植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医学领域，特别涉及植酸(ip6)修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法及将其作为牙本质粘接前处理剂的应用。


背景技术：

2.在传统的树脂-牙本质粘接过程中，酸蚀剂使牙本质胶原纤维内外的磷灰石晶体同时脱矿，造成过度脱矿，粘接剂单体由于受到胶原纤维纳米尺寸结构的限制，难以渗入已脱矿的胶原纤维内部，无法置换其中的水分，致使混合层始终存在含有水分子的胶原裸露区，这不但为因胶原纤维内脱矿而暴露的内源性基质金属蛋白酶提供了功能环境，使蛋白酶活化，进而引起裸露胶原的降解；而且残存的水分子还会继发树脂粘接剂的水解，从而破坏混合层粘接界面的完整性，严重影响树脂修复体的临床寿命。选择性纤维外脱矿技术选择性地脱矿纤维外的磷灰石，使胶原纤维内的磷灰石保留，能够有效避免了传统酸蚀技术导致的粘接界面结构完整性的破坏。基于i型胶原纤维的“分子尺寸排阻特性”，只有相对分子质量小于6kda的分子能够自如渗透进入胶原纤维内部，分子量在6～40kda之间的分子部分进入，而大于40kda的分子则被完全排除在外无法进入纤维内部，因此利用相对分子量大于40kda的钙离子螯合剂处理牙本质表面，可实现选择性胶原纤维外脱矿。
3.虽然目前已有相关研究实现了选择性纤维外脱矿，但脱矿螯合能力弱，作用时间长，导致树脂-牙本质粘接强度不足。同时，现有螯合剂溶解性差，使用不便。因此，探寻一种螯合脱矿作用强，作用时间短，且溶解性良好的大分子量钙离子螯合剂(＞40kda)，有助于推动选择性胶原纤维外脱矿技术的进一步发展。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物及其制备方法和应用，解决现有牙本质处理剂选择性胶原纤维外螯合脱矿能力弱、酸蚀时间长、溶解性差等问题，提高牙本质粘接耐久性。
5.聚酰胺-胺型树枝状聚合物(pamam-nh2)因分子量可控性，良好的溶解性、生物相容性、抗菌性和一定的金属离子螯合能力有望成为一种牙本质处理剂应用于牙本质粘接领域。植酸又名肌醇六磷酸酯，具有极强的螯合能力，且其生物相容性及溶解性优良。本发明利用植酸(ip6)修饰改性pamam-nh2，通过简单的方法制备植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)，其作为一种新型牙本质处理剂应用于酸蚀-冲洗粘接体系中，不仅能实现快速而强效的选择性胶原纤维外脱矿，而且能达到符合临床要求的粘接强度，对基质金属蛋白酶(mmps)酶活性具有抑制作用，且具备良好的抑菌性能，既避免了传统酸蚀技术导致的粘接界面结构完整性被破坏，又解决了现有牙本质钙离子螯合剂所面临的的溶解性差、螯合能力弱、脱矿时间长等问题，进而提高牙本质粘接耐久性。
6.本发明提供的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)，其结构式示意图如下：
[0007][0008]
所述结构式中，n代表接枝植酸(ip6)的数量，n＝60～70，优选地，n＝64。
[0009]
本发明所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)的制备方法，包括以下内容：
[0010]
(1)带保护基团的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备
[0011]
以端基为氨基的第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物(g5-pamam)和氯甲酸-9-芴基甲酯(fmoc-c1)为原料，在二氯甲烷，碳酸氢钠及水的作用下，于室温反应2～4h，得到fmoc(9-芴甲氧羰基)保护的g5-pamam；
[0012]
(2)带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备
[0013]
将fmoc保护的g5-pamam溶解二甲基乙酰胺(dmf)与二甲基亚砜(dmso)的混合溶剂中，得到混合物1；将植酸溶解于dmf、三乙胺(tea)和甲基吗啉的混合溶液中，并缓慢加入二环己基碳二亚胺(dcc)和1-羟基苯并三唑(hobt)混合溶解，搅拌均匀，得到混合物2；
[0014]
将混合物1的缓慢升高到25～30℃，缓慢滴加混合物2，滴加结束1小时后，每隔0.5小时采用fmoc基团测定法检测剩余(未脱掉)fmoc基团的数量来确定pamam上未反应的氨基数量，从而确定pamam上反应掉的的氨基数量(即植酸接枝数量)，来控制植酸接枝数量为60～70(即反应完成后g5-pamam与接枝上的植酸的摩尔比是1:(60～70))；反应完成后，降温至0℃，缓慢停止搅拌，静置2～4小时，然后浓缩，联合采用石油醚(pet)和乙酸乙酯进行结晶和重结晶，干燥，得到带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
[0015]
(3)去掉保护基团
[0016]
将所得带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶解于甲醇中，缓慢加入哌啶，其中带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物：哌啶的摩尔比为1:2，搅拌均匀，在25℃氩气保护下反应2小时，即得植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)。
[0017]
上述方法中，进一步地，步骤(1)中fmoc-c1：g5-pamam：碳酸氢钠的摩尔比为1:1:3，二氯甲烷：水的体积比为5:1。
[0018]
上述方法中，进一步地，步骤(2)中混合物1的配制中，二甲基乙酰胺(dmf)与二甲基亚砜(dmso)的体积比为3:1，并在-12℃下溶解fmoc保护的g5-pamam。
[0019]
上述方法中，进一步地，步骤(2)混合溶液2的配制中，优选植酸：dmf:(tea+甲基吗啉+dcc+hobt的质量之和)的质量比为1:58:1.2，更优选地，其中tea:甲基吗啉的质量比为1:3，dcc：hobt的质量比为7:5。
[0020]
上述方法中，步骤(2)中fmoc保护的g5-pamam：植酸的摩尔比为1:(60～70)，优选
为1:64。在实际反应过程中应逐步检测剩余fmoc基团数量，确定反应了的pamam的基团数量，待pamam与植酸反应完全，反应立即停止，从而控制fmoc保护的基团数和植酸接入的数。所述fmoc基团检测方法为：抽取小样本量，通过检测fmoc剩余的含量来检测pamam反应的基团量。
[0021]
上述方法中，进一步地，所述端基为氨基的第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物通过分散法合成，包括以乙二胺为初始核心，与丙烯酸甲酯通过michael加成反应，再与乙二胺通过酰胺化反应，如此交替反复反应得到。
[0022]
优选地，所述端基为氨基的第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的合成包括以下步骤：
[0023]
①
0.5代pamam的合成(g0.5-pamam)
[0024]
将乙二胺与甲醇在氮气氛围、冰水浴中混合均匀，滴加丙烯酸甲酯，滴加结束在室温(25℃)下反应24h，其中乙二胺：丙烯酸甲酯的摩尔比为1：8，反应结束除去溶剂和过量丙烯酸甲酯，得到淡黄色透明液体g0.5-pamam。
[0025]
②
1代pamam的合成(g1-pamam)
[0026]
将g0.5-pamam与甲醇在氮气氛围、冰水浴中混合均匀，滴加乙二胺，滴加完毕后在室温下反应24h，其中g0.5-pamam：乙二胺的摩尔比为1：24，除去溶剂及过量乙二胺，得到淡黄色粘稠液体，为g1-pamam。
[0027]
然后以合成的g1-pamam为原料，增大丙烯酸甲酯的用量，按照步骤
①
的方法合成g1.5-pamam，其中g1-pamam：丙烯酸甲酯的摩尔比为1:16；再以合成的g1.5-pamam为原料，增大乙二胺的用量，按照步骤
②
的方法合成合成g2-pamam，其中g1.5-pamam：乙二胺的摩尔比为1:48。
[0028]
按上述方法逐步倍数增大丙烯酸甲酯和乙二胺的投料，交替重复michael加成反应与酰胺化反应，直至得到g5-pamam。
[0029]
本发明还提供了上述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)在牙本质粘接领域的应用，具体是作为牙本质粘接前处理剂的应用。
[0030]
所述ip6-pamam-nh2不仅能够实现选择性胶原纤维外脱矿，并且溶解性优良，螯合脱矿能力强，作用时间短，能够有效抑制混合层内胶原酶活性，具有较好的抗菌性和生物相容性。实验表明该聚合物应用于酸蚀-冲洗粘接体系能够有效改善牙本质粘接耐久性，对牙本质粘接领域材料与技术创新具有重要意义。
[0031]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0032]
(1)本发明所述ip6-pamam-nh2处理牙本质表面，不仅能够实现强效的钙离子螯合能力，符合临床有效操作时间，且能够在“干粘接”和“湿粘接”两种技术条件下达到符合临床要求的、无统计学差异的粘接强度，其作为一种新型的牙本质粘接前处理剂，可解决传统湿粘接带来的技术敏感问题(见实例2)。
[0033]
(2)本发明所述的ip6-pamam-nh2处理牙本质表面，通过扫描电镜(sem)观察，在空气干燥和hmds干燥两种模式下，胶原纤维内均可见大量晶体存在，而纤维外的矿物质被脱矿除去，留下大量间隙，通过原子力显微镜(afm)观察到ip6-pamam-nh2处理过后的牙本质表面在干燥状态下粗糙度更大，以上证明该聚合物处理牙本质在干燥条件下实现了选择性胶原纤维外脱矿，因此可以与临床干粘接技术联合使用；基于纤维外脱矿理念，在牙本质脱
矿过程中，保留了纤维内的矿物质，避免了mmp的暴露，进一步避免了mmp激活引起的胶原纤维酶解；上述结果均表明ip6-pamam-nh2处理牙本质，避免了传统酸蚀技术导致的牙本质粘接界面结构塌陷，从根本上杜绝了混合层薄弱区域的发生，提高了牙本质粘接耐久性(见实例3、实例4、实例5)。
[0034]
(3)本发明所述的ip6-pamam-nh2处理牙本质表面亦实现了抗菌作用(见实例6)。
[0035]
(4)本发明所述的ip6-pamam-nh2制备简单，原材料易得，设备常规，工业化生产易于实现。
附图说明
[0036]
图1是本发明所述的ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)的结构式示意图；
[0037]
图2是本发明所述的ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)的合成路线示意图；
[0038]
图3是实施例1制备的ip6-pamam-nh2聚合物的红外光谱图；
[0039]
图4是实施例1制备的ip6-pamam-nh2聚合物的hplc分析图谱；
[0040]
图5-1，5-2是实施例1制备的ip6-pamam-nh2聚合物的核磁氢谱及核磁碳谱示意图；
[0041]
图6是实施例2中选出的最佳ip6-pamam-nh2浓度和对照组磷酸组及1％植酸组在干湿粘接两种模式下的微拉伸粘接强度对比图；
[0042]
图7-1，图7-2是实施例3中用50mg/ml ip6-pamam-nh2预处理牙本质表面30秒后空气干燥和六甲基二硅胺(hmds)干燥两种条件下的扫描电镜图像，35％磷酸处理牙本质表面15s作为对照组；
[0043]
图8是实施例4中用磷酸和ip6-pamam-nh2预处理牙本质表面后空气干燥下的牙本质表面的3d形貌图；
[0044]
图9是实施例4中对磷酸和ip6-pamam-nh2处理牙本质后的表面粗糙度进行定量绘制的柱状对比图(a/b表示有无统计学差异)；
[0045]
图10是实施例5中不同预处理剂制备的牙本质脱矿样本用dq明胶做基质金属蛋白酶(mmp)底物孵育48h后的代表性荧光表现激光共聚焦图像；
[0046]
图11是实施例5中对不同组脱矿层内绿色荧光进行定量分析后绘制的柱状对比图；
[0047]
图12是实施例6中在牙本质片表面培养两种致龋细菌生物膜之后用pbs、1％植酸溶液和ip6-pamam-nh2分别作用30s后进行活死细菌染色采集得到的激光共聚焦(clsm)荧光代表图像；
[0048]
图13是实施例6中不同组处理剂作用在不同致龋细菌生物膜上的活死细菌比值柱状图(a\b\c代表是否有统计学差异)；
[0049]
图14是实施例7中不同浓度的ip6-pamam-nh2与体外培养的人牙髓细胞共培养72小时的细胞成活率，与1％ip6及pbs进行对比。
具体实施方式
[0050]
下面通过实施例对本发明本发明所述ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法与应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
[0051]
下述实施例1中所使用的ip6购买自上海麦克林生化科技有限公司，其结构式如下所示
[0052][0053]
下述实施例1中，所采用的第5代端基为氨基的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备是以乙二胺为初始核心，通过与过量的丙烯酸甲酯进行michael加成反应，得到0.5代的pamam树状大分子；然后将0.5代产物与过量的乙二胺进行酰胺化反应，得到1.0代的pamam树状大分子；如此通过不断重复michael加成反应和酰胺化反应得到。
[0054]
以下实施例试剂浓度的百分数均为质量百分数。
[0055]
实施例1
[0056]
本实施例所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)的制备方法，植酸修饰的第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的合成路线如下所示：
[0057][0058]
具体制备方法如下：
[0059]
(1)端基为氨基的第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物(g5-pamam)的制备
[0060]
①
0.5代pamam的合成
[0061]
取0.15mol乙二胺于圆底烧瓶中，加入1mol甲醇，通入氮气，在冰水浴中搅拌混合均匀，然后缓慢滴加1.2mol丙烯酸甲酯到圆底烧瓶中，边搅拌边滴加(一秒一滴)，滴加完毕后再在25℃下继续反应24h，反应完毕后对产物进行减压蒸馏，除去溶剂和丙烯酸甲酯后得到淡黄色透明液体，为g0.5-pamam。
[0062]
②
1代pamam的合成
[0063]
取0.05mol上步反应得到的g0.5-pamam于圆底烧瓶中，加入2mol甲醇，通入氮气，在冰水浴中搅拌混合均匀，然后缓慢滴加1.2mol乙二胺到圆底烧瓶中，边搅拌边滴加(一秒一滴)，滴加完毕后再在25℃下持续反应24h，反应完毕后减压蒸馏，除去溶剂及过量乙二胺，得到淡黄色粘稠液体，为g1-pamam。
[0064]
然后以合成的g1-pamam为原料，增大丙烯酸甲酯的用量，按照步骤
①
的方法合成g1.5-pamam，其中g1-pamam：丙烯酸甲酯的摩尔比为1:16；再以合成的g1.5-pamam为原料，增大乙二胺的用量，按照步骤
②
的方法合成合成g2-pamam，其中g1.5-pamam：乙二胺的摩尔比为1:48。按上述方法逐步倍数增大丙烯酸甲酯和乙二胺的投料，交替重复michael加成反应与酰胺化反应，直至得到g5-pamam。
[0065]
按上述比例逐渐投料，交替重复上述michael加成反应与酰胺化反应，直至得到g5-pamam。
[0066]
(2)带保护基团的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备
[0067]
以第五代pamam和氯甲酸-9-芴基甲酯(fmoc-c1)为原料，在二氯甲烷，碳酸氢钠及水的作用下在25℃反应2h，得到fmoc保护的第五代pamam，其中(fmoc-c1)：第五代pamam：碳酸氢钠的摩尔比为1:1:3，二氯甲烷：水的体积比为5:1。
[0068]
(3)带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备
[0069]
①
称取100mg fmoc保护的第五代pamam溶解于1.5ml二甲基乙酰胺(dmf)与0.5ml二甲基亚砜(dmso)的混合溶剂中,搅拌均匀，温度控制为-12℃，得到溶液最后浓度为0.05g/ml，记为混合物1。
[0070]
②
将146mg植酸溶解于9ml dmf，22.5mg三乙胺(tea)和67.6mg甲基吗啉的混合溶液中,并缓慢加入46mg二环己基碳二亚胺(dcc)和33.8mg1-羟基苯并三唑(hobt)混合溶解在一起，搅拌均匀，记为混合物2。
[0071]
③
将混合物1的温度缓慢升高到27℃，并缓慢滴加混合物2。
[0072]
④
混合物2滴加结束1小时后，每隔0.5小时采用fmoc(9-芴甲氧羰基)基团测定法逐步检测pamam的基团数量，植酸接枝数量控制在64(即第五代pamam与植酸的摩尔比比是1:64)。
[0073]
⑤
待pamam的基团全部反应后，将反应体系在0℃下缓慢停止搅拌并静止放置，放置3小时后，在真空条件下蒸馏浓缩，使溶液越少越好。
[0074]
⑥
蒸馏完毕后，加入石油醚(pet)结晶，过滤取晶体部分，所得晶体经乙酸乙酯(eac)溶解后，再次加入pet结晶淋洗处理，干燥即可得带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
[0075]
(3)去保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备
[0076]
将上述(2)中所得带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶解于甲
醇中，缓慢加入哌啶，搅拌均匀，在25℃氩气保护下反应2小时，即得植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。其中带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物：哌啶摩尔比1:2。
[0077]
实施例2
[0078]
本实施例中，测定本发明所合成的ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)作为牙本质粘接前处理剂在牙本质粘接模型上的螯合脱矿效果和作用时间，以评价其在“干粘接”和“湿粘接”两种技术条件下对牙本质粘接强度的影响。
[0079]
①
将实施例1中制备的ip6-pamam-nh2聚合物样品溶解于去离子水中，配制成不同浓度的ip6-pamam-nh2水溶液，浓度分别设置为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml和60mg/ml。
[0080]
②
取新鲜离体的人第三磨牙，使用精密金相切割机制取厚度约为2.5-3mm的牙本质厚片，使用粒度为600的碳化硅金相研磨砂纸打磨牙本质表面约1分钟制造玷污层，分组后分别用上述不同浓度的ip6-pamam-nh2溶液处理各组牙本质表面，每组作用时间分别为15秒、30秒和60秒，同时设置对照组，以35％磷酸处理15秒作为对照组，如此建立树脂-牙本质粘接模型，制成1mm*1mm*8mm的粘接样本，将粘接样本用502胶水(α
‑‑
氰基丙烯酸乙酯胶水)固定在特制的夹具上，保证每个样本的树脂-牙本质界面位于棒的中间，通过万用拉伸试验机以1mm/min的速度进行拉伸试验，记录树脂-牙本质粘接面破坏时的拉伸最大力，并除以粘接截面面积，得到每个粘接条的拉伸强度(mpa)。结果表明50mg/ml的ip6-pamam-nh2溶液处理牙本质30s的平均粘接强度与磷酸组相当。
[0081]
③
随后用50mg/ml的ip6-pamam-nh2溶液处理牙本质30s进行“干、湿粘接”试验，以35％磷酸处理15秒和1％ ip6处理30秒作为对照组。
[0082]
实验结果如图6所示，结果表明实验组在“干湿”粘接条件下无统计学差异，而磷酸及ip6组“干粘接”组粘接强度显著低于其“湿粘接”组，实验结果表明经过ip6-pamam-nh2预处理的牙本质在“干粘接”状态下可实现较强的粘接强度。
[0083]
实施例3
[0084]
本实施例中，测定本发明所述ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)处理牙本质表面30秒后，用扫描电镜观察经六甲基二硅氮烷(hmds)干燥和空气干燥两种脱水条件下牙本质表面胶原基质形貌，以35％磷酸处理牙本质15秒为对照组。
[0085]
选择实施例2中经微拉伸粘接测试获得的实验浓度50mg/ml的ip6-pamam-nh2溶液处理牙本质片30s，通过对牙本质片不同的脱水方法(hmds干燥和空气干燥)来模拟干湿粘接。
[0086]
具体操作步骤如下：
[0087]
hmds组：将实验组和对照组样本使用5wt％的戊二醛溶液固定4小时，然后通过依次在不同浓度的乙醇序列中(70wt％，80wt％，95wt％和100wt％，各45分钟)脱水，脱水之后的样本浸泡到上升的极性六甲基二硅氮烷(hmds)-乙醇溶液中(50wt％，70wt％和100wt％，各1小时)。
[0088]
空气组：将实验组和对照组样本放置在干燥器中干燥24小时。
[0089]
脱水完毕后的样本使用扫描电镜观察牙本质表面基质情况，如图7-1、图7-2所示，实验结果表明，50mg/ml ip6-pamam-nh2溶液处理的牙本质比35％磷酸处理的脱矿牙本质
具有较少的脱矿基质。在hmds脱水和空气干燥两种模式下50mg/ml ip6-pamam-nh2溶液处理后的脱矿牙本质表面均可以观察到胶原纤维未塌陷且存在孔隙结构。说明本发明所述ip6-pamam-nh2保留了纤维内的矿物质，可有效避免胶原纤维在干燥状态下发生塌陷，证明了本发明牙本质胶原纤维外脱矿技术能够与技术敏感性低、操作便捷的干粘接技术在临床上联合使用。
[0090]
实施例4
[0091]
本实施例中，测定本发明所述ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合(ip6-pamam-nh2)处理牙本质表面30秒后的表面形貌3d图及表面粗糙度。
[0092]
将实施例1制备的ip6-pamam-nh2聚合物用去离子水配制成浓度为50mg/ml的水溶液。将新鲜离体人类磨牙在金相切割机上制成1mm厚的牙本质薄片，每个样品依次用粒度为600、800、1000、1200、1500、2000、5000和7000的湿碳化硅金相砂纸分别打磨1分钟，然后再分别使用w1和w0.5的金刚石研磨抛光膏抛光1分钟，以获得牙本质平坦的表面形貌，超声震荡清洁样本，随后用50mg/ml ip6-pamam-nh2溶液处理30秒，以35％磷酸处理15秒作为对照组，在真空干燥器中完全脱水，在原子力显微镜(afm)下观察表面形貌，进行粗糙度定量分析，结果如图8所示，图9所示。实验结果表明ip6-pamam-nh2处理的牙本质在干燥状态下表面粗糙度明显大于磷酸处理组，证明在干燥状态下ip6-pamam-nh2处理的牙本质胶原纤维呈直立蓬松的状态，而磷酸处理组胶原纤维呈塌陷状态。
[0093]
实施例3和实施例4实验结果均表明，本发明所述ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物可以结合干粘接技术应用于牙本质粘接领域中。
[0094]
实施例5
[0095]
本实施例中，测定本发明所述ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)处理牙本质表面后脱矿牙本质层的mmps活性。
[0096]
①
取新鲜离体人类磨牙，在精密金相切割机上切取厚度约为1mm的牙本质薄片，将牙本质薄片使用α-氰基丙烯酸乙酯胶水固定在干燥的载玻片上，600、800、1000、1200、1500、2000、5000和7000的湿碳化硅金相砂纸在金相研磨机上将牙本质片打磨抛光至厚度约为100μm，磨抛过程辅以冷水降温。
[0097]
②
用50mg/ml ip6-pamam-nh2溶液处理牙本质片表面30秒，以35％磷酸处理15秒和1％ip6溶液处理30秒作为对照组，三用气枪水汽同开20秒冲洗掉处理剂，用无菌pbs缓冲液处理牙本质作为空白对照。
[0098]
③
将自淬灭荧光共轭明胶用作人工基质，标记脱矿牙本质层内的胶原酶活性位点。首先将1mg/ml的自淬灭荧光共轭明胶原液、抗褪色剂和稀释缓冲液(ph8.0)按照1:1:8的比例混合稀释，然后用混合液处理牙本质表面，盖玻片覆盖，封闭盖玻片边缘，将玻片置于温度37℃，湿度100％的避光孵箱中孵育48小时后，通过激光共聚焦显微镜(clsm)观察，实验结果如图10所示，胶原酶活性定量柱状图如图11所示。
[0099]
结果表明经ip6-pamam-nh2溶液处理的脱矿牙本质，其牙本质内胶原蛋白酶活性明显低于磷酸和ip6处理组，证明本发明所述ip6-pamam-nh2处理牙本质保留了纤维内的矿物质，使胶原内源性基质蛋白酶仍被包埋，避免了胶原被降解，提高了树脂-牙本质粘接耐久性。
[0100]
实施例6
[0101]
本实施例中，测定本发明所述ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)溶液对生长于牙本质表面两种致龋细菌生物膜活性的抑制能力。
[0102]
①
选取变异链球菌atcc700610和粪肠球菌atcc29212作为检测菌种，复苏菌种后，划线接种至bhi平板琼脂培养基表面，培养完成后挑取单个菌落接种至20ml灭菌bhi液体培养基中于恒温孵箱中培育16-18小时；
[0103]
②
制取厚度约为1mm牙本质薄片，灭菌干燥后置于24孔板中，加入100μl步骤
①
中的菌液及1000μl含1％蔗糖的bhi液体培养基，于恒温恒湿(37℃，100％湿度)孵箱中共培养24小时。取出孵箱内24孔板，移液枪吸去孔板中游离菌液后，用无菌去离子水轻轻漂洗牙本质表面生物膜，洗去浮游细菌，无菌敷料吸走多余液体，不碰触牙本质片表面。
[0104]
③
实验组牙本质片表面滴加30μl 50mg/ml的ip6-pamam-nh2溶液，对照组表面同体积无菌蒸馏水或1％ip6溶液处理，静置30秒后无菌去离子水轻轻冲去表面液体，无菌滤纸片从边缘处吸干水分。将l-7012细菌活力试剂盒中的a、b组分等体积混合，无菌去离子水稀释至10％，混匀，吸取约8-10μl染液均匀置于牙片表面，黑暗环境下孵育15分钟后，通过激光共聚焦扫描显微镜观察，实验结果如图12所示，结果表明经ip6-pamam-nh2处理的牙本质表面生物膜表现出大量的死菌相较对照组，定量分析活死菌比如图13所示，结果显示ip6-pamam-nh2抗菌效果最好。
[0105]
实施例7
[0106]
本实施例中，测定本发明所述ip6修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(ip6-pamam-nh2)溶液在不同浓度下对体外培养的人牙髓细胞的细胞活力影响。
[0107]
①
选用新鲜拔除的正畸减数牙或者第三磨牙，提取原代人牙髓细胞，体外培养至第三代或第四代，当细胞密度达到80％时，用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，采用cck-8法进行细胞毒力测试。
[0108]
②
将收集到的细胞用完全培养基稀释，计数，并接种到96孔板中，每孔内的细胞密度控制约为103个/cm
2，
然后将96孔板放入恒温孵箱中培养24小时至细胞贴壁生长。24小时后，向孔板中加入10μl待测物质。
[0109]
③
本实施例中的待测物质为不同浓度的ip6-pamam-nh2溶液，实验浓度梯度设置为20mg/ml，30mg/ml，40mg/ml和50mg/ml，并以1％ ip6溶液作为待测对照组，每组待测物质用0.22μm的无菌纤维素滤过器过滤细菌，无菌pbs缓冲液作为空白对照，设置6个平行样。
[0110]
④
加入相应的待测物质后，将96孔培养板放入恒温孵箱中继续培养72小时后，每孔中加入10μl cck-8溶液并继续在恒温培养箱中避光培养4小时，随后用酶标仪测量培养板每孔液体在450nm波长处的od值。
[0111]
⑤
细胞活力＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]*100％，其中：a(加药)指具有细胞、cck-8溶液和药物溶液的孔的吸光度；
[0112]
a(空白)指具有培养基和cck-8溶液而没有细胞的孔的吸光度；
[0113]
a(0加药)则指具有细胞、cck-8溶液、空白对照pbs缓冲液的孔的吸光度。
[0114]
实验结果如图14所示，结果表明ip6-pamam-nh2溶液对体外培养的人牙髓细胞毒性很低，证明该聚合物具有良好的生物相容性。

技术特征：
1.一种植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，其特征在于，其结构式示意图如下：所述结构式中，n代表接枝植酸的数量，n＝60～70，优选地，n＝64。2.权利要求1所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下内容：(1)带保护基团的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备以端基为氨基的第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物和氯甲酸-9-芴基甲酯为原料，在二氯甲烷，碳酸氢钠及水的作用下，于室温反应2～4h，得到fmoc(9-芴甲氧羰基)保护的g5-pamam；(2)带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备将fmoc保护的g5-pamam溶解二甲基乙酰胺与二甲基亚砜的混合溶剂中，得到混合物1；将植酸溶解于dmf、三乙胺和甲基吗啉的混合溶液中，并缓慢加入二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑混合溶解，搅拌均匀，得到混合物2；将混合物1的缓慢升高到25～30℃，缓慢滴加混合物2，滴加结束1小时后，每隔0.5小时通过采用fmoc基团测定法检测剩余fmoc基团的数量来控制植酸接枝数量为60～70；反应完成后，降温至0℃，缓慢停止搅拌，静置2～4小时，然后浓缩，联合采用石油醚和乙酸乙酯进行结晶和重结晶，干燥，得到带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；(3)去掉保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备将所得带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶解于甲醇中，缓慢加入哌啶，其中带保护基团的植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物：哌啶的摩尔比为1:2，搅拌均匀，在25℃氩气保护下反应2小时，即得植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物ip6-pamam-nh2。3.根据权利要求2所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中fmoc-c1：g5-pamam：碳酸氢钠的摩尔比为1:1:3，二氯甲烷：水的体积比为5:1。4.根据权利要求2所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中混合物1的配制中，二甲基乙酰胺与二甲基亚砜的体积比为3:1，并在-12℃下溶解fmoc保护的g5-pamam。5.根据权利要求2所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)混合溶液2的配制中，植酸：dmf:(tea+甲基吗啉+dcc+hobt的质量之和)的质量比为1:58:1.2；其中tea:甲基吗啉的质量比为1:3，dcc：hobt的质量比为7:5。
6.根据权利要求2所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中fmoc保护的g5-pamam：植酸的摩尔比为1:(60～70)。7.根据权利要求2所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法，其特征在于，所述端基为氨基的第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物通过分散法合成，包括以乙二胺为初始核心，与丙烯酸甲酯通过michael加成反应，再与乙二胺通过酰胺化反应，如此交替反复反应得到。8.根据权利要求7所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法，其特征在于，所述端基为氨基的第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的合成包括以下步骤：
①
0.5代pamam的合成将乙二胺与甲醇在氮气氛围、冰水浴中混合均匀，滴加丙烯酸甲酯，滴加结束在室温下反应24h，其中乙二胺：丙烯酸甲酯的摩尔比为1：8反应结束除去溶剂和过量丙烯酸甲酯，得到淡黄色透明液体，为g0.5-pamam；
②
1代pamam的合成将g0.5-pamam与甲醇在氮气氛围、冰水浴中混合均匀，滴加乙二胺，滴加完毕后在室温下反应24h，其中g0.5-pamam：乙二胺的摩尔比为1：24，除去溶剂及过量乙二胺，得到淡黄色粘稠液体，为g1-pamam；然后以合成的g1-pamam为原料，增大丙烯酸甲酯的用量，按照步骤
①
的方法合成g1.5-pamam，其中g1-pamam：丙烯酸甲酯的摩尔比为1:16；再以合成的g1.5-pamam为原料，增大乙二胺的用量，按照步骤
②
的方法合成合成g2-pamam，其中g1.5-pamam：乙二胺的摩尔比为1:48。9.根据权利要求8所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备方法，其特征在于，按上述方法逐步倍数增大丙烯酸甲酯和乙二胺的投料，交替重复michael加成反应与酰胺化反应，直至得到g5-pamam。10.权利要求1所述植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物作为牙本质粘接领域中的应用。

技术总结
本发明公开了植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物及其制备方法和应用。本发明利用植酸修饰改性PAMAM-NH2，通过简单的方法制备植酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(IP6-PAMAM-NH2)，其作为一种新型牙本质处理剂应用于酸蚀-冲洗粘接体系中，不仅能实现快速而强效的选择性胶原纤维外脱矿，而且能达到符合临床要求的粘接强度，对基质金属蛋白酶(MMPs)酶活性具有抑制作用，且具备良好的抑菌性能，既避免了传统酸蚀技术导致的粘接界面结构完整性被破坏，又解决了现有牙本质钙离子螯合剂所面临的的溶解性差、螯合能力弱、脱矿时间长等问题，进而提高牙本质粘接耐久性。进而提高牙本质粘接耐久性。


技术研发人员：苟雅萍 李静 尉莹莹 杨珍 张娟娟 冯梅 刘明鑫
受保护的技术使用者：兰州大学
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/7/21