一种重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法及重组猪胃蛋白酶与流程

1.本公开涉及重组猪胃蛋白酶纯化技术领域，具体涉及一种重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法及重组猪胃蛋白酶。


背景技术：

2.胃蛋白酶是蛋白酶中的一种，广泛应用于医药、食品、轻工以及生物技术等各个领域。目前其主要来源于动物(如牛、羊、猪等)的胃组织，但是动物源胃蛋白酶存在较多问题，例如易容受动物脏器资源的限制；胃蛋白酶产量小、价格高，且酶活性低、质量不稳定；容易产生有害化学物质残留，例如动物组织的有毒有害因子。因此，以上因素限制了胃蛋白酶的广泛使用。通过基因工程方法，构建重组胃蛋白酶高产工程菌，是解决胃蛋白酶目前应用“瓶颈”的有效方法，该方法通过大规模发酵生产，可大大降低成本，并且纯化得到的酶产物残留少，纯度高，具有环保、不受原料限制等优点。
3.但是，目前依然缺少高效表达有活性的胃蛋白酶的工程菌，商品化的重组胃蛋白酶还很少，无法满足市场应用。
4.需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。


技术实现要素：

5.本公开的目的在于提供一种重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法及重组猪胃蛋白酶，进而至少在一定程度上克服由于相关技术的限制和缺陷而导致的在目前依然缺少高效表达有活性的胃蛋白酶的工程菌，商品化的重组胃蛋白酶还很少，无法满足市场应用的情况。
6.本公开的其他特性和优点将通过下面的详细描述变得显然，或部分地通过本公开的实践而习得。
7.根据本公开的第一方面，提供了一种重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，包括：
8.将具有载体的猪胃蛋白酶转化到大肠杆菌中表达，并将表达后的猪胃蛋白酶进行发酵离心处理，得到湿菌；
9.收获的湿菌经大肠杆菌裂解澄清试剂盒裂解、离心，获得沉淀；
10.洗涤沉淀，获得包涵体，包涵体变性后进一步复性，得到复性液；
11.复性液进一步在4℃透析过液，并将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化，得到纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原；
12.重组猪胃蛋白酶原进一步脱盐，获得纯度≥95％的重组猪胃蛋白酶。
13.进一步的，还包括：
14.对重组猪胃蛋白酶进行活性检测，将活性检测合格的重组猪胃蛋白酶进行分装并保存；其中，保存温度不高于-20℃。
15.进一步的，活性检测采用中国药典2020版胃蛋白酶活性检测方法测定重组猪胃蛋白酶活性。
16.进一步的，步骤洗涤沉淀，获得包涵体中，采用的洗涤液洗涤所述沉淀；
17.所述洗涤液的组份包括：20mm tris，2m尿素，0.15m氯化钠，20％蔗糖，ph＝7.0～8.0；
18.每克所述沉淀中加入20ml所述洗涤液。
19.进一步的，洗涤液洗涤所述沉淀包括：
20.按比例将洗涤液加入至所述沉淀中；
21.室温条件下：采用磁力搅拌器对沉淀与洗涤液的混合液进行搅拌；其中，磁力搅拌器的转速为：520rpm、搅拌时长为30min；
22.对搅拌后的混合液进行离心处理；其中，离心转速为：12000rpm、离心温度为：4℃；离心时长为30min；
23.重复上述步骤至少两次，即完成洗涤，获得包涵体。
24.进一步的，步骤包涵体变性后进一步复性，得到复性液中，采用变性缓冲液对所述包涵体进行变性；其中，所述变性缓冲液的组份包括：20mm tris，8m尿素，1mm dtt，ph＝7.0～8.0；每克所述包涵体加入10ml所述变性缓冲液；室温条件下磁力搅拌器520rpm搅拌2h后，12000rpm，4℃条件下，离心30min，取上清即得变性后的包涵体；
25.采用复性缓冲液对变性后的包涵体进行复性处理，得到复性液；复性缓冲液的组份包括：20mm tris，1m l-精氨酸，0.1mm gssg，0.2mm gsh，ph＝7.0～8.0；
26.将变性后的包涵体在室温条件下滴加至复性液中，滴加过程中磁力搅拌器520rpm不断搅拌，终浓度为0.2mg/ml。
27.进一步的，步骤复性液进一步在4℃透析过液中，采用透析缓冲液对所述复性液进行透析处理，其中，所述透析缓冲液为20mm tris，ph＝7.0～8.0；复性液与透析缓冲液的体积比为1：10。
28.进一步的，步骤将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化中，采用离子交换缓冲液对复性液进行离子交换层析纯化；
29.离子交换缓冲液包括：离子交换缓冲液a、离子交换缓冲液b；所述离子交换缓冲液a为20mm tris；离子交换缓冲液b的组份包括：20mm tris、1m氯化钠，ph＝7.0～8.0；
30.离子交换缓冲液a平衡阴离子柱5cv后，开始上样透析过液后的复性液，之后用离子交换缓冲液b洗脱，收集目标液即为纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原。
31.进一步的，步骤重组猪胃蛋白酶原进一步脱盐中，采用脱盐缓冲液处理重组猪胃蛋白酶原；其中，脱盐缓冲液为柠檬酸钠缓冲液ph＝1.5～3.5。
32.根据本公开的第二方面，提供了一种重组猪胃蛋白酶，采用上述的纯化制备方法获得。
33.本公开的一种重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法及重组猪胃蛋白酶，其中，纯化制备方法包括：将具有载体的猪胃蛋白酶转化到大肠杆菌中表达，并将表达后的猪胃蛋白酶进行发酵离心处理，得到湿菌；收获的湿菌经大肠杆菌裂解澄清试剂盒裂解、离心，获得沉淀；洗涤沉淀，获得包涵体，包涵体变性后进一步复性，得到复性液；复性液进一步在4℃透析过液，并将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化，得到纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原；重组猪胃蛋白酶原进一步脱盐，获得纯度≥95％的重组猪胃蛋白酶。该工程菌株在大肠杆菌培养基中表达猪胃蛋白酶原a，实现了猪胃蛋白酶原a在大肠杆菌中的高效表达后
期再经过培养基及培养条件优化可实现猪胃蛋白酶原a的高效连续生产，在ph5.4以下的酸性条件下自动激活生成有活性的胃蛋白酶，经纯化后胃蛋白酶酶活≥20000u/g，可在-20℃长期保存，在4℃可稳定保存2个月。可广泛应用于饲料、食品和医药等行业，具有良好的商业应用前景。
34.应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
附图说明
35.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.图1示意性示出本公开示例性实施例中一种阴离子纯化实验结果图。
37.图2示意性示出本公开示例性实施例中一种脱盐实验结果图。
38.图3示意性示出本公开示例性实施例中一种sds-page电泳结果图。
具体实施方式
39.现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施方式使得本公开将更加全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施方式中。
40.此外，附图仅为本公开的示意性图解，并非一定是按比例绘制。图中相同的附图标记表示相同或类似的部分，因而将省略对它们的重复描述。附图中所示的一些方框图是功能实体，不一定必须与物理或逻辑上独立的实体相对应。可以采用软件形式来实现这些功能实体，或在一个或多个硬件模块或集成电路中实现这些功能实体，或在不同网络和/或处理器装置和/或微控制器装置中实现这些功能实体。
41.实施例1
42.基于本技术背景的介绍，可以得知：胃蛋白酶是蛋白酶中的一种，广泛应用于医药、食品、轻工以及生物技术等各个领域。目前其主要来源于动物(如牛、羊、猪等)的胃组织，但是动物源胃蛋白酶存在较多问题，例如易容受动物脏器资源的限制；胃蛋白酶产量小、价格高，且酶活性低、质量不稳定；容易产生有害化学物质残留，例如动物组织的有毒有害因子。因此，以上因素限制了胃蛋白酶的广泛使用。通过基因工程方法，构建重组胃蛋白酶高产工程菌，是解决胃蛋白酶目前应用“瓶颈”的有效方法，该方法通过大规模发酵生产，可大大降低成本，并且纯化得到的酶产物残留少，纯度高，具有环保、不受原料限制等优点。然而目前依然缺少高效表达有活性的胃蛋白酶的工程菌，商品化的重组胃蛋白酶还很少。
43.胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，在酸性条件(例如ph5.4)下可自催化反应生成有活性的胃蛋白酶。目前针对其前体胃蛋白酶原构建基因工程菌是工业上获得胃蛋白酶的有效方法。
44.基于此，提出了本技术的技术方案。具体方案如下：
45.本实施例中首先提供了一种重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，包括：步骤s110-步骤s150。
46.步骤s110.将具有载体的猪胃蛋白酶转化到大肠杆菌中表达，并将表达后的猪胃蛋白酶进行发酵离心处理，得到湿菌。
47.本示例实施方式中，具有载体的猪胃蛋白酶可以在搭载有载体pet-28a(+)的猪胃蛋白酶原，用碱裂解法制备质粒，用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌，挑取转化成功的大肠杆菌单克隆，接种至含有卡纳抗性的5ml试管中，37℃，200rpm培养16h，用甘油保存菌种，进一步按1％接种量接种至500ml摇瓶中，37℃，200rpm培养至od600＝0.6～0.8，加入1mm iptg诱导4h，12000rpm，4℃离心收获湿菌。
48.步骤s120.收获的湿菌经大肠杆菌裂解澄清试剂盒裂解、离心，获得沉淀。
49.本示例实施方式中，采用mbtk独家提供的大肠杆菌裂解澄清试剂盒对湿菌进行裂解，裂解后的湿菌置于离心机中进行离心处理，获得沉淀。
50.步骤s130.洗涤沉淀，获得包涵体，包涵体变性后进一步复性，得到复性液。
51.本示例实施方式中，采用的洗涤液洗涤所述沉淀；所述洗涤液的组份包括：20mm tris，2m尿素，0.15m氯化钠，20％蔗糖，ph＝7.0～8.0；
52.每克所述沉淀中加入20ml所述洗涤液。洗涤液洗涤所述沉淀包括：按比例将洗涤液加入至所述沉淀中；室温条件下：采用磁力搅拌器对沉淀与洗涤液的混合液进行搅拌；其中，磁力搅拌器的转速为：520rpm、搅拌时长为30min；对搅拌后的混合液进行离心处理；其中，离心转速为：12000rpm、离心温度为：4℃；离心时长为30min；重复上述步骤至少两次，即完成洗涤，获得包涵体。
53.具体而言，洗涤缓冲液为20mm tris，2m尿素，0.15m氯化钠，20％蔗糖，ph＝7.0～8.0；其中1g湿菌加入20ml洗涤液，室温条件下磁力搅拌器520rpm搅拌30min，12000rpm，4℃离心30min，重复洗涤两次。
54.采用变性缓冲液对所述包涵体进行变性；其中，所述变性缓冲液的组份包括：20mm tris，8m尿素，1mm dtt，ph＝7.0～8.0；每克所述包涵体加入10ml所述变性缓冲液；室温条件下磁力搅拌器520rpm搅拌2h后，12000rpm，4℃条件下，离心30min，取上清即得变性后的包涵体；采用复性缓冲液对变性后的包涵体进行复性处理，得到复性液；复性缓冲液的组份包括：20mm tris，1m l-精氨酸，0.1mm gssg，0.2mm gsh，ph＝7.0～8.0；将变性后的包涵体在室温条件下滴加至复性液中，滴加过程中磁力搅拌器520rpm不断搅拌，终浓度为0.2mg/ml。
55.具体而言：变性缓冲液为20mm tris，8m尿素，1mm dtt，ph＝7.0～8.0，其中1g包涵体加入10ml变性液，室温条件下磁力搅拌器520rpm搅拌2h，12000rpm，4℃离心30min，取上清即可；复性液为20mm tris，1m l-精氨酸，0.1mm gssg，0.2mm gsh，ph＝7.0～8.0，其中将变性液在室温条件下滴加至复性液中，滴加过程中磁力搅拌器520rpm不断搅拌，终浓度为0.2mg/ml。
56.步骤s140.复性液进一步在4℃透析过液，并将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化，得到纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原。
57.本示例实施方式中，采用透析缓冲液对所述复性液进行透析处理，其中，所述透析缓冲液为20mm tris，ph＝7.0～8.0；复性液与透析缓冲液的体积比为1：10。
58.具体而言：透析缓冲液为20mm tris，ph＝7.0～8.0，其中4℃条件下，将复性液按1：10(v：v)放入透析液中透析，每隔12h换一次透析液，共透析4次。
59.本示例实施方式中，采用离子交换缓冲液对复性液进行离子交换层析纯化；离子交换缓冲液包括：离子交换缓冲液a、离子交换缓冲液b；所述离子交换缓冲液a为20mm tris；离子交换缓冲液b的组份包括：20mm tris、1m氯化钠，ph＝7.0～8.0；离子交换缓冲液a平衡阴离子柱5cv后，开始上样透析过液后的复性液，之后用离子交换缓冲液b洗脱，收集目标液即为纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原。
60.具体而言：离子交换缓冲液a为20mm tris，ph＝7.0～8.0；离子交换缓冲液b为20mm tris，1m氯化钠ph＝7.0～8.0，其中用离子交换缓冲液a平衡阴离子柱5cv后，开始上样，后用离子交换缓冲液b洗脱目标蛋白，收集目标液，目标液即为纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原。
61.步骤s150.重组猪胃蛋白酶原进一步脱盐，获得纯度≥95％的重组猪胃蛋白酶。
62.本示例实施方式中，采用脱盐缓冲液处理重组猪胃蛋白酶原；其中，脱盐缓冲液为柠檬酸钠缓冲液ph＝1.5～3.5。
63.具体而言，脱盐缓冲液为柠檬酸钠缓冲液ph＝1.5～3.5，其中阴离子纯化获得的目标蛋白溶液进一步脱盐激活，获得有高活性的重组猪胃蛋白酶。
64.在一种具体实施方式中，所述方法还包括：
65.步骤s160.对重组猪胃蛋白酶进行活性检测，将活性检测合格的重组猪胃蛋白酶进行分装并保存；其中，保存温度不高于-20℃。
66.在一种具体实施方式中，活性检测采用中国药典2020版胃蛋白酶活性检测方法测定重组猪胃蛋白酶活性。
67.实施例2
68.在上述实施例1的基础上，本实施例对阴离子纯化后所获得的纯度高达90％的重组猪胃蛋白酶原与脱盐后获得的纯度≥95％的重组猪胃蛋白酶进行实验检测，具体检测结果如下表1所示：
69.70.表1
71.实验结果表明，样例1中，一步阴离子纯化可以获得纯度达90％的重组猪胃蛋白酶原，其纯度检测结果参见图1所示，样例2中，进一步脱盐激活获得纯度达95％的重组猪胃蛋白酶，其纯度检测结果参见图2所示，综合图1与图2以及相关参数的检测结果可得，采用本技术的纯化方法纯化制备重组猪胃蛋白酶，其收率达18.9％，活性≥20000u/mg，是传统工艺提取猪胰蛋白酶活性(3800u/mg)的5.2倍。
72.结合图3所示，图3为对纯化后的重组猪胃蛋白酶进行电泳检测的结果图，可见，图3中胃蛋白酶经纯化去除所有杂质，获得高纯度重组猪胃蛋白酶，用sds-page电泳验证，电泳结果显示只有一条目标条带(图3中方框标记)，大小39kda，可见，经电泳验证，采用本技术提供的纯化制备方法可以制备得到纯度≥95％的重组猪胃蛋白酶。
73.本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本公开的其他实施例。本技术旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由权利要求指出。
74.应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围仅由所附的权利要求来限。

技术特征：
1.一种重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，包括：将具有载体的猪胃蛋白酶转化到大肠杆菌中表达，并将表达后的猪胃蛋白酶进行发酵离心处理，得到湿菌；收获的湿菌经大肠杆菌裂解澄清试剂盒裂解、离心，获得沉淀；洗涤沉淀，获得包涵体，包涵体变性后进一步复性，得到复性液；复性液进一步在4℃透析过液，并将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化，得到纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原；重组猪胃蛋白酶原进一步脱盐，获得纯度≥95％的重组猪胃蛋白酶。2.根据权利要求1所述的重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，还包括：对重组猪胃蛋白酶进行活性检测，将活性检测合格的重组猪胃蛋白酶进行分装并保存；其中，保存温度不高于-20℃。3.根据权利要求2所述的重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，活性检测采用中国药典2020版胃蛋白酶活性检测方法测定重组猪胃蛋白酶活性。4.根据权利要求1所述的重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，步骤洗涤沉淀，获得包涵体中，采用的洗涤液洗涤所述沉淀；所述洗涤液的组份包括：20mmtris，2m尿素，0.15m氯化钠，20％蔗糖，ph＝7.0～8.0；每克所述沉淀中加入20ml所述洗涤液。5.根据权利要求4所述的重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，洗涤液洗涤所述沉淀包括：按比例将洗涤液加入至所述沉淀中；室温条件下：采用磁力搅拌器对沉淀与洗涤液的混合液进行搅拌；其中，磁力搅拌器的转速为：520rpm、搅拌时长为30min；对搅拌后的混合液进行离心处理；其中，离心转速为：12000rpm、离心温度为：4℃；离心时长为30min；重复上述步骤至少两次，即完成洗涤，获得包涵体。6.根据权利要求1所述的重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，步骤包涵体变性后进一步复性，得到复性液中，采用变性缓冲液对所述包涵体进行变性；其中，所述变性缓冲液的组份包括：20mmtris，8m尿素，1mmdtt，ph＝7.0～8.0；每克所述包涵体加入10ml所述变性缓冲液；室温条件下磁力搅拌器520rpm搅拌2h后，12000rpm，4℃条件下，离心30min，取上清即得变性后的包涵体；采用复性缓冲液对变性后的包涵体进行复性处理，得到复性液；复性缓冲液的组份包括：20mmtris，1ml-精氨酸，0.1mmgssg，0.2mmgsh，ph＝7.0～8.0；将变性后的包涵体在室温条件下滴加至复性液中，滴加过程中磁力搅拌器520rpm不断搅拌，终浓度为0.2mg/ml。7.根据权利要求1所述的重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，步骤复性液进一步在4℃透析过液中，采用透析缓冲液对所述复性液进行透析处理，其中，所述透析缓冲液为20mmtris，ph＝7.0～8.0；复性液与透析缓冲液的体积比为1：10。8.根据权利要求1所述的重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，步骤将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化中，采用离子交换缓冲液对复性液进行离子交换层析
纯化；离子交换缓冲液包括：离子交换缓冲液a、离子交换缓冲液b；所述离子交换缓冲液a为20mmtris；离子交换缓冲液b的组份包括：20mm tris、1m氯化钠，ph＝7.0～8.0；离子交换缓冲液a平衡阴离子柱5cv后，开始上样透析过液后的复性液，之后用离子交换缓冲液b洗脱，收集目标液即为纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原。9.根据权利要求1所述的重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法，其特征在于，步骤重组猪胃蛋白酶原进一步脱盐中，采用脱盐缓冲液处理重组猪胃蛋白酶原；其中，脱盐缓冲液为柠檬酸钠缓冲液ph＝1.5～3.5。10.一种重组猪胃蛋白酶，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的纯化制备方法获得。

技术总结
本公开的一种重组猪胃蛋白酶的纯化制备方法及重组猪胃蛋白酶，其中，纯化制备方法包括：将具有载体的猪胃蛋白酶转化到大肠杆菌中表达，并将表达后的猪胃蛋白酶进行发酵离心处理，得到湿菌；收获的湿菌经大肠杆菌裂解澄清试剂盒裂解、离心，获得沉淀；洗涤沉淀，获得包涵体，包涵体变性后进一步复性，得到复性液；复性液进一步在4℃透析过液，并将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化，得到纯度≥90％的重组猪胃蛋白酶原；重组猪胃蛋白酶原进一步脱盐，获得纯度≥95％的重组猪胃蛋白酶。该工程菌株在大肠杆菌培养基中表达猪胃蛋白酶原，后期再经过培养基及培养条件优化可实现猪胃蛋白酶原的高效连续生产，具有良好的商业应用前景。前景。前景。


技术研发人员：赵江峰 李艳霞 孟苗 秦奇鹏 张江凡 杨小静
受保护的技术使用者：西安麦博泰克生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/21