一种核酸提取用微米级磁性介孔微球及其制备方法

1.本发明属于高分子合成技术领域，具体涉及核酸提取用微米级磁性介孔微球及制备方法。


背景技术：

2.核酸提取技术是现代基因技术的基础，通过收集采样者的核酸样本，对核酸结果进行分析，能够有效了解采样者的健康状况，实现核酸的快速提取分离也始终是科研人员所追求的目标。
3.目前成熟的商用核酸提取试剂主要以二氧化硅复合磁珠居多，其通过表面二氧化硅基团以静电、氢键、亲水三种作用形式实现对核酸的特异性吸附，整个过程耗时较短，同时在一定条件下磁珠也能够可逆地脱附，从而完成对核酸的提取作用。复合磁珠的磁性节约了产品用在分离上的时间，因此这类磁珠结构被广泛用于商业化中，作为试剂盒的材料。但是这类磁珠也存在着磁响应速度慢、回收率低、核酸易丢失等问题，而这些问题都可归因于磁珠自身纳米级的尺寸，因此提高磁珠材料的粒径，以获得更好的吸附与分离能力这项工作十分重要。
4.之所以目前核酸提取用试剂中均不使用微米级粒径的磁珠，原因在于相比于微米级球，纳米球粒径更小，因此比表面积远大于微米级球体，更大的比表面积带来更高的核酸吸附效率，因此目前极少将微米级磁珠应用到核酸提取环节中来。微米级球比表面积小，这是制约其应用的主要因素，那么稳定地提高其比表面积，从而增强其微球对核酸的提取效率则是一个极具探索价值的方向。
5.介孔材料稳定可控的制备工艺自被赵东元等人发展建立以来，其应用价值就广受研究。介孔材料指具有均一孔径分布，且孔径在2～50nm左右的材料，介孔孔道地密集分布使得介孔材料具有非常大的比表面积，能够高效地与靶向分子作用。
6.如qingbin yuan的团队就在纳米磁珠的表面包覆了介孔层结构，大大提升了磁珠对核酸的提取效率，且简化了吸附条件，降低了商用成本。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种响应速度快、吸附效率高的核酸提取用微米级磁性介孔微球及制备方法。
8.本发明提供的核酸提取用微米级磁性介孔微球，包括：
9.微米级交联型聚苯乙烯微球内核；
10.包裹于微米级交联聚苯乙烯微球内核外的四氧化三铁层；
11.包裹于四氧化三铁层外的硅氧化物层；
12.包裹于硅氧化物层外的具有介孔结构的硅氧化物层。
13.进一步地：
14.所述微米级交联型聚苯乙烯微球粒径为1～10μm，粒径变异系数为0～10％(优选
为1～10％)，交联度为20～60％；
15.所述四氧化三铁层厚度为100～500nm，饱和磁化强度为40～80emu/g；
16.所述硅氧化物层厚度为100～500nm；
17.所述具有介孔结构的硅氧化物层比表面积为100～500m2/g，孔径为2.5～10nm。
18.优选的，所述微米级交联聚苯乙烯微球内核通过溶胀法以单分散聚苯乙烯种子微球经由单体与交联剂交联而成，所述单体选自苯乙烯，所述交联剂选自二乙烯基苯。
19.本发明还提出了一种微米级磁性介孔微球的制备方法，包括：
20.s1、通过溶胀法加入交联剂制备得到微米级交联型聚苯乙烯微球；
21.s2、将微米级微球通过磺化反应后，得到磺化的聚苯乙烯微球；
22.s3、通过共沉淀法以铁盐/亚铁盐混合物制备四氧化三铁，将四氧化三铁与磺化聚苯乙烯微球反应后得到磁性微球；
23.s4、将所述磁性微球进行预处理，再经由法反应，得到硅氧化物包裹的磁性微球；
24.s5、将所述硅氧化物包裹的磁性微球通过软模板法，进行修饰，得到磁性介孔微球。
25.优选的，所述步骤s4中硅氧化物包裹的磁性微球按照以下方法制备：
26.向磁性微球中加入酸液进行超声处理，然后磁分离得到经过预处理的磁性微球；
27.向所述经过预处理的磁性微球中加入溶剂、催化剂及硅源进行反应，得到硅氧化物包裹的磁性微球。
28.优选的，所述酸液选自盐酸，所述酸液浓度范围为0.1～1mol/l；
29.所述溶剂为乙醇水溶液，所述溶剂浓度为60～85％；
30.所述催化剂为浓氨水；
31.所述硅源为四乙氧基硅；
32.所述反应条件为超声，所述反应时间为2小时。
33.优选的，所述步骤s5中磁性介孔微球按照以下方法制备：
34.向所述硅氧化物包裹的磁性微球中加入模板剂、溶剂、催化剂、硅源进行反应，得到带有模板剂的磁性介孔微球；
35.向所述带有模板剂的磁性介孔微球中加入溶液去除模板剂，得到磁性介孔微球。
36.优选的，所述模板剂为十六烷基三甲基溴化铵；
37.所述溶剂为乙醇水溶液，所述溶剂浓度为60～85％；
38.所述催化剂为浓氨水；
39.所述硅源为四乙氧基硅烷，所述硅源加入方式为注射泵进样，所述硅源进样用时为30分钟，所述硅源进样间隔为3～6小时；
40.所述反应条件为40～60℃加热，所述总计反应时间为2～12小时；
41.优选的，所述去除模板剂的溶液为硝酸铵的甲醇溶液；
42.所述硝酸铵浓度为5～20mg/ml；
43.所述去除模板剂时的反应温度为50～80℃，所述反应时长为1～5小时。
44.本发明提出了一款微米级磁性介孔微球，包括微米级交联型聚苯乙烯微球内核；包裹于微米级交联聚苯乙烯微球内核外的四氧化三铁层；包裹于四氧化三铁层外的硅氧化
物层；包裹于硅氧化物层外的具有介孔结构的硅氧化物层。与现有技术相比，本产品的多层复合结构设计新颖，不同层材料赋予了微球独特的功能性，其中微米级内核提供了模板，提高了微球整体在各个环境下的分离速度，四氧化三铁层赋予了微球强磁性，使微球能够通过磁响应方式实现分离，介孔硅氧化物层提供了二氧化硅基团与大比表面积以实现对核酸的高效吸附，同时也保护了内层四氧化三铁层，防止铁氧体分解导致磁性下降。
45.本发明提出的微米级磁性介孔微球制备方法可重复性好，产品对核酸提取效率高，核酸提取过程中磁分离响应速度快，在商用领域极具潜在使用价值。
附图说明
46.图1为实施例1中微米级磁性介孔微球在1kx下的场发射电镜图像
47.图2为实施例1中微米级磁性介孔微球在2kx下的场发射电镜图像
48.图3为实施例1中微米级磁性介孔微球的结构示意图
49.图4为实施例2中硅氧化物包裹的磁性微球
50.图5为实施例1中微米级磁性介孔微球与商用磁珠的核酸吸附结果
51.图6为实施例1中微米级磁性介孔微球与阿拉丁磁珠分离速率对比
52.图7为实施例1中微米级磁性介孔微球与碧云天磁珠分离速率对比
53.图8为实施例3～4中各个样品的核酸吸附结果
54.图9为实施例5～6中各个样品的核酸吸附结果
具体实施方式
55.下面的实施例非限制地描述了本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
56.本技术提供了一种微米级磁性介孔微球的制备方法，利用该方法能够获得单分散性好、粒径大于5μm、比表面积大的微米级磁性介孔微球。具体的，本技术包括以下步骤：
57.a.制备种子微球，然后通过种子溶胀制备微米级交联微球
58.b.对所述微球进行磺化反应，制备纳米四氧化三铁粒子，将所述磺化微球与四氧化三铁粒子复合得到磁性微球
59.c.在所述磁性复合微球表面修饰二氧化硅基团，制备硅氧化物层包覆的磁性微球
60.d.在所述硅氧化物包裹的磁性微球表面包覆介孔硅层，制备微米级磁性介孔微球。
61.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的微米级磁性介孔微球的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
62.实施例1
63.(1)种子溶胀法制备微米级交联型聚苯乙烯微球
64.将2g聚乙烯吡咯烷酮用120g乙醇溶解，通氮气保护后取7.5g苯乙烯同0.3g偶氮二异丁腈和30ml无水乙醇混匀加入，70℃反应12小时后分散在0.25wt％十二烷基硫酸钠中保存。将0.25wt％十二烷基硫酸钠溶液混合0.05g种球与400μl的邻苯二甲酸丁酯，搅拌24小时。加入2.5g苯乙烯与1g二乙烯基苯、50g十二烷基硫酸钠溶液、0.05g过氧化苯甲酰的混合物搅拌24小时，然后加入40g7.5wt％的聚乙烯吡咯烷酮溶液，通氮气后80℃下反应12小时
后得到微米级交联型聚苯乙烯微球。
65.(2)磁性微球的合成
66.将1g所述微米级交联型聚苯乙烯微球与2.5ml冰醋酸混合，再加入25ml浓硫酸超声分散后在80℃下反应6h，得到磺化后的微球，样品干燥保存。称取120mgfecl2·
4h2o、196mg无水fecl3与25ml水，通氮气后等待30min，之后迅速加入4.0ml28％的浓氨水等待30min，在85℃下反应30min后与400mg所述磺化后的微球常温混合反应12小时，得到磁性微球，样品分散于水中。
67.(3)制备硅氧化物包裹的磁性微球
68.取100mg所述磁性微球，加入50ml0.1mol/l的hcl溶液超声处理10min，磁分离得到产物后加入20ml水和80ml的95％乙醇搅拌，再加入2ml的浓氨水，用注射泵进样75μl的四乙氧基硅烷与2ml乙醇的混合溶液，超声反应2h，磁分离收集产物。
69.(4)制备微米级磁性介孔微球
70.取100mg所述硅氧化物包裹的磁性微球，加入80ml乙醇、10ml水与10ml的10mg/ml的十六烷基三甲基溴化胺溶液，在40℃下反应30min，再加入2ml28wt％的浓氨水，注射泵进样75μl四乙氧基硅烷与2ml无水乙醇的混合溶液，间隔4小时后再次加入75μl的四乙氧基硅烷与2ml无水乙醇的混合溶液，反应4小时后，收集产物，用60ml10mg/ml硝酸铵/甲醇溶液在60℃下洗涤产物4小时，通过磁分离收集最终产物。
71.利用扫描电子显微镜对实施例1中得到的微米级磁性介孔微球进行分析，得到其扫描电镜图如图1与图2所示。其中图1为1kx倍数下的微米级磁性介孔微球，图2为10kx倍数下的微米级磁性介孔微球，图3为微米级磁性介孔微球的结构示意图。
72.实施例2
73.保留实施例1中步骤(1)、(2)、(4)，步骤(3)更改为：
74.取100mg所述磁性微球，加入20ml水和80ml的95％乙醇与75μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌30min,，再加入2ml的浓氨水，用注射泵进样75μl的四乙氧基硅烷与2ml乙醇的混合溶液，超声反应2h，磁分离收集产物，图4为产物的场发射电镜图像。
75.实施例3
76.保留实施例1中步骤(1)、(2)、(3)，步骤(4)更改为：
77.取100mg所述硅氧化物包裹的磁性微球，加入80ml乙醇、10ml水与10ml的10mg/ml的十六烷基三甲基溴化胺溶液，在40℃下反应30min，再加入2ml28wt％的浓氨水，注射泵进样50μl四乙氧基硅烷与2ml无水乙醇的混合溶液，反应4小时后，收集产物，用60ml10mg/ml硝酸铵/甲醇溶液在60℃下洗涤产物4小时，通过磁分离收集最终产物。
78.实施例4
79.保留实施例1中步骤(1)、(2)、(3)，步骤(4)更改为：
80.取100mg所述硅氧化物包裹的磁性微球，加入80ml乙醇、10ml水与10ml的10mg/ml的十六烷基三甲基溴化胺溶液，在40℃下反应30min，再加入2ml28wt％的浓氨水，注射泵进样100μl四乙氧基硅烷与2ml无水乙醇的混合溶液，间隔4小时后再次加入100μl的四乙氧基硅烷与2ml无水乙醇的混合溶液。反应4小时后，收集产物，用60ml10mg/ml硝酸铵/甲醇溶液在60℃下洗涤产物4小时，通过磁分离收集最终产物。
81.对实施例3与实施例4得到的样品及在相同变量下调节不同浓度得到的样品进行
bet吸脱附测试，得到的不同样品微观结构数据如表1所示。
82.表1不同四乙氧基硅烷(teos)加入量下磁性介孔微球结构对比
[0083][0084]
实施例5
[0085]
保留实施例1中步骤(1)、(2)、(3)，步骤(4)更改为：
[0086]
取100mg所述硅氧化物包裹的磁性微球，加入80ml乙醇、10ml水与1ml的10mg/ml的十六烷基三甲基溴化胺溶液，在40℃下反应30min，再加入2ml28wt％的浓氨水，注射泵进样50μl四乙氧基硅烷与2ml无水乙醇的混合溶液，反应4小时后，收集产物，用60ml10mg/ml硝酸铵/甲醇溶液在60℃下洗涤产物4小时，通过磁分离收集最终产物。
[0087]
实施例6
[0088]
保留实施例1中步骤(1)、(2)、(3)，步骤(4)更改为：
[0089]
取100mg所述硅氧化物包裹的磁性微球，加入80ml乙醇、10ml水与15ml的10mg/ml的十六烷基三甲基溴化胺溶液，在40℃下反应30min，再加入2ml28wt％的浓氨水，注射泵进样50μl四乙氧基硅烷与2ml无水乙醇的混合溶液，反应4小时后，收集产物，用60ml10mg/ml硝酸铵/甲醇溶液在60℃下洗涤产物4小时，通过磁分离收集最终产物。
[0090]
对实施例5与实施例6的样品及在相同变量下调节不同浓度得到的样品进行bet吸脱附测试，得到的不同样品微观结构数据如表2所示。
[0091]
表2不同十六烷基三甲基溴化胺(ctab)加入量下磁性介孔微球结构对比
[0092][0093]
将实施例1得到的微米级磁性介孔微球与采购的商用磁珠进行核酸吸附效率的对比，吸附结果见图5，同阿拉丁磁珠分离速率的对比如图6，同碧云天磁珠分离速率的对比如图7，其中微米级磁性介孔微球样品始终在右边。
[0094]
将实施例3～4，实施例5～6中得到的各个样品进行核酸吸附测试，结果分别如图8与图9所示。

技术特征：
1.一种核酸提取用微米级磁性介孔微球，其特征在于，包括：微米级交联型聚苯乙烯微球内核；包裹于微米级交联聚苯乙烯微球内核外的四氧化三铁层；包裹于四氧化三铁层外的硅氧化物层；包裹于硅氧化物层外的具有介孔结构的硅氧化物层。2.根据权利要求1所述的微米级磁性介孔微球，其特征在于：所述微米级交联型聚苯乙烯微球粒径为1～10μm，粒径变异系数为0～10％，交联度为20～60％；所述四氧化三铁层厚度为100～500nm，饱和磁化强度为40～80emu/g；所述硅氧化物层厚度为100～500nm；所述具有介孔结构的硅氧化物层比表面积为100～500m2/g，孔径为2.5～10nm。3.根据权利要求1所述的微米级磁性介孔微球，其特征在于，所述微米级交联聚苯乙烯微球内核通过溶胀法以单分散聚苯乙烯种子微球经由单体与交联剂交联而成，所述单体为苯乙烯，所述交联剂为二乙烯基苯。4.一种如权利要求1-3指所述微米级磁性介孔微球的制备方法，其特征在于，具体步骤为：s1、通过溶胀法加入交联剂制备得到微米级交联型聚苯乙烯微球；s2、将微米级微球通过磺化反应后，得到磺化的聚苯乙烯微球；s3、通过共沉淀法以铁盐/亚铁盐混合物制备四氧化三铁，将四氧化三铁与磺化聚苯乙烯微球反应后得到磁性微球；s4、将所述磁性微球进行酸化预处理，再经由法反应，得到硅氧化物包裹的磁性微球；s5、将所述硅氧化物包裹的磁性微球通过软模板法，进行修饰，得到磁性介孔微球。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中硅氧化物包裹的磁性微球的制备流程为：向磁性微球中加入酸液进行超声处理，然后磁分离得到经过预处理的磁性微球；向所述经过预处理的磁性微球中加入溶剂、催化剂及硅源进行反应，得到硅氧化物包裹的磁性微球。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酸液选自盐酸，所述酸液浓度范围为0.1～1mol/l；所述溶剂为乙醇水溶液，所述溶剂浓度为60～85％；所述催化剂为浓氨水；所述硅源为四乙氧基硅；所述反应条件为超声，所述反应时间为2小时。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤s5中磁性介孔微球的制备流程为：向所述硅氧化物包裹的磁性微球中加入模板剂、溶剂、催化剂、硅源，进行反应，得到带有模板剂的磁性介孔微球；向所述带有模板剂的磁性介孔微球中加入溶液去除模板剂，得到磁性介孔微球。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述模板剂为十六烷基三甲基溴化铵；所述溶剂为乙醇水溶液，所述溶剂浓度为60～85％；所述催化剂为浓氨水；所述硅源为四乙氧基硅烷，所述硅源加入方式为注射泵进样，所述硅源进样用时为30分钟，所述硅源进样间隔为3～6小时；反应条件为40～60℃加热，总计反应时间为2～12小时。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述去除模板剂的溶液为硝酸铵的甲醇溶液；所述硝酸铵浓度为5～20mg/ml；所述去除模板剂时的反应温度为50～80℃，所述反应时长为1～5小时。

技术总结
本发明属于高分子合成技术领域，具体为核酸提取用微米级磁性介孔微球及制备方法。本发明的微米级磁性介孔微球，包括：微米级交联聚苯乙烯微球作为内核；包裹于微米级交联聚苯乙烯微球内核外的四氧化三铁层；包裹于四氧化三铁层外的硅氧化物层；包裹于硅氧化物层外的具有介孔结构的硅氧化物层。与现有技术相比，本发明提供的磁性介孔微球粒径在5～7μm间呈单分散分布，交联程度高，具有良好耐溶剂性；中间四氧化三铁层具有超顺磁性，饱和磁化强度高，磁响应速度快；外层具有介孔结构的硅氧化物层比表面积大，介孔孔道分布均一，能够有效增强产品吸附性能，同时对核酸物质产生特异性吸附。附。附。


技术研发人员：汪长春 常英浩
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/21