一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法及其应用

1.本发明属于细胞工程种苗繁殖技术领域，尤其涉及一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法及其应用。


背景技术：

2.莴苣(lactuca sativa l.)属于菊科莴苣属的植物，分为茎用莴苣和叶用莴苣两类。莴笋和生菜分别是茎用莴苣和叶用莴苣的代表。莴笋和生菜是常见的叶类蔬菜，目前育种主要采用分子标记育种和传统的杂交育种。基因编辑是一种快速对基因和性状进行定向改良的方法，但是莴苣目前的遗传转化方法效率很低(通常《5％)，因此提高莴苣的遗传转化效率对于创制优质莴苣育种材料有着重要的意义。此外传统的莴笋繁种一般分为春秋两季，不合适的气候条件为再生苗的培育增加了难度，严重限制了莴苣的繁种速度，因此，如何加快莴苣的生育周期，提高莴苣育种速率也是本领域要解决的关键问题之一。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法，缩短了莴苣的转化流程，加快了莴苣的生育周期，提高了莴苣育种速率。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
5.本发明提供了一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法，所述方法包括：以苗龄8～12天的莴苣苗真叶为外植体进行第一次孵育培养、农杆菌侵染、第二次孵育培养、筛选培养、生根培养，得到莴苣再生苗。
6.优选的，莴苣种子于育苗培养基中培养得到莴苣苗。
7.优选的，所述育苗培养基为：1/2ms培养基+0～10g/l蔗糖+8g/l琼脂；ph为5.8。
8.优选的，孵育培养基为：ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂；ph为5.8。
9.优选的，筛选培养基为：ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+0.1mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+200mg/l特美汀+50～70mg/l硫酸卡那霉素；ph为5.8。
10.优选的，生根培养基为：1/2ms培养基+10g/l蔗糖+7g/l琼脂+100mg/l特美汀+50～70mg/l硫酸卡那霉素；ph为5.8。
11.优选的，将第一次孵育培养的外植体悬浮于含有农杆菌的农杆菌侵染培养基中，使农杆菌侵染外植体；所述农杆菌侵染培养基为：1/2ms培养基+10g/l蔗糖+200μmol/l乙酰丁香酮；ph为5.8。
12.优选的，莴苣再生苗移植于泥炭土：珍珠岩质量比为5:1的培养基质中驯化。
13.本发明还提供了上述转化方法在莴苣扩繁和/或优异性状保持中的应用。
14.本发明还提供了上述转化方法在莴苣品种改良中的应用。
15.本发明的有益效果：
16.本发明通过优化莴苣的遗传转化方法，选择合适的外植体以及侵染方法，使农杆菌侵染效率可以达到100％；从侵染到第一批苗子生根驯化56天，大大缩短了莴笋/生菜的
转化流程。
17.本发明对得到的莴苣再生苗进行驯化，缩短了莴苣从瓶苗驯化到结种子的时间，通过优化植物工厂的光环境和温度环境，加快了莴苣的繁种速率，使得莴笋育种不再受到季节的限制，并且成活率可达100％，缩短莴苣从瓶苗驯化到结种子时间至4个月。
附图说明
18.图1：外植体；
19.图2：外植体制备示意图；
20.图3：7天后形成愈伤组织图；
21.图4：14天后产生幼芽图；
22.图5：再生苗生根培养图；
23.图6：再生苗驯化示意图；
24.图7：育苗盘。
具体实施方式
25.本发明提供了一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法，所述方法包括：以苗龄8～12天的莴苣苗真叶为外植体进行第一次孵育培养、农杆菌侵染、第二次孵育培养、筛选培养、生根培养，得到莴苣再生苗。
26.本发明所述莴苣包括莴笋、生菜。
27.本发明所述莴苣苗由莴苣种子于育苗培养基中培养得到。作为可选的实施方式，本发明将莴苣种子置于2ml离心管中，然后在超净工作台中先用75％乙醇消毒1～2min，无菌蒸馏水冲洗2～3次，再用10％次氯酸钠溶液，消毒8～10min，无菌蒸馏水冲3～5次，用无菌滤纸片吸干种子表面水分。本发明将处理过的种子种植于育苗培养基上，于光照培养室培养，温度25℃、光照16/8h(光照/黑暗)，光照强度60μmol
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。
28.本发明所述育苗培养基为：1/2ms培养基+0～10g/l蔗糖+8g/l琼脂；ph为5.8。本发明减少了培养基盐分浓度和蔗糖的用量，以避免高浓度盐分和蔗糖对瓶苗的胁迫。本发明所述育苗培养基优选为121℃，110kpa下灭菌20min。
29.本发明选择苗龄8～12天的莴苣无菌苗(如图1所示，长出两片真叶，且第二片真叶刚刚露出)，用手术刀将第一片真叶切成两到三段，大小约为0.5cm2，放置在孵育培养基中进行第一次孵育，所述孵育条件为黑暗孵育18～22h；所述苗龄优选为9～11天，更优选为10天；所述孵育时间优选为19～21h，更优选为20h。本发明中，莴苣无菌苗真叶叶片很薄，切苗之后立即放置在孵育培养表面保持水分，切苗期间切忌外植体长期暴露在空气中导致失水以影响外植体侵染能力。本发明通过选择第一片真叶作为外植体，较传统的莴苣子叶为外植体而言，侵染率更高，产生愈伤组织的时间较短，愈伤组织分化成苗的比例更高。
30.本发明将第一次孵育培养的外植体从培养皿上取出，悬浮于含有农杆菌的农杆菌侵染培养基中，使农杆菌侵染外植体。作为可选的实施方式，本发明将外植体悬浮在装有农杆菌的侵染培养基的离心管中20～30min，中间不断摇晃，保证叶片和菌液充分接触，然后用镊子将外植体从侵染培养基中取出，转移至无菌水清洗，在无菌滤纸上面除去多余水分，得到农杆菌侵染的外植体。
31.在本发明中，作为可选的实施方式，农杆菌侵染液的制备方法为：挑含有目的基因质粒的农杆菌单克隆于3～5ml lb培养基中，加入抗生素于28℃条件下在180rpm摇床培养16h，然后取50μl菌液加到新的50ml lb培养基，并加入抗生素，28℃，180rpm培养16h，od
600
值为0.3～0.5时4℃4000rpm离心20min收集菌体，弃去上清。菌体重新悬浮于农杆菌侵染培养基中，调整od
600
值为0.2～0.4，然后室温(25℃)黑暗条件下静置4～6h，用于侵染莴苣外植体。
32.本发明所述农杆菌侵染培养基为：1/2ms培养基+10g/l蔗糖+200μmol/l乙酰丁香酮；ph为5.8。本发明将1/2ms培养基+10g/l蔗糖于121℃，110kpa下灭菌20min，待温度降至室温条件下加入200μmol/l乙酰丁香酮，得到农杆菌侵染培养基。
33.本发明将农杆菌侵染的外植体平铺在不含有抗生素的孵育培养基平皿上，使用3m医用胶带封口，进行第二次孵育培养。所述培养条件为黑暗中共培养1～3天，优选为2天。
34.本发明所述孵育培养基为：ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂；ph为5.8。本发明所述孵育培养基优选为121℃，110kpa下灭菌20min。
35.本发明将共培养的外植体转入筛选培养基平皿中进行筛选培养，所述平皿使用3m医用胶带封口。本发明将外植体叶片正面朝上，尽量平铺在培养基上，保证伤口与筛选培养基充分接触，在光照培养室中进行愈伤诱导。所述培养温度为22～25℃、培养16/8h(光照/黑暗)，光照强度60μmol
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。为了保证抗生素和特美汀对农杆菌的有效抑制，本发明优选为每10～14d换一次培养基，直至愈伤组织分化出的芽可以移至生根培养基。
36.本发明所述筛选培养基为：ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+0.1mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+200mg/l特美汀+50～70mg/l硫酸卡那霉素；ph为5.8。本发明将ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂于121℃，110kpa下灭菌20min，待温度降至50℃时加入过滤灭菌后的0.1mg/l 6-ba、0.05mg/l naa、200mg/l特美汀和50～70mg/l农杆菌携带质粒抗生素。
37.本发明采用筛选培养基培养约7天可使成功侵染的外植体分化出愈伤组织，约14天会分化出幼芽。本发明当芽生长至3～5cm时，切下具有分化生长点的芽，插入生根培养基中，在光照培养室中进行，所述培养温度为25℃、培养16/8h(光照/黑暗)、光照强度60μmol
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。1～2周后可以看到根系长出。
38.本发明所述生根培养基为：1/2ms培养基+10g/l蔗糖+7g/l琼脂+100mg/l特美汀+50～70mg/l硫酸卡那霉素；ph为5.8。本发明将1/2ms培养基+10g/l蔗糖+7g/l琼脂于121℃，110kpa下灭菌20min，待温度降至50℃时加入灭菌后的100mg/l特美汀和50～70mg/l农杆菌携带质粒抗生素。
39.本发明待生根培养3周后，挑选生根粗壮的莴苣瓶苗放置室外1～2天；将莴苣苗从培养瓶中取出，去除掉多余的培养基，然后移植于泥炭土：珍珠岩质量比为5:1的培养基质中驯化。本发明所述培养基质需要完全润湿，且不能有积水。在驯化过程中，盖上保鲜膜保持湿度和温度，确保保鲜膜与植物叶片之间没有接触。驯化期间不需要浇水，10～14天后待莴苣苗长出新叶揭开保鲜膜接续培养，后续培养浇灌1/2霍格兰营养液。
40.如果外界温度过高(》30℃)或者过低(《15℃)，需要将莴苣苗转移至植物工厂进行炼苗，所述炼苗温度为23～25℃，光照强度100μmol
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，光周期为16h，空气湿度为60～80％。本发明所述再生苗的成活率为100％。
41.自然条件下，莴苣最佳的繁种时间为每年的5月份，如果季节不合适可以将再生苗
转移至植物工厂加快育种。本发明所述育种光环境设置为红光：蓝光＝3:1，冠层光照强度200μmol
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，温度为20～22℃，光周期16h。
42.本发明还提供了上述转化方法在莴苣扩繁和/或优异性状保持中的应用。
43.本发明还提供了上述转化方法在莴苣品种改良中的应用。
44.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
45.下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
46.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
47.实施例1
48.本实施例提供了一种农杆菌介导的莴笋/生菜遗传转化方法：
49.(1)莴笋/生菜无菌苗的培养：
50.将莴笋/生菜种子置于2ml离心管中，然后在超净工作台中先用75％乙醇消毒1min，无菌蒸馏水冲洗2次，再用10％次氯酸钠溶液，消毒10min，无菌蒸馏水冲4次，用无菌滤纸片吸干种子表面水分。将处理过的种子分别种植于育苗培养基(1/2ms培养基+10g/l蔗糖+8g/l琼脂，ph 5.8，121℃，110kpa下灭菌20min)上，于光照培养室培养，温度25℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度60μmol
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。
51.(2)外植体制备(示意图见图2)：
52.取苗龄10天的莴笋/生菜无菌苗(长出两片真叶，且第二片真叶刚刚露出)，用镊子将无菌苗拔出，用手术刀将真叶切下，叶片切至0.5cm2大小，切苗之后立即放置在孵育培养基(ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂，ph 5.8，121℃，110kpa下灭菌20min)黑暗孵育20h。
53.(3)农杆菌侵染培养基制备：
54.农杆菌菌株为gv3101，克隆载体真核抗性为kanr，原核抗性为smr。挑含有目的基因质粒的农杆菌单克隆于4ml lb培养基中，加入抗生素(50mg/l壮观霉素，50mg/l庆大霉素，25mg/l利福平)于28℃条件下在180rpm摇床培养16h。然后取50μl菌液加到新的50ml lb培养基，并加入抗生素(50mg/l壮观霉素，50mg/l庆大霉素，25mg/l利福平)，28℃，180rpm培养16h，od
600
值为0.3～0.5，4℃，4000rpm离心20min收集菌体，弃去上清。重新悬浮于农杆菌侵染培养基(1/2ms培养基+10g/l蔗糖，ph 5.8，121℃，110kpa下灭菌20min，室温条件下加入200μmol/l乙酰丁香酮)，调整od
600
值为0.2～0.4，然后室温(25℃)黑暗条件下静置5h，用于侵染莴笋/生菜外植体。
55.(4)农杆菌侵染外植体：
56.将黑暗培养的莴笋/生菜外植体从培养皿上取出，悬浮在装有25ml农杆菌侵染培养基的离心管中25min，中间不断摇晃，保证叶片和菌液充分接触，然后用镊子将外植体从侵染培养基中取出，转移至无菌水清洗1min，在无菌滤纸上面除去多余水分，平铺在不含有抗生素的孵育培养基平皿(ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂，ph5.8，121℃，110kpa下灭菌20min)，使用3m医用胶带封口，继续在培养基中黑暗中共培养2天。
57.(5)莴笋/生菜诱导愈伤-发芽培养基培养：
58.将共培养的外植体转入筛选培养基平皿中，使用3m医用胶带封口。筛选培养基配
方为：ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂，ph 5.8，121℃，110kpa下灭菌20min，温度降低至50℃加入0.1mg/l 6-ba，0.05mg/lnaa，200mg/l特美汀以及60mg/l硫酸卡那霉素。叶片正面朝上，保证伤口与培养基充分接触。在光照培养室中进行愈伤诱导，温度24℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度60μmol
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。每10～14d换一次培养基，培养7天后成功侵染的外植体分化出愈伤组织(见图3)，培养14天后分化出幼芽(见图4)。
59.(6)生根培养：
60.当芽生长至4cm时，切下具有分化生长点的芽，插入生根培养基中，生根培养基组成为1/2ms培养基+10g/l蔗糖+7g/l琼脂，在121℃，110kpa灭菌锅灭菌30min，培养基温度降低至50℃时，加入60mg/l硫酸卡那霉素和100mg/l特美汀。生根在光照培养室中进行，温度25℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度60μmol
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。1～2周后看到根系长出(见图5)。
61.实施例2
62.本实施例依次对莴笋外植体苗龄、农杆菌侵染时间、共培养时间进行探究：
63.(1)依次选择苗龄为3天(种皮脱落，两片子叶尚未完全张开)、8天、10天、12天、14天(第三片真叶露出)的莴笋，其余步骤同实施例1；
64.(2)依次选择农杆菌侵染时间为10min、20min、30min，其余步骤同实施例1；
65.(3)依次选择农杆菌共培养时间为2天、3天，其余步骤同实施例1。
66.再生苗转化效果见表1：
67.表1不同转化方法得到的再生苗
[0068][0069][0070]
由表1可知，本发明转化方法得到的侵染效率、生芽率、生根率、阳性率和转化效率较高。
[0071]
实施例3
[0072]
本实施例将实施例1得到的莴笋/生菜再生苗进行驯化、炼苗：
[0073]
莴笋/生菜再生苗驯化移栽(示意图见图6)：
[0074]
生根培养3周后，挑选生根粗壮的莴笋/生菜瓶苗放置室外2天，从培养瓶中取出，去除掉多余的培养基，然后移植于泥炭土：珍珠岩5:1的培养基质中，基质需要完全润湿，且不能有积水。盖上保鲜膜保持湿度和温度，确保保鲜膜与植物叶片之间没有接触。期间不需要浇水，12天后待再生苗长出新叶、发出新根揭开保鲜膜接续培养，后续培养浇灌1/2霍格兰营养液。
[0075]
外界温度过高(》30℃)或者过低(《15℃)，需要将再生苗转移至植物工厂进行炼苗，温度24℃，光强100μmol
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，光周期16h，空气湿度75％。再生苗的成活率100％。
[0076]
实施例4
[0077]
(1)对植物工厂/塑料大棚炼苗生根率进行对比。
[0078]
莴苣阳性苗从瓶苗转移至泥炭土：珍珠岩5:1的栽培基质中，使用塑料薄膜覆盖保持湿度，一半莴苣阳性苗在植物工厂中炼苗，植物工厂温度为日间温度25℃，夜间温度20℃，空气湿度75％，冠层dli为9mol
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d1；一半莴苣阳性苗在塑料大棚中炼苗，塑料大棚日间最高温度28℃，夜间最低温度12℃，平均温度18℃，空气湿度75％，冠层dli(daily light integral；每日光照积分)为1～6mol m-2
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。使用两层育苗盘培养，方便观测是否有新根生成(育苗盘见图7)：底部多孔的育苗平盘两个，高8cm，都装上基质(泥炭土：珍珠岩5:1)，大概是育苗盘的5/4处，叠放到一起，上层育苗盘定植植株，株距5～10cm。两层基质，保水性和排水性很好，方便从第一层育苗盘底部观测是否有新根生出，便于移栽。
[0079]
14天后植物工厂炼苗95％以上植株生出新根，塑料大棚中炼苗植株78％植株生出新根。
[0080]
(2)植物工厂繁种/塑料大棚繁种对比：
[0081]
2021年10月份获得阳性植株，经过缓苗之后转移至直径25cm，高度20cm的栽培盆中继续培养。一半莴苣植株11月份转移至植物工厂，植物工厂温度为日间温度23℃，夜间温度20℃，空气湿度75％，冠层dli为9mol
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d1。一个月之后开花，两个月之后获得成熟种子。一半莴苣植株继续在塑料大棚中生长(没有加温措施)，塑料大棚从11月到翌年2月的日间最高温度21℃，夜间最低温度6℃，平均温度14℃，空气湿度75％，冠层dli为1～8mol m-2
d-1
。莴苣出现花蕾，但是花朵不张开，2022年3月以后气温回升，花朵张开，种子陆续成熟。
[0082]
表明植物工厂冬季育种比普通塑料大棚快两个多月。
[0083]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括：以苗龄8～12天的莴苣苗真叶为外植体进行第一次孵育培养、农杆菌侵染、第二次孵育培养、筛选培养、生根培养，得到莴苣再生苗。2.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，莴苣种子于育苗培养基中培养得到莴苣苗。3.根据权利要求2所述的转化方法，其特征在于，所述育苗培养基为：1/2ms培养基+0～10g/l蔗糖+8g/l琼脂；ph为5.8。4.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，孵育培养基为：ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂；ph为5.8。5.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，筛选培养基为：ms培养基+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+0.1mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+200mg/l特美汀+50～70mg/l硫酸卡那霉素；ph为5.8。6.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，生根培养基为：1/2ms培养基+10g/l蔗糖+7g/l琼脂+100mg/l特美汀+50～70mg/l硫酸卡那霉素；ph为5.8。7.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，将第一次孵育培养的外植体悬浮于含有农杆菌的农杆菌侵染培养基中，使农杆菌侵染外植体；所述农杆菌侵染培养基为：1/2ms培养基+10g/l蔗糖+200μmol/l乙酰丁香酮；ph为5.8。8.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，莴苣再生苗移植于泥炭土：珍珠岩质量比为5:1的培养基质中驯化。9.权利要求1～8任意一项所述的转化方法在莴苣扩繁和/或优异性状保持中的应用。10.权利要求1～8任意一项所述的转化方法在莴苣品种改良中的应用。

技术总结
本发明提供了一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法及其应用，属于细胞工程种苗繁殖技术领域。本发明以苗龄8～12天的莴苣苗真叶为外植体进行第一次孵育培养、农杆菌侵染、第二次孵育培养、筛选培养、生根培养，得到莴苣再生苗，缩短了莴苣的转化流程，使农杆菌侵染效率可以达到100％。同时对得到的莴苣再生苗进行驯化，缩短了莴苣从瓶苗驯化到结种子的时间，成活率可达100％。成活率可达100％。成活率可达100％。


技术研发人员：梁颖 张泽锦 唐丽
受保护的技术使用者：四川省农业科学院园艺研究所
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/7/21