述补料培养基的组成包括：萄糖10wt％，糖蜜10wt％，玉米浆2wt％，尿素1wt％，磷酸二氢铵0.3wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硅油0.01wt％，余量水。
10.优选地，初级发酵控制培养条件：温度36～38℃，ph为5.6～5.8，转速400～800r/min，风量1～1.5vvm。
11.优选地，在初级发酵过程中，采用氨水调节ph为5.6～5.8。
12.优选地，所述活化培养基为lb培养基，组成包括：胰蛋白胨1wt％，酵母粉0.5wt％，氯化钠1wt％，余量水，ph为7.0。
13.优选地，所述初级发酵时长6h，所述补料发酵的时间为18～20h，补料过程维持残糖≤3.5％。
14.本发明还提供一种利用上述方法制备的普鲁兰酶发酵产物。其中，放罐测试所述
普鲁兰酶发酵产物的酶活达550u/ml。
15.与现有技术相比，本发明的核心优势在于：
16.本发明制备方法依靠可产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌种活化、初级发酵、补料发酵至特定ph环境结束的特定工艺条件，可以获得的酶活达550u/ml以上的含普鲁兰酶发酵液。本发明方法在发酵过程通过严格控制ph变化区间，来确认放罐终点，整体上既保证普鲁兰酶的高酶活，同时也为生产提供一种更有时效性的终点判别方法，有效控制发酵周期，也便于降低生产成本。
具体实施方式
17.本发明的技术构思在于提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，利用ph确定放罐终点，有效避免发酵产物液中普鲁兰酶酶活下降，保证从发酵液中获得较高活力的普鲁兰酶且有效控制发酵周期，便于降低生产成本。
18.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
19.其中，发酵液中普鲁兰酶的检测方法：参照gb 1886.174-2016食品安全国家标准食品添加剂食品工业用酶制剂中普鲁兰酶活力的测定方法。
20.实施例1
21.本实施例提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，包括如下步骤：
22.(1)种子活化：
23.将可产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌(市售)接入活化培养基中进行活化培养，得菌种培养液。
24.在本步骤中，活化培养基为lb培养基，包括如下重量百分比的各组分：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，以及余量水，ph7.0，121℃灭菌30min。
25.(2)初级发酵：
26.将步骤(1)中的菌种培养液接入发酵培养基中进液体深层发酵，得到含普鲁兰酶的发酵液。
27.在本步骤中，深层发酵的培养条件为：温度37℃，用氨水调控ph至5.75，转速600r/min，风量1～1.5vvm。
28.在本步骤中，发酵培养基包括如下重量百分比的各组分：葡萄糖5％，糖蜜5％、淀粉5％，玉米浆3％，尿素2％，磷酸二氢铵0.6％，磷酸氢二钾0.3％，硅油0.02％，以及余量为水。
29.(3)补料发酵：
30.发酵6h后，开始流加补料培养基，补料过程维持残糖≤3.5％，补料时间18h。
31.在本步骤中，补料培养基包括如下重量百分比的各组分：葡萄糖10％，糖蜜10％，玉米浆2％，尿素1％，磷酸二氢铵0.3％，磷酸氢二钾0.1％，硅油0.01％，以及余量为水。
32.(4)确定发酵终点：
33.发酵约24h，待ph上升至5.90时，停止补料并结束发酵。
34.此工艺下，发酵过程中普鲁兰酶的酶活持续增加，放罐测试发酵液中普鲁兰酶的酶活为：586u/ml。
35.实施例2
36.本实施例提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其方法步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：
37.(3)补料发酵：发酵6h后，开始流加补料培养基，补料过程维持残糖≤3.5％，补料时间19h。
38.(4)确定发酵终点：
39.发酵约25h，待ph上升至6.0时，停止补料并结束发酵。
40.此工艺下，发酵过程中普鲁兰酶的酶活持续增加，放罐测试发酵液中普鲁兰酶的酶活为：620u/ml。
41.实施例3
42.本实施例提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其方法步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：
43.(3)补料发酵：发酵6h后，开始流加补料培养基，补料过程维持残糖≤3.5％，补料时间20h。
44.(4)确定发酵终点：
45.发酵约26h，待ph上升至6.1时，停止补料并结束发酵。
46.此工艺下，发酵过程中普鲁兰酶的酶活持续增加，放罐测试发酵液中普鲁兰酶的酶活为：660u/ml。
47.对比例1
48.本对比例提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其方法步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：
49.(4)确定发酵终点：
50.发酵至ph上升至5.8时，停止补料并结束发酵。
51.此工艺下，放罐测试发酵液中普鲁兰酶的酶活为：424u/ml。
52.对比例2
53.本对比例提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其方法步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：
54.(3)补料发酵：发酵6h后，开始流加补料培养基，补料过程维持残糖≤3.5％，补料时间20h。
55.(4)确定发酵终点：
56.发酵至ph上升至6.2时，停止补料并结束发酵。
57.此工艺下，放罐测试发酵液中普鲁兰酶的酶活为：458u/ml。
58.对比例3
59.本对比例提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其方法步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：
60.(3)补料发酵：发酵6h后，开始流加补料培养基，补料过程维持残糖≤3.5％，补料时间20h。
61.(4)确定发酵终点：
62.发酵至ph上升至6.3时，停止补料并结束发酵。
63.此工艺下，放罐测试发酵液中普鲁兰酶的酶活为：237u/ml。
64.由上述试验例关于补料发酵以及发酵终点ph控制的探究结果可以看出：可产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌在采用含葡萄糖、糖蜜、玉米浆、尿素、硅油等组分的发酵体系中，控制初级发酵阶段和补料发酵阶段以及发酵终点ph范围对获取的发酵液中普鲁兰酶的酶活影响极大，结果仅在于ph为5.9～6.1的区间下，整体上才能保证放罐测试普鲁兰酶发酵产物的酶活达550u/ml以上。
65.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌接种到活化培养基中进行活化，得活化菌种培养液；将所述活化菌种培养液转入发酵培养基中，控制培养条件：温度36～38℃，ph为5.6～5.8，进行初级发酵，得初级发酵产物液；向所述初级发酵产物液中持续流加补料培养基，进行补料发酵，直至发酵液的ph升至5.9～6.1，停止补料并结束发酵，放罐，得普鲁兰酶产物液。2.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基和所述补料培养基的组分均包含：葡萄糖、糖蜜、淀粉、玉米浆、尿素和硅油。3.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖5wt％，糖蜜5wt％，淀粉5wt％，玉米浆3wt％，尿素2wt％，磷酸二氢铵0.6wt％，磷酸氢二钾0.3wt％，硅油0.02wt％，余量水。4.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其特征在于，所述补料培养基的组成包括：萄糖10wt％，糖蜜10wt％，玉米浆2wt％，尿素1wt％，磷酸二氢铵0.3wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硅油0.01wt％，余量水。5.根据权利要求1至4任一项所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其特征在于，控制培养条件：温度36～38℃，ph为5.6～5.8，转速400～800r/min，风量1～1.5vvm。6.根据权利要求5所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其特征在于，在初级发酵过程中，采用氨水调节ph为5.6～5.8。7.根据权利要求1至4任一项所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其特征在于，所述活化培养基为lb培养基，组成包括：胰蛋白胨1wt％，酵母粉0.5wt％，氯化钠1wt％，余量水，ph为7.0。8.根据权利要求1至4任一项所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，其特征在于，所述初级发酵时长6h，所述补料发酵的时间为18～20h，补料过程维持残糖≤3.5％。9.一种利用权利要求1至8任一项所述的方法制备的普鲁兰酶发酵产物。10.根据权利要求9所述的普鲁兰酶发酵产物，其特征在于，放罐测试所述普鲁兰酶发酵产物的酶活达550u/ml。

技术总结
本发明提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的方法，该制备方法依靠菌种活化工艺、初级发酵工艺、补料发酵工艺至特定pH环境结束，可以获得的酶活达550U/mL以上的含普鲁兰酶发酵液。本发明方法在发酵过程通过严格控制pH变化区间，来确认放罐终点，整体上既保证普鲁兰酶的高酶活，同时也为生产提供一种更有时效性的终点判别方法。时效性的终点判别方法。


技术研发人员：张立 张成杰 吴菡 张茜茜 詹羿扬 王启军 辜玲芳 王晓亮 张庆丽 袁志超
受保护的技术使用者：武汉新华扬生物股份有限公司
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/7/21