一种万寿菊抗病基因TeWRKY2的克隆及其应用

一种万寿菊抗病基因tewrky2的克隆及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种万寿菊抗病基因tewrky2的克隆及其应用。


背景技术：

2.万寿菊(tagetes erecta l.)为一种重要的观赏植物，也是用于提取叶黄素(lutein)的功能性花卉。万寿菊黑斑病严重制约万寿菊产业发展，主要危害花朵和茎叶，造成植株早枯死亡。万寿菊链格孢(alternaria tagetica)是万寿菊黑斑病的病原真菌之一，开展万寿菊对链格孢菌侵染的抗病候选基因的研究，将为从根本上防治黑斑病提供有力的理论指导，并具有直接应用价值。


技术实现要素：

3.本发明的目的是克隆万寿菊抗病基因tewrky2并研究其抗病功能，发现其能够抑制万寿菊链格孢菌的生长。本发明万寿菊抗病基因tewrky2，其核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示。
4.本发明中用于克隆所述抗病基因tewrky2的引物对，所述引物对为tewrky2-f和tewrky2-r，其核苷酸序列如序列表中seq id no:2和seq id no:3所示。
5.一种含有本发明所述抗病基因tewrky2的过表达载体，用于构建所述过表达载体的引物对为c85-tewrky2-f和c85-tewrky2-r，核苷酸序列如序列表中seq id no:4和seq id no:5所示；带有酶切位点的tewrky2的orf片段的核苷酸序列如序列表中seq id no:6所示。一种本发明所述的万寿菊抗病基因tewrky2编码的氨基酸，其氨基酸序列如序列表中seq id no:7所示。
6.万寿菊抗病基因tewrky2在提高植物抗病能力中的应用。
7.本发明所述的应用，其中，所述万寿菊抗病基因tewrky2能够抑制万寿菊链格孢菌的生长。
8.本发明所述的应用，其中，所述植物为拟南芥或万寿菊。
9.本发明通过从万寿菊中克隆tewrky2基因并构建载体转化拟南芥，通过对拟南芥转基因和野生型植株在受到万寿菊链格孢菌侵染后的表型性状和发病分析，验证tewrky2的抗病功能。本发明为从根本上防治黑斑病提供有力的理论指导，并具有直接应用价值。
10.下面结合附图对本发明的tewrky2因及其功能作进一步说明。
附图说明
11.图1为本发明tewrky2基因克隆电泳检测图；其中，m：dl2000 dna marker；1、2：tewrky2扩增片段；
12.图2为本发明过表达载体双酶切验证图；其中，m:dl2000 dna marker；1:tewrky2基因；
13.图3为本发明中转化农杆菌菌液pcr电泳检测图；其中，m：dl2000 dna marker；1：水对照；2、3：tewrky2转化农杆菌菌液；
14.图4为本发明中tewrky2转基因种子的收集和筛选过程图；其中，a挑选出的种子；b接种到培养基上的种子；c发芽的种子和长根的种子；
15.图5为本发明中拟南芥gfp pcr电泳检测图；m：dl2000 dna marker；1、2：tewrky2基因条带；
16.图6为本发明中病原菌活化过程，其中，a：菌株；b：孢子；c：菌液。
具体实施方式
17.1、万寿菊tewrky2基因的克隆
18.1.1试验材料
19.1.1.1植物材料
20.本试验所用抗病材料和感病材料万寿菊ts取自北京市农林科学院日本温室。种植于花盆中(基质为蛭石：草炭＝1:2)，正常水肥管理。苗期时，上午9点至10点采集3-5片生长良好、无病虫害、充分展开的叶片，每个样品收集三个生物学重复。
21.1.1.2菌株与载体
22.菌株：大肠杆菌感受态细胞dh5α购自天根生化科技(北京)有限公司。
23.载体：克隆载体选用promega公司的载体。
24.1.1.3主要试剂、试剂盒与仪器设备
25.试剂：rna提取试剂盒(minibest plant rna extraction ki，takara公司)，反转录试剂盒(ⅲall-in-one rt supermix perfect for qpcr试剂盒，诺唯赞公司)，高保真酶pcr扩增试剂(2
×
max master mix，vazyme公司)，目的片段的回收纯化试剂盒(sv grl and pcr clean-up system，promega公司，目的片段与载体的连接试剂盒(promega t4连接酶试剂盒，promega公司)，质粒小量提取试剂盒(axypreptm plasmid miniprep kit，axygen公司)，植物基因组dna提取试剂盒(minibest universal genomic dna extraction kit，takara公司)，荧光定量pcr试剂盒(green pcr kit，qiagen公司)，荧光定量逆转录试剂盒(hiscript ii q rt supermix for qpcr，vazyme公司)，takara la taq、dl2000 dna marker等购于takara公司；氨苄霉素(ampicillin，amp)购于solarbio公司。
26.仪器设备：pcr仪(bio-rad，t100)、微量离心机(thermo scientific heraeus，pico 17)、-80℃超低温冰箱(sanyo，mdf-u53v)、-20℃冰箱(haier，dw-25l262)、4℃冰箱(haier，bcd-225tmpm)、立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司，ls-b75-ii)、超微量分光光度计(food alyt photometer)、紫外凝胶成像系统(tanon，1600)、全温震荡箱(苏州培英实验设备有限公司，thz-c-1)、荧光定量pcr仪(roche 9700)，离子溅射设备(日本东京日立，id-5)，扫描电子显微镜(日本东京日立，s-400n)，凝胶电泳仪(北京六一仪器，jy-spct)、水浴锅(上海一恒，dk-8d)、超净工作台(苏州净化，sw-cj-1fd)、金属浴(尤卡迪生物科技宜兴有限公司，h2o3-proiii)、振荡器(thermolyne，m37610-33)、电子天平(ja2003)等。
27.1.1.4培养基配制
28.lb培养基的配置(以1l为例)：
[0029][0030]
1.1.5试验所需pcr引物
[0031]
利用primer premier 5.0软件设计引物，见表1，引物在上海生工生物工程有限公司(上海生工)合成。合成的引物，4000rpm离心后，按照说明书加入一定量的无菌水，配制成10μm浓度，-20℃保存备用。
[0032]
表1引物序列
[0033][0034]
1.2试验方法
[0035]
1.2.1 rna的提取及cdna的合成
[0036]
(1)rna的提取
[0037]
参照takara minibest plant rna extraction kit试剂盒说明书，稍作修改，具体操作方法如下：
[0038]
①
实验开始前，用75％酒精对工作台和移液枪等所用工具进行表面擦拭。
[0039]
②
配液：溶液i：1l buffer rl，20μl 50
×
dtt buffer；溶液ii：5μl 10
×
dnase i buffer，4μl recombinant dnase t，41μl rnase free dh2o。
[0040]
③
新鲜植物材料或从-80℃冰箱中取出的低温保存的植物材料，取0.1g利用研磨仪于低温下震荡研磨后加入450μl溶液i，上下颠混匀，12000rpm离心5min。
[0041]
④
取出上清液，移到新的1.5ml的离心管内，加上清液1/2体积的无水乙醇，上下颠倒均匀后，快速转入rna spin column中，静置1min后，12000rpm离心1min，弃滤液。
[0042]
⑤
rna spin column中，加入500μl buffer rwa，12000rpm离心30s，弃滤液。
[0043]
⑥
在rna spin column中，加入600μl buffer rwb(用前确认加入规定量酒精)，离心12000rpm 30s，弃滤液。
[0044]
⑦
将50μl溶液ii加到膜中央，室温静置15min，dna被完全消解，然后加入350μl buffer rwb，12000rpm离心30s，弃滤液。
[0045]
⑧
在rna spin column中，加入600μl buffer rwb，12000rpm离心30s，弃滤液。
[0046]
⑨
离心2min后将rnaspin column安置在新的1.5ml的离心管上，室温静置5min使酒精充分挥发。
[0047]
⑩
加入50μl rnase free h2o到膜中央，常温静置5min，12000rpm离心2min，洗脱rna。
[0048]
在膜中央再加入1.5ml离心管内的液体静置5min，12000rpm离心2min，得到总rna溶液。分别取1μl用超微量分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的浓度和质量，rna溶液保存于-80℃冰箱备用。
[0049]
(2)cdna的合成
[0050]
cdna第一链的合成参照reverse transcription system试剂盒说明书，依次于0.5ml离心管中加入以下试剂：
[0051][0052]
后加80μl rna-free水，混匀后，于-20℃保存备用。
[0053]
1.2.2tewrky2全长的扩增
[0054]
利用primer premier 5.0软件设计tewrky2基因的扩增引物tewrky2-f和tewrky2-r；以万寿菊ts叶片的cdna为模板克隆tewrky2，利用2
×
max master mix进行tewrky2的orf的扩增。反应体系如下：
[0055][0056]
轻混匀后，放于bio-rad t100 pcr仪中反应如下程序：
[0057][0058]
将变性到延伸的步骤设置34次循环。扩增结束后取2μl pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0059]
(1)目的片段的回收纯化
[0060]
具体步骤如下：
[0061]
①
在琼脂糖凝胶上切取dna条带，凝胶块置于1.5ml无菌离心管内。
[0062]
②
按100mg∶100μl的比例加入结合液(membrane binding solution)，65℃金属浴放置10min，期间上下3次颠倒混匀，凝胶块全部溶解，取出自然冷却至室温。
[0063]
③
取一个离心吸附柱，套入收集管中，将上述溶液移至吸附柱内并常温静置1min，12000rpm离心30s，弃滤液。
[0064]
④
加入700μl的漂洗液(membrane wash solution)，12000rpm离心30s，倒掉废液。
[0065]
⑤
加入500μl的漂洗液，12000rpm离心30s，弃滤液。
[0066]
⑥
12000rpm离心1min后，吸附柱置于干净的离心管内，开盖放入超净台吹风10min使残余酒精充分挥发。
[0067]
⑦
向吸附柱膜中央滴加30μl nuclease free water，室温静置3min，12000rpm离心1min洗脱dna溶液。
[0068]
(2)回收目的片段和测序载体的体外连接
[0069]
由于2
×
max master mix高保真酶的pcr产物为平末端，无法直接连接t载体，需要对其进行末端加a处理。利用takarataq酶进行回收产物的末端加a，依次加入下列试剂：
[0070][0071]
混匀后，72℃保持30min后，-20℃保存备用。
[0072]
利用promega t4连接酶试剂盒，在克隆载体中加入末端加a后的产物，依次加入下列试剂：
[0073][0074]
样品混匀后短暂离心，于4℃连接8～12h。
[0075]
(3)连接产物的转化和测序
[0076]
采用热激法进行大肠杆菌dh5α的转化：
[0077]
①
在无菌操作台中，配置amp终浓度为50mg/l lb固体培养基，倒入培养皿中。
[0078]
②
将50μl dh5α大肠杆菌感受态放在冰上融化。将5μl连接产物添加到感受态细胞内，轻轻混匀后冰浴30min。
[0079]
③
放入42℃水浴锅热激90s后立即放置冰上3～5min，该过程不要摇动离心管。
[0080]
④
加入500μl 37℃预热过的lb液体培养基，轻混匀后放入37℃摇床180rpm活化60min。
[0081]
⑤
取200μl lb液体培养基和40μl 20mg/ml x-gal和4μl 200g/l ipig溶液，混匀后均匀涂布于lb(含50mg/l amp)培养皿上。
[0082]
⑥
取200μl活化后的菌液均匀涂布于培养皿上，37℃倒置避光培养10～14h。
[0083]
⑦
在无菌操作台中，用枪头挑取10个单菌落放入2ml含有lb(含50mg/l amp)的液体培养基中，180rpm震荡培养14～16h后，送公司测序。
[0084]
⑧
用dnaman比对测序结果，选取序列正确无误的样品进行质粒提取。
[0085]
(4)质粒的小量提取
[0086]
参照axypreptm plasmid miniprep kit试剂盒的说明书，操作步骤如下：
[0087]
①
向1.5ml离心管中倒入1ml菌液，10000rpm离心2min收集菌体，弃上清液。
[0088]
②
加入250μl buffer s1重悬菌液后再加入250μl buffer s2，轻轻的上下颠倒4～6次混匀，直到溶液通透。
[0089]
③
加入350μl buffer s3，轻轻的上下颠倒6次混匀，12000rpm离心10min。
[0090]
④
取制备管置于2ml离心管上，吸取步骤
③
的上清液于制备管中，12000rpm离心1min，倒掉滤液。
[0091]
⑤
向制备管中加入500buffer w1，12000rpm离心1min，倒掉滤液。
[0092]
⑥
加入700buffer w2，12000rpm离心1min，倒掉滤液。重复该操作一次。
[0093]
⑦
12000rpm离心30min，制备管置于新的离心管内，在超净台静置10min让酒精完全蒸发，然后向制备管膜中央加入50μl eluent，室温静置1min，12000rpm离心1min，得到质粒溶液在-20℃冰箱中保存待用。
[0094]
1.3结果与分析
[0095]
以反转录得到的万寿菊叶片的cdna为模板，利用tewrky2-f和tewrky2-r为引物，进行tewrky2基因orf的pcr扩增。pcr产物经过电泳检测得到2条特异性条带。将特异条带回收纯化后与克隆载体相连，送测序，测序结果表明：tewrky2基因全长1600bp的序列(图1)。该序列经分析开放阅读框(open reading frame，orf)为1236bp，编码411个氨基酸。
[0096]
tewrky2序列：
[0097]
caacttacctataagggggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgattggtgctgataccaaggaaaattaaatcacaatgcaaccaaggtggtattgaaattacactaatggacaagtcatctgacaatgtggagttgaccaatgactccaacaatagagacctgtctcatcaagaaacaaattcagagtctataaaagttaaggagcctcatgataattctaatcaggaaggaagttccacaaccgtactatctcacaaagagttggatgatcaaaatgacaaacctactcttcatacggaaagggttgctggatcagaatcttttcaagaaaaggtcactaacacttcacagcaaacacctggatcagaacctgataatgaaaataatagtgtgctattaaggaccgagaaagggcttgataaattaccactaagacgtagtgctgacagtgttacagttgcacaatcagcaccttctgatcaaggtgtcactttctcaaaactacctgaaaaacctactggtgatggatataactggagaaaatatggtcaaaagcttgtaaaagggaatacatttgtacgaagctattataaatgtacatttgctaattgcccggcaagaaaacaggtggaacgttcaaatgatgggattattacagaaataaattacttatggaagcatgaacactctaaaccttcgcatacacttgttaaaggctcggcttttgctcttcctgtttctgataagccttcagaagactattcatctgtgcttcctgcaacaactcatgatcataaggtgtcagaaaccgacacacgtctgcttgtggtggttcctgtaagtgacaaaaatgtggaaacttctattaagagcaatgaaatgaaaagtgaagttgataatgatatatcatcaggctcaaagagacagaagagagagacttgtagtgtgaacgaaggtatttcaaccaaaacaaactgtgagccgcgagtagttgttcagacaacaagtgtagttgatattgtaaatgatggctatcggtggcgcaaatatgggcagaaattagtgaaaggcaatcctaacccaaggagttactatcggtgcacaagcgctggttgtgctgccaaaaagcatgtagaacgggcatctcatgatgaaaaggtggtaattacaacttatgaggggcgccatgatcatgacatgccttctggtggtcgaactgttactcaaaacatgccagggactgggactgggagtggcccagcatctattgaaaaggatggttcaagacctcagccagaatctagtggtatggaaatggttcttcatgttagtgctacttgaggcgcaagtactacagttgagtaatttatcatgccgtcgacttgtagatcataatgatagtcacatagtgttgttatatacctataaatcttgatgatttgcaaattaaagattggtgtatgtgggtgaatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagctcccaacgcgttggatgcatagcttgagtattcttatagggttcacccc
[0098]
tewrky2-orf
[0099]
atggacaagtcatctgacaatgtggagttgaccaatgactccaacaatagagacctgtctcatcaagaa
acaaattcagagtctataaaagttaaggagcctcatgataattctaatcaggaaggaagttccacaaccgtactatctcacaaagagttggatgatcaaaatgacaaacctactcttcatacggaaagggttgctggatcagaatcttttcaagaaaaggtcactaacacttcacagcaaacacctggatcagaacctgataatgaaaataatagtgtgctattaaggaccgagaaagggcttgataaattaccactaagacgtagtgctgacagtgttacagttgcacaatcagcaccttctgatcaaggtgtcactttctcaaaactacctgaaaaacctactggtgatggatataactggagaaaatatggtcaaaagcttgtaaaagggaatacatttgtacgaagctattataaatgtacatttgctaattgcccggcaagaaaacaggtggaacgttcaaatgatgggattattacagaaataaattacttatggaagcatgaacactctaaaccttcgcatacacttgttaaaggctcggcttttgctcttcctgtttctgataagccttcagaagactattcatctgtgcttcctgcaacaactcatgatcataaggtgtcagaaaccgacacacgtctgcttgtggtggttcctgtaagtgacaaaaatgtggaaacttctattaagagcaatgaaatgaaaagtgaagttgataatgatatatcatcaggctcaaagagacagaagagagagacttgtagtgtgaacgaaggtatttcaaccaaaacaaactgtgagccgcgagtagttgttcagacaacaagtgtagttgatattgtaaatgatggctatcggtggcgcaaatatgggcagaaattagtgaaaggcaatcctaacccaaggagttactatcggtgcacaagcgctggttgtgctgccaaaaagcatgtagaacgggcatctcatgatgaaaaggtggtaattacaacttatgaggggcgccatgatcatgacatgccttctggtggtcgaactgttactcaaaacatgccagggactgggactgggagtggcccagcatctattgaaaaggatggttcaagacctcagccagaatctagtggtatggaaatggttcttcatgttagtgctacttga
[0100]
氨基酸序列：
[0101]
mdkssdnveltndsnnrdlshqetnsesikvkephdnsnqegssttvlsh
[0102]
kelddqndkptlhtervagsesfqekvtntsqqtpgsepdnennsvllrt
[0103]
ekgldklplrrsadsvtvaqsapsdqgvtfsklpekptgdgynwrkygqk
[0104]
lvkgntfvrsyykctfancparkqversndgiiteinylwkhehskpsht
[0105]
lvkgsafalpvsdkpsedyssvlpatthdhkvsetdtrllvvvpvsdknv
[0106]
etsiksnemksevdndissgskrqkretcsvnegistktnceprvvvqtt
[0107]
svvdivndgyrwrkygqklvkgnpnprsyyrctsagcaakkhverashde
[0108]
kvvittyegrhdhdmpsggrtvtqnmpgtgtgsgpasiekdgsrpqpess
[0109]
gmemvlhvsat
[0110]
2、过表达载体的构建及转化拟南芥功能验证
[0111]
2.1试验材料
[0112]
2.1.1植物材料
[0113]
转基因所用植物材料为万寿菊ts保存于北京市农林科学院四季青花卉种质资源保存中心。种植于大田中，正常水肥管理，收集饱满的种子。
[0114]
2.1.2菌株与载体
[0115]
菌株：根癌农杆菌eha105电击感受态细胞购买于北京博迈德基因技术有限公司，链格孢菌株为本实验室所保存。
[0116]
载体：植物过表达载体pmdc85质粒为本实验室所保存。
[0117]
2.1.3设备与仪器
[0118]
pcr仪(bio-rad，t100)、微量离心机(thermo scientific heraeus，pico 17)、-80℃超低温冰箱(sanyo，mdf-u53v)、-20℃冰箱(haier，dw-25l262)、4℃冰箱(haier，bcd-225tmpm)、立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司，ls-b75-ii)、超微量分光光
度计(food alyt photometer)、激光共聚焦扫描系统(nikon，eclipse ti)、电击仪(bio-rad，gene pulser xcell
tm
)、紫外凝胶成像系统(tanon，1600)、生物显微镜(bu200i)凝胶电泳仪(北京六一仪器，jy-spct)、超净工作台(苏州净化，sw-cj-1fd)、水浴锅(上海一恒，dk-8d)、电子天平(ja2003)等。
[0119]
2.1.4试验试剂及培养基配制
[0120]
2.1.4.1主要试剂
[0121]
无缝克隆试剂盒(hd cloning kit user manual，takara公司)，目的片段的回收纯化利用回收试剂盒(sv grl and pcr clean-up system，promega公司)，pcr快速扩增试剂盒(2
×
taq plus master mix，诺唯赞公司)。dl2000 dnamarker购自takara公司，限制性内切酶pac i和asc i购自美国纽英伦生物技术公司，卡那霉素(kanamycin，kan)、氨苄霉素(ampicillin，amp)、利福平(rrifampicin，rif)购于solarbio公司，潮霉素(hygromycin，hyg)购于roche公司，75％酒精购于利尔康公司，玉米粉培养基购于solarbio公司。
[0122]
2.1.4.2主要培养基
[0123]
①
yep培养基的配置(以1l为例)：
[0124][0125][0126]
ph调至5.8～6.0，置于立式压力蒸汽灭菌器117℃灭菌17min。
[0127]
②
ms固体培养基(以1l为例)：
[0128][0129]
ph调到5.8～6.0，置于立式压力蒸汽灭菌器117℃灭菌17min。
[0130]
2.1.5试验所需pcr引物
[0131]
表2引物序列
[0132][0133]
2.2试验方法
[0134]
2.2.1过表达载体的构建
[0135]
2.2.1.1 pmdc85载体的双酶切
[0136]
根据pmdc85表达载体多克隆位点特征及tewrky2基因序列特征，分别添加pac i和asc i识别位点序列的上下游引物：c85-tewrky2-f和c85-tewrky2-r(表2)；并以测序正确的tewrky2质粒产物稀释1000倍作为模板，反应体系和程序扩增带有酶切位点的tewrky2的orf片段。
[0137]
使用限制性内切酶pac i和asc i对测序正确pmdc85空表达载体进行双酶切处理，酶切体系如下：
[0138][0139]
37℃酶切6-8h，1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，预期条带切胶回收。
[0140]
2.2.1.2 tewrky2目的片段的扩增
[0141]
tewrky2目的片段扩增体系：
[0142][0143]
程序体系：
[0144][0145]
2.2.1.3无缝克隆技术构建过表达载体
[0146]
无缝克隆技术反应体系：
[0147][0148]
将溶液用移液枪混匀，金属浴50℃15min，然后置于冰上。
[0149]
2.2.1.4转化
[0150]
采用连接产物热激法对大肠杆菌dh5α感受态细胞进行转化，转化菌液在37℃180rpm摇菌1h。菌液轻弹混匀后，吸取300μl菌液利用涂布器均匀涂布在含有kan抗性的lb平板培养基上，37℃倒置培养12～16h。
[0151]
2.2.1.5阳性克隆筛选和菌液pcr验证：
[0152]
(1)次日拿出上一步平板，在超净工作台上，用2.5μl的枪头，分别从平板中挑取5个单克隆菌落，放入含有600μl lb+kan的1.5ml离心管中，37℃摇菌3～5h。然后以1μl混合
50mg/l，rif 25mg/l)上进行划线活化，28℃培养1-2d至长出菌落。
[0172]
(2)挑取单克隆菌落，放到5ml yep培养基(kan 50mg/l，rif 25mg/l)中，28℃180rpm培养36-48h。
[0173]
(3)菌液1:50接入新的yep液体培养基(kan 50mg/l，rif 25mg/l)继续培养，至od
600
＝1.0-1.2。
[0174]
(4)4℃5000rpm离心收集菌体。转化液(2.2g/l ms盐，50g蔗糖，0.01mg/l 6-ba,1mkoh调ph＝5.7-5.8后，加入50ul/l silwet)重悬菌体，并稀释至od
600
＝0.8-1.0。
[0175]
(5)剪去拟南芥果荚及已开的花，用菌液浸泡花蕾10-30s(有条件的最好抽真空，负压利于农杆菌菌液进入花粉管)。
[0176]
压利于农杆菌菌液进入花粉管。
[0177]
(6)将菌液浸泡过的拟南芥平放于盆中，遮光培养24h后，放正并进行正常培养。
[0178]
(7)待浸过菌液部分花结的种荚成熟后，收取种子，阴干放置7d后进行筛选。
[0179]
2.2.3.2筛选拟南芥种子
[0180]
(1)配置培养基、0.1％的琼脂糖溶液，无菌水进行高压灭菌。在超净工作台上，将灭菌后的250ml培养基(约60℃)加入25μl潮霉素(5mg/ml)，之后混匀分装到无菌的2cm高的培养皿中。种子分装到1.5ml无菌离心管中。
[0181]
(2)用移液器吸取未开封的75％的乙醇1ml加入装有种子的离心管中，上下摇晃混匀，消毒30s，用无菌水冲洗1次。
[0182]
(3)步骤同上步，消毒10min用10％的次氯酸钠溶液，冲洗5次。
[0183]
(4)用移液器吸取0.1％的琼脂糖溶液1ml加入装有种子的离心管中，上下摇晃混匀后倒置。
[0184]
(5)打开管盖，将种子和溶液撒在培养基上。用手摇晃培养皿，使得种子均匀分布。
[0185]
(6)用封口膜密封培养皿，倒置于光照培养箱中。设定16h/d的光照时间，温度为25℃，8h/d的黑暗时间，温度为22℃。
[0186]
2.2.4链格孢病原菌的活化和接种
[0187]
(1)单孢纸碟保存在-80℃超低温冰箱，超净工作台消毒，均匀喷洒75％的酒精、30min紫外灯杀菌消毒，随后排气10min。
[0188]
(2)配制玉米粉培养基，玉米粉75g，纯净水1000ml，自然状态下ph。
[0189]
(3)微波炉加热3～4min，一般时间在3min 10s～3min 13s之间，若有固体需要再加热，之后用高压灭菌锅灭菌。
[0190]
(4)先给手套消毒再点燃酒精灯，倒培养基，大约占培养皿的2/3左右轻推使其均匀铺开，大概20min吹干。
[0191]
(5)用75％酒精对镊子消毒，每接种一个单孢纸碟都要消毒。夹出菌落放在培养皿中间，盖上培养盖封口膜封口，记录日期和菌号，放到培养箱培养，一周后观察生长情况。
[0192]
(6)直至长满整个培养皿，用移液枪滴加3ml无菌水，用高压灭菌锅灭过菌的油画笔按照一个方向刷菌丝，将刷下来的菌液用5ml的离心管分装。
[0193]
(7)将刷下来的菌液滴30μl在载玻片上用生物显微镜观察刷下来的菌液中有无产生孢子，可将产生孢子的菌液放到-80℃冰箱长期保存。
[0194]
(8)经血球计数板计数、离心、重悬浮、稀释后，制备成浓度为1
×
104cfuml-1的分
生孢子悬浮液待用。
[0195]
(9)选取生长一致的健壮拟南芥幼苗(ck)、转入过表达载体的c85-tewrky2拟南芥幼苗，孢子悬浮液均匀喷雾于幼苗叶表面，以涂抹清水为对照。
[0196]
(10)接种后的幼苗放置在人工光照培养箱中25℃黑暗保湿培养40h，然后在18/6h(光照/黑暗)条件下培养，2d后观察拍照记录，用spss 22.0软件统计叶片发病数量。
[0197]
2.3结果与分析
[0198]
2.3.1pmdc85-tewrky2表达载体的构建
[0199]
根据已克隆的tewrky2基因cdna序列，在其完整orf两端添加pac i和asc i限制性内切酶识别碱基序列和保护碱基的引物，进行了tewrky2 orf的扩增，得到的预期条带。
[0200]
将空的pmdc85载体利用pac i和asc i限制性内切酶进行双酶切，回收pmdc85酶切片段，以及使用无缝克隆试剂盒进行连接并将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态，对抗性菌落提取质粒并利用pac i和asc i双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2所示，分别得到pmdc85及tewrky2预期大小一致的条带，表明表达载体pmdc85-tewrky2构建成功，酶切正确的克隆进一步进行测序，确认无碱基错误后用于后续试。
[0201]
2.3.2重组载体pmdc85-tewrky2转入农杆菌
[0202]
构建好的pmdc85-tewrky2通过电击法转入农杆菌感受态细胞eha105中，经kan抗性平板筛选初步获得抗性克隆，挑取单菌落利用c85-tewrky2-f和c85-tewrky2-r引物进行菌液pcr验证，并以水作为对照，结果见图3，抗性菌落pcr产物电泳得到预期扩增条带，而水为模板无此条带，表明表达载体pmdc85-tewrky2成功导入农杆菌中。
[0203]
2.3.3过表达载体介导农杆菌转化拟南芥及种子筛选和收集
[0204]
拟南芥种子经过挑选和浸泡之后，挑选出饱满成熟的种子储存于1.5ml离心管(图4a)。种子经过消毒之后，被接种在ms培养基(含潮霉素)上培养(图4b)每个载体转化的种子接种140-160粒，培养4天后，观察到有部分种子可以发芽，大约50-80粒。发芽的种子再继续培养后，部分种子的叶片褐化，不再生长，但也有长出根继续生长的种子(图4c)，大约10-20粒。在培养瓶中生根的植株被移栽，通过潮霉素筛选和gfp绿色荧光蛋白pcr检测(图5)得到2个35s::tewrky2::gfp t1代株系。从得到的2个转基因株系中各自随机挑选2个株系，以同样方式播种、栽培和收取种子，收获得到t2代阳性株系。
[0205]
3.3.4链格孢病原菌的活化和接种
[0206]
将菌株放到玉米培养基上放到光照培养箱培养如图6a所示，培养到表面长满菌丝后在超净台加入无菌水用毛笔把菌丝轻轻刷下来，放到无菌培养箱开盖培养直至长出孢子如图6b。把链格孢孢子制成孢子悬液，浓度1000个/ml(图6c)，孢子悬液均匀喷雾于拟南芥幼苗叶片上进行接种，每株2ml，以接种无菌水为对照。接种后保湿让植株自然发病，湿度100％。保湿40h，接种后48h拍照记录观察拟南芥叶片的发病情况。
[0207]
3.3.5tewrky2转基因拟南芥阳性株系叶片病变数量和表型分析
[0208]
对野生型及转基因品种的t2代拟南芥株系叶片的发病数量进行统计和表型分析。结果表明，在接种万寿菊链格孢病原菌之后暗培养40h转入18h光/6h暗交替培养后，3d之后35s::tewrky2::gfp转基因拟南芥和野生型拟南芥的叶片有少数开始变黄、干枯，叶片病变的数量变化不是很明显。5d之后，wt的叶片干枯变黄的数量显著高于35s::tewrky2::gfp转基因拟南芥。7d之后，wt的叶片干枯变黄的的数量显著高于转基因拟南芥。此外，通过记录
统计转基因拟南芥和野生型拟南芥的开花时间和生长速度无显著差异。以上结果推测tewrky2基因在拟南芥中具有抗万寿菊链格孢的侵染的功能。
[0209]
表3野生型和转基因拟南芥叶片接种万寿菊链格孢后病变数量统计
[0210][0211]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种万寿菊抗病基因tewrky2，其特征在于：tewrky2的核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示。2.用于克隆权利要求1所述抗病基因tewrky2的引物对，其特征在于：所述引物对为tewrky2-f和tewrky2-r，其核苷酸序列如序列表中seq id no:2和seq id no:3所示。3.一种含有权利要求1所述抗病基因tewrky2的过表达载体，其特征在于：用于构建所述过表达载体的引物对为c85-tewrky2-f和c85-tewrky2-r，其核苷酸序列如序列表中seq id no:4和seq id no:5所示；带有酶切位点的tewrky2的orf片段的核苷酸序列如序列表中seq id no:6所示。4.一种权利要求1所述的万寿菊抗病基因tewrky2编码的氨基酸，其特征在于：所述氨基酸的序列如序列表中seq id no:7所示。5.万寿菊抗病基因tewrky2在提高植物抗病能力中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述万寿菊抗病基因tewrky2能够抑制万寿菊链格孢菌的生长。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥或万寿菊。

技术总结
本发明公开了一种万寿菊抗病基因TeWRKY2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。本发明通过从万寿菊中克隆TeWRKY2基因并构建载体转化拟南芥，通过对拟南芥转基因和野生型植株在受到万寿菊链格孢菌侵染后的表型性状和发病分析，验证TeWRKY2的抗病功能。本发明为从根本上防治黑斑病提供有力的理论指导，并具有直接应用价值。并具有直接应用价值。并具有直接应用价值。


技术研发人员：程曦 王红丽 黄丛林 尹冬梅 陈东亮 罗昌 刘华 王丽丽 高康
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/21