结直肠癌类器官药敏评价和预后预测系统、方法及设备

1.本发明属于药物敏感性检测技术领域，尤其涉及一种结直肠癌类器官药敏评价和预后预测系统、方法及设备。


背景技术：

2.目前，结直肠癌是全球癌症相关死亡的第二大原因，其5年相对生存率为65％。对现有疗法的耐药仍然是疾病进展和结直肠癌相关死亡的主要原因。目前，氟尿嘧啶联合奥沙利铂方案是结直肠癌的一线治疗方案，其客观缓解率仅为20～40％。然而，目前临床没有药敏检测在用药前来预测个体患者的治疗疗效。
3.在结直肠癌诊疗中tnm分期系统和一些组织病理学因素，包括肿瘤分级和组织学类型是当前临床最广泛运用的预后预测方法。tnm分期系统通过评估原发灶(t)、淋巴结受累(n)和远处转移情况(m)对肿瘤进行评估和分期，进而预测预后。但是tnm分期系统仍具有一定的局限性：即便是相同分期的患者，在接受相似的治疗方案后，其临床结局也差异很大。在结直肠癌的预后预测方面，如何进一步区分和提高预后预测能力，还有待进一步研究和补充。
4.类器官是干细胞来源的3d培养系统，它可以保持来源组织的组织学特性和基因组学稳定性，有用于预测患者治疗反应的潜能。
5.目前类器官药敏评价方法中，使用较多的是纳入少量病人或缺乏临床反应验证的整体评价。主要分析方法为：根据患者临床疗效将所有对应样本类器官分为有反应组和无反应组，整体对比有反应组和无反应组的药敏结果(最大半抑制浓度ic
50
值)，当有反应组的ic
50
值小于无反应组时即认为类器官可以反应患者治疗反应。该方法依然从整体角度出发分析类器官药敏反应和患者临床反应的相关性而缺乏了个体化应用，且类器官药敏ic
50
的界值是未定义的。也就是说，对个体患者而言，类器官药敏ic
50
值达到多少时才是有效的仍然保持未知。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：一方面，tnm分期系统中相同分期的患者在接受相似的治疗方案后其临床结局也差异很大；另一方面，现有类器官药敏评价方法仍从整体角度出发而无法直接、个体化预测临床反应。如何进一步区分和提高预后预测能力，还有待进一步研究和补充以及对个体患者而言，类器官药敏ic
50
值达到多少时才是有效的仍然保持未知。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种结直肠癌类器官药敏评价系统，所述结直肠癌类器官药敏评价系统包括：
8.标准建立模块，用于建立类器官药敏评价标准，基于药敏评价标准区分化疗敏感性和非敏感性；
9.标准验证模块，用于对建立类器官药敏评价标准进行验证。
10.进一步，所述标准建立模块包括：
11.药敏标准确定单元，用于药敏评价标准的确定；
12.患癌标准区分单元，用于结直肠癌患者药敏性的区分。
13.进一步，所述标准验证模块包括：
14.样本准备单元，用于对标本进行取样，并对样本进行储存并送往实验室；
15.类器官培养单元，用于对肿瘤组织进行样本处理并对其进行培养；
16.药物检测单元，用于基于类器官培养成功后对类器官进行加药处理，测定细胞活力值以评估药物敏感性；
17.临床治疗单元，用于采用folfox方案新辅助化疗；
18.临床随访单元，用于定期的为患者进行检查一次胸部和腹部的增强ct；
19.进一步，所述标准建立模块包括：
20.类器官耐药定义单元，用于当对应类器官药敏ic
50
值高于43.26μmol/l时，定义为类器官耐药；
21.类器官敏感定义模块，用于当对应类器官药敏ic
50
值低于43.26μmol/l，定义为类器官敏感；
22.定义界值模块，用于区分化疗敏感性和非敏感性，预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.36％，95％ci：63.16～82.89％；74.68％，95％ci：61.11～81.94％；75％，95％ci：65.54～80.41％；72.22％，95％ci：66.25～81.82％；和77.63％，95％ci：64.56～80.56％。
23.进一步，所述样本准备单元包括：
24.标本取样子单元，用于手术标本离体30min内对肿瘤组织进行取样并送往实验室；
25.样本储存子单元，用于，在运输前，将样本在4℃下储存在rpmi 1690中，并添加5％青霉素-1-链霉素，青霉素-1-链霉素的添加用于预防样本存储时微生物污染。
26.进一步，所述类器官培养单元包括：
27.肿瘤组织预处理子单元，用于将新鲜肿瘤组织在含有5％抗生素的10ml平衡盐溶液中洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小；
28.肿瘤组织消化处理子单元，用于将切碎后的组织置于5ml胶原酶ii型dmem/f12中，并将切碎后的肿瘤组织充分混匀后放置于振荡器于37℃下消化3h；
29.去除红细胞子单元，用于将消化后的组织通过100μm滤网进行过滤，将过滤得到的悬浮液以1200g离心2min，并通过加入红细胞裂解缓冲液除去红细胞；
30.类器官构造子单元，用于将肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶和类器官培养基的混合物中；将30μl混合物胶滴铺在24孔细胞培养板中并在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10min以硬化matrigel胶；matrigel胶硬化后，将相应的培养基加入到每个培养孔中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育。
31.进一步，所述药物检测子单元，包括：
32.类器官解离铺板子单元，用于类器官培养成功后，使用1x tryple从基质胶中收获类器官，机械解离成小簇；将类器官重悬于2％200～1000簇/ml的基质胶/类器官培养基中，并将类器官均匀铺板于384孔板中；
33.加药处理子单元，用于在铺板48h后将对应药物和对照组加入384孔细胞培养板；
34.测定细胞活力子单元，用于药物暴露96h后，使用celltiter-glo 3d细胞活力检测试剂盒测定细胞活力，并根据对照组将结果标准化；
35.评估药物敏感性子单元，用于使用graphpadprism 7.0分析数据，使用非线性回归方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度值，以ic
50
值大小评估药物敏感性。
36.进一步，加药处理子单元包括：
37.第一稀释子单元，用于化疗药物浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
38.第二稀释子单元，用于靶向药物浓度在3μmol/l至0.01236μmol/l，采用3倍稀释的6个浓度梯度；
39.第三稀释子单元，用于联合方案以1：1的比例加入相应的药物，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度。
40.本发明的另一目的在于提供一种基于所述结直肠癌类器官药敏评价系统的结直肠癌类器官药敏评价方法，所述结直肠癌类器官药敏评价方法包括以下步骤：
41.建立类器官药敏评价标准，基于药敏评价标准区分化疗敏感性和非敏感性；
42.对建立类器官药敏评价标准进行验证。
43.本发明的另一目的在于提供一种计算机设备，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述计算机程序被所述处理器执行时，使得所述处理器执行所述的结直肠癌类器官药敏评价方法。
44.结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
45.第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
46.本发明通过纳入临床大队列数据并将个体患者临床反应和对应类器官药敏反应结合分析，构建受试者工作曲线(roc)得出类器官药敏ic
50
的界值。对个体患者而言，当对应类器官药敏ic
50
大于该界值时，定义为类器官耐药，当对应类器官药敏ic
50
小于该界值时，定义为类器官敏感。将在该界值的基础上得出的类器官药敏反应和临床反应进行一对一验证得出该类器官药敏检测定义的界值预测患者化疗疗效的敏感性、特异性、准确性、阴性预测值以及阳性预测值。
47.本发明通过对结直肠癌进行类器官培养及药敏检测，将得出的药敏ic
50
值与我们定义的界值进行对比，从而直接评价个体患者的类器官药敏反应，该反应能预测患者化疗反应，且与预后相关，该类器官药敏ic
50
界值的确定弥补了目前临床缺乏在化疗前进行药物检测的空白，且作为tnm分期系统预测预后的补充，为临床诊疗提供参考。
48.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
49.本发明能够定量、直接、个体化对结直肠癌类器官药敏结果进行分析，定义的ic
50
界值可有效区分化疗敏感或不敏感的结直肠癌患者，并预测生存获益。
50.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
51.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
52.类器官模型属于一种新兴技术，我国对类器官模型及药敏实验的研究仍处于起步阶段，本发明的技术方案转化后将形成标准化类器官药敏检测体系并明确界定药敏ic
50
的界值，推动类器官的临床转化应用，提升我们的类器官药敏技术在国内外的核心竞争力，本发明将有可能率先在国内外制定类器官药敏标准，基于该标准可进行临床产学研转化，从而产生一定的经济效益；此外，抗胃肠癌药物市场发展前景十分广阔，然而目前个体化治疗缺乏肿瘤药敏实验，常规临床前模型难以满足个体化需求，而类器官模型在新药研发、药敏实验具有巨大潜力，本发明面向结直肠癌药敏实验，构建类器官药敏检测标准体系，可应用于肿瘤新药开发、药筛等多种医疗领域，对结直肠癌患者具有良好的社会效益。
53.(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
54.作为一种新兴技术，目前类器官模型在国内的研究仍处于起步阶段，直接界定类器官药敏ic
50
为敏感还是耐药的界值仍保持未知，且国内外均未见相关研究。
55.(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
56.结直肠癌的肿瘤异质性巨大，不同患者的临床预后千差万别，现有的肿瘤tnm分期系统对患者预后预测能力有限，本发明利用类器官药敏实验界定了药敏评价标准并进一步提高了患者的预后预测准确性。
附图说明
57.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
58.图1是本发明实施例提供的类器官培养动态过程代表图；
59.图2是本发明实施例提供的类器官药敏检测示意图；
60.图3是本发明实施例提供的类器官药敏标准的建立的roc曲线示意图；
61.图4是本发明实施例提供的基于确定ic
50
界值定义的类器官药敏反应与iv期结直肠癌患者预后的相关性示意图；
62.图5是本发明实施例提供的基于确定ic
50
界值定义的类器官药敏反应与ii/iii期结直肠癌患者预后的相关性示意图；
63.图6是本发明实施例提供的结直肠癌类器官药敏评价系统的原理图。
具体实施方式
64.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
65.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种结直肠癌类器官药敏评价标准和预后预测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
66.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
67.如图6所示，本发明实施例提供的结直肠癌类器官药敏评价系统包括：
68.标准建立模块，用于建立类器官药敏评价标准，基于药敏评价标准区分化疗敏感性和非敏感性；
69.标准验证模块，用于对建立类器官药敏评价标准进行验证。
70.标准建立模块包括：
71.药敏标准确定单元，用于药敏评价标准的确定；
72.患癌标准区分单元，用于直肠癌患药敏性的区分。
73.标准验证模块包括：
74.样本准备单元，用于对标本进行取样，并对样本进行储存并送往实验室；
75.类器官培养单元，用于对肿瘤组织进行样本处理并对其进行培养；
76.药物检测单元，用于基于类器官培养成功后对类器官进行加药处理，测定细胞活力值以评估药物敏感性；
77.临床治疗单元，用于采用folfox方案新辅助化疗；
78.临床随访单元，用于定期的为患者进行检查一次胸部和腹部的增强ct；
79.进一步，所述标准建立模块包括：
80.类器官耐药定义单元，用于当对应类器官药敏ic
50
值高于43.26μmol/l时，定义为类器官耐药；
81.类器官敏感定义模块，用于当对应类器官药敏ic
50
值低于43.26μmol/l，定义为类器官敏感；
82.定义界值模块，用于区分化疗敏感性和非敏感性，预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.36％，95％ci：63.16～82.89％；74.68％，95％ci：61.11～81.94％；75％，95％ci：65.54～80.41％；72.22％，95％ci：66.25～81.82％；和77.63％，95％ci：64.56～80.56％。
83.样本准备单元包括：
84.标本取样子单元，用于手术标本离体30min内对肿瘤组织进行取样并送往实验室；
85.样本储存子单元，用于，在运输前，将样本在4℃下储存在rpmi 1690中，并添加5％青霉素-1-链霉素，青霉素-1-链霉素的添加用于预防样本存储时微生物污染。
86.类器官培养单元包括：
87.肿瘤组织预处理子单元，用于将新鲜肿瘤组织在含有5％抗生素的10ml平衡盐溶液中洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小；
88.肿瘤组织消化处理子单元，用于将切碎后的组织置于5ml胶原酶ii型dmem/f12中，并将切碎后的肿瘤组织充分混匀后放置于振荡器于37℃下消化3h；
89.去除红细胞子单元，用于将消化后的组织通过100μm滤网进行过滤，将过滤得到的悬浮液以1200g离心2min，并通过加入红细胞裂解缓冲液除去红细胞；
90.类器官构造子单元，用于将肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶和类器官培养基的混合物中；将30μl混合物胶滴铺在24孔细胞培养板中并在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10min以硬化matrigel胶；matrigel胶硬化后，将相应的培养基加入到每个培养孔中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育。
91.药物检测子单元，包括：
92.类器官解离铺板子单元，用于类器官培养成功后，使用1x tryple从基质胶中收获类器官，机械解离成小簇；将类器官重悬于2％200～1000簇/ml的基质胶/类器官培养基中，并将类器官均匀铺板于384孔板中；
93.加药处理子单元，用于在铺板48h后将对应药物和对照组加入384孔细胞培养板；
94.测定细胞活力子单元，用于药物暴露96h后，使用celltiter-glo 3d细胞活力检测试剂盒测定细胞活力，并根据对照组将结果标准化；
95.评估药物敏感性子单元，用于使用graphpadprism 7.0分析数据，使用非线性回归方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度值，以ic
50
值大小评估药物敏感性。
96.加药处理子单元包括：
97.第一稀释子单元，用于化疗药物浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
98.第二稀释子单元，用于靶向药物浓度在3μmol/l至0.01236μmol/l，采用3倍稀释的6个浓度梯度；
99.第三稀释子单元，用于联合方案以1：1的比例加入相应的药物，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度。
100.本发明实施例提供的结直肠癌类器官药敏评价方法具体包括以下步骤：
101.建立类器官药敏评价的标准；其中，建立类器官药敏评价的标准包括药敏评价标准的确定以及区分结直肠癌患者的药敏性；
102.药敏评价标准的确定：对类器官敏感性进行定义；
103.区分结直肠癌患者的药敏性：基于所述药敏评价标准的确定的前提下，进行区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者；
104.药敏评价标准的验证：基于建立类器官药敏评价的标准的前提下，验证不同分期的结直肠癌患者的药物敏感性；
105.其中，药敏评价标准的验证包括样本准备、类器官培养、药物检测、临床治疗以及临床随访；
106.样本准备：对标本进行取样，并对样本进行储存并送往实验室；
107.类器官培养：对肿瘤组织进行样本处理并对其进行培养；
108.药物检测：基于类器官培养成功后对类器官进行加药处理，测定细胞活力值以评估药物敏感性；
109.临床治疗：对不同分期的结直肠患者进行术后化疗；
110.临床随访：定期的为患者进行检查一次胸部和腹部的增强ct。
111.本发明实施例提供的药敏评价标准的确定主要包括：
112.s1、临床反应定义，将临床中的化疗有反应定义为cr/pr、trg 0至1级或cea水平降低，而无反应被定义为sd/pd、trg 2至3级或cea水平升高；
113.s2、得出个体患者的临床治疗反应，iv期结直肠癌患者经过临床随访后得出个体患者的临床治疗反应，中位随访时间为12个月；
114.s3、根据个体患者临床治疗反应和对应类器官药敏反应ic
50
值绘制受试者工作曲线(roc)，该roc曲线得出folfox方案的最佳ic
50
截止值为43.26μmol/l；
115.s4、对于个体患者，当其对应类器官药敏ic
50
值高于43.26μmol/l时，定义其为类器
官耐药，当其对应类器官药敏ic
50
值低于43.26μmol/l，定义其为类器官敏感。
116.本发明实施例提供的区分结直肠癌患者的药敏性包括以下步骤：
117.s1、类器官反应定义，基于所述药敏评价标准的确定所得，72个类器官被归为敏感，76个类器官被归为耐药，一对一对比临床反应和类器官反应以评估该定义的界值预测化疗反应的能力；
118.s2、区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者，该界值用于预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.36％(95％ci：63.16～82.89％)、74.68％(95％ci：61.11～81.94％)、75％(95％ci：65.54～80.41％)、72.22％(95％ci：66.25～81.82％)和77.63％(95％ci：64.56～80.56％)。
119.本发明实施例提供的样本准备主要包括：
120.s1、标本取样，手术标本离体30分钟内对肿瘤组织进行取样，并及时将样本送往实验室；
121.s2、样本储存，在运输前，将样本在4℃下储存在rpmi 1690中，并添加5％青霉素-1-链霉素，青霉素-1-链霉素的添加用于预防样本存储时微生物污染。
122.本发明实施例提供的类器官培养主要包括：
123.s1、肿瘤组织预处理，将新鲜肿瘤组织在含有5％抗生素的10ml平衡盐溶液中洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小；
124.s2、肿瘤组织消化处理，基于s1的前提下，将切碎后的组织放置于5mll胶原酶ii型dmem/f12中，并将切碎后的肿瘤组织充分混匀后放置于振荡器上在37℃下消化3小时；
125.s3、去除红细胞，将消化后的组织通过100μm滤网进行过滤，将过滤得到的悬浮液以1200g离心2分钟，并通过加入红细胞裂解缓冲液除去红细胞；
126.s4、类器官构造，将所得肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶和类器官培养基的混合物中；
127.将30μl混合物胶滴铺在24孔细胞培养板中并在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10分钟以硬化matrigel胶；
128.matrigel胶硬化后，将相应的培养基加入到每个培养孔中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育；
129.培养基更换次数为2～3天一次。
130.本发明实施例提供的药物检测主要包括：
131.s1、类器官解离铺板，类器官培养成功后，使用1x tryple从基质胶中收获类器官，机械解离成小簇；
132.将类器官重悬于2％基质胶/类器官培养基(200～1000簇/ml)中，并将类器官均匀铺板于384孔板中；
133.s2、加药处理，在铺板48小时后，将对应药物和对照组加入384孔细胞培养板上；
134.化疗药物浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
135.靶向药物浓度在3μmol/l至0.01236μmol/l，采用3倍稀释的6个浓度梯度；
136.联合方案以1：1的比例加入相应的药物，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
137.s3、测定细胞活力，药物暴露96小时后，使用celltiter-glo 3d细胞活力检测试剂
盒测定细胞活力，并根据对照组将结果标准化；
138.s4、评估药物敏感性，使用graphpad prism 7.0分析数据，并使用非线性回归(曲线拟合)方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度(ic
50
)值，以ic
50
值大小评估药物敏感性。
139.本发明实施例提供的临床治疗主要包括：
140.s1、iv期结直肠癌患者方案：mdt小组会诊；
141.mdt团队认为原发灶和转移灶可以同时切除，则患者接受根治性手术和术后辅助化疗；
142.mdt团队认为原发灶和转移灶不能同时切除或需要分阶段切除，则患者接受新辅助化疗或转化治疗，并再次进行mdt会诊以评估手术时机；
143.s2、iii期和ii期结直肠癌患者方案：进行根治性手术，术后进行辅助化疗。
144.本发明实施例提供的临床随访主要包括：
145.s1、对于接受新辅助化疗或转化治疗后再接受手术的患者，每个化疗周期测量血液cea水平，并在化疗4个周期后进行ct检查(必要时行mri或pet-ct检查)；
146.使用trg等级对手术标本进行病理反应评估以评估化疗疗效,其中包括trg 0～3级；
147.s2、对于接受术后辅助化疗的患者，每个周期测量血液cea水平，每4个周期进行ct检查(必要时行mri或pet-ct检查)，直到8个周期的folfox/xelox化疗结束；
148.使用实体瘤反应评估标准(版本1.1)评估影像学反应，其中包括完全反应(cr)，部分反应(pr)，稳定性疾病(sd)和进行性疾病(pd)；
149.s3、对于完成术后辅助化疗结直肠癌患者，对患者进行随访主要为cea水平在前3年每3个月测量一次，后每6个月测一次至前5年，5年后每1年测量一次，每6～12个月检查一次胸部和腹部的增强ct。
150.本发明实施例提供的结直肠癌类器官药敏预后预测方法主要包括：
151.根据药敏评价标准，将所有样本分为类器官敏感组和类器官耐药组，利用kaplan-meier生存曲线对比两组的生存获益；
152.iv期结直肠癌患者中，类器官耐药组的无进展生存期(pfs)明显低于类器官敏感组，其hr为4.315(95％ci：2.585～7.202；p《0.001)。
153.在多变量cox回归分析中，类器官反应仍然是pfs的独立预后预测因子(hr：3.865；95％ci：2.299～6.496；p《0.001)。
154.在ii/iii期结直肠癌患者中，类器官耐药组患者的复发风险明显高于类器官敏感组患者(hr：3.009；95％ci：1.409～6.427；p＝0.004)，其中类器官敏感组的患者复发风险低，其2年无病生存(dfs)率为86.4％(95％ci：79.0～93.8％)，而类器官耐药组的2年dfs率为64.6％(95％ci：51.1～78.1％)。
155.二、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
156.实施例1：
157.本发明实施例提供的结直肠癌类器官药敏评价方法，包括以下步骤：
158.建立类器官药敏评价的标准，建立类器官药敏评价的标准包括药敏评价标准的确定以及区分直肠癌患的药敏性；
159.药敏评价标准的确定：对类器官敏感性进行定义；
160.s1、反应定义，将临床中的有反应定义为cr/pr、trg 0至1级或cea水平降低，而无反应被定义为sd/pd、trg 2至3级或cea水平升高；
161.s2、得出个体患者的临床治疗反应，iv期结直肠癌患者经过临床随访后得出个体患者的临床治疗反应，中位随访时间为12个月；
162.s3、根据个体患者临床治疗反应和对应类器官药敏反应ic
50
值绘制受试者工作曲线(roc)，该roc曲线得出folfox方案的最佳ic
50
截止值为43.26μmol/l；
163.s4、对于个体患者，当其对应类器官药敏ic
50
值高于43.26μmol/l时，定义其为类器官耐药；
164.当其对应类器官药敏ic
50
值低于43.26μmol/l，定义其为类器官敏感。
165.如图3所示，曲线下面积为0.771(95％ci：0.695～0.847)；
166.区分直肠癌患的药敏性：基于药敏评价标准的确定的前提下，进行区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者；
167.s1、类器官反应定义，基于药敏评价标准的确定所得，72个类器官被归为敏感，76个类器官被归为耐药，一对一对比临床反应和类器官反应以评估该定义的界值预测化疗反应的能力；
168.s2、区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者，该界值用于预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.36％(95％ci：63.16～82.89％)、74.68％(95％ci：61.11～81.94％)、75％(95％ci：65.54～80.41％)、72.22％(95％ci：66.25～81.82％)和77.63％(95％ci：64.56～80.56％)。
169.结果表明定义的结直肠癌类器官药敏ic
50
的界值可有效区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者。
170.如表1所示，该界值预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值(ppv)和阴性预测值(npv)分别为75.36％、74.68％、75％、72.22％和77.63％。
171.表1类器官药敏标准的验证
[0172][0173]
药敏评价标准的验证：基于建立类器官药敏评价的标准的前提下，验证不同分期的结直肠癌患者的药物敏感性；
[0174]
药敏评价标准的验证包括样本准备、类器官培养、药物检测、临床治疗以及临床随访；
[0175]
样本准备：对标本进行取样，并对样本进行储存并送往实验室。
[0176]
s1、标本取样，手术标本离体30分钟内对肿瘤组织进行取样，并及时将样本送往实验室；
[0177]
s2、样本储存，在运输前，将样本在4℃下储存在rpmi 1690中，并添加5％青霉素-1-链霉素，青霉素-1-链霉素的添加用于预防样本存储时微生物污染。
[0178]
类器官培养：对肿瘤组织进行样本处理并对其进行培养。
[0179]
s1、肿瘤组织预处理，将新鲜肿瘤组织在含有5％抗生素的10ml平衡盐溶液中洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小；
[0180]
s2、肿瘤组织消化处理，基于s1的前提下，将切碎后的组织放置于5ml胶原酶ii型dmem/f12中，并将切碎后的肿瘤组织充分混匀后放置于振荡器上在37℃下消化3小时；
[0181]
s3、去除红细胞，将消化后的组织通过100μm滤网进行过滤，将过滤得到的悬浮液以1200g离心2分钟，并通过加入红细胞裂解缓冲液除去红细胞；
[0182]
s4、类器官构造，将所得肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶和类器官培养基的混合物中；
[0183]
将30μl混合物胶滴铺在24孔细胞培养板中并在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10分钟以硬化matrigel胶；
[0184]
matrigel胶硬化后，将相应的培养基加入到每个培养孔中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育；
[0185]
培养基更换次数为2～3天一次。
[0186]
如图1所示，p-m＝原发性肿瘤，o-m＝网膜转移灶，c-a＝癌性腹水；
[0187]
药物检测：基于类器官培养成功后对类器官进行加药处理，测定细胞活力值以评估药物敏感性；
[0188]
s1、类器官解离铺板，类器官培养成功后，使用1x tryple从基质胶中收获类器官，机械解离成小簇；
[0189]
将类器官重悬于2％基质胶/类器官培养基(200～1000簇/ml)中，并将类器官均匀铺板于384孔板中；
[0190]
s2、加药处理，在铺板48小时后，将对应药物和对照组加入384孔细胞培养板上；
[0191]
化疗药物浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
[0192]
靶向药物浓度在3μmol/l至0.01236μmol/l，采用3倍稀释的6个浓度梯度；
[0193]
联合方案以1：1的比例加入相应的药物，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
[0194]
s3、测定细胞活力，药物暴露96小时后，使用celltiter-glo 3d细胞活力检测试剂盒测定细胞活力，并根据对照组将结果标准化；
[0195]
s4、评估药物敏感性，使用graphpad prism 7.0分析数据，并使用非线性回归(曲线拟合)方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度(ic
50
)值，以ic
50
值大小评估药物敏感性。
[0196]
如图2所示，原发性肿瘤(pt)来源的类器官对folfox有反应，加药处理后类器官减少甚至消失；肝转移瘤(lm)来源的类器官对folfox没有反应，加药处理后类器官没有减少甚至出现增多；
[0197]
临床治疗：对不同分期的结直肠患者进行术后化疗。
[0198]
s1、iv期结直肠癌患者方案：mdt小组会诊；
[0199]
mdt团队认为原发灶和转移灶可以同时切除，则患者接受根治性手术和术后辅助化疗；
[0200]
mdt团队认为原发灶和转移灶不能同时切除或需要分阶段切除，则患者接受新辅助化疗或转化治疗，并再次进行mdt会诊以评估手术时机；
[0201]
s2、iii期和ii期结直肠癌患者方案：进行根治性手术，术后进行辅助化疗。
[0202]
s1、对于接受新辅助化疗或转化治疗后再接受手术的患者，每个化疗周期测量血液cea水平，并在化疗4个周期后进行ct检查(必要时行mri或pet-ct检查)；
[0203]
使用trg等级对手术标本进行病理反应评估以评估化疗疗效,其中包括trg 0～3级；
[0204]
s2、对于接受术后辅助化疗的患者,每个周期测量血液cea水平，每4个周期进行ct检查(必要时行mri或pet-ct检查)，直到8个周期的folfox/xelox化疗结束；
[0205]
使用实体瘤反应评估标准(版本1.1)评估影像学反应，其中包括完全反应(cr)，部分反应(pr)，稳定性疾病(sd)和进行性疾病(pd)；
[0206]
s3、对于完成术后辅助化疗结直肠癌患者，对患者进行随访主要为cea水平在前3年每3个月测量一次，后每6个月测一次至前5年，5年后每1年测量一次，每6～12个月检查一次胸部和腹部的增强ct。
[0207]
本发明实施例提供的结直肠癌类器官药敏预后预测方法，主要包括：
[0208]
根据药敏评价标准，将所有样本分为类器官敏感组和类器官耐药组，利用kaplan-meier生存曲线对比两组的生存获益；
[0209]
iv期结直肠癌患者中，类器官耐药组的无进展生存期(pfs)明显低于类器官敏感
组，其hr为4.315(95％ci：2.585～7.202；p《0.001)；
[0210]
在多变量cox回归分析中，类器官反应仍然是pfs的独立预后预测因子(hr：3.865；95％ci：2.299～6.496；p《0.001)；
[0211]
在ii/iii期结直肠癌患者中，类器官耐药组患者的复发风险明显高于类器官敏感组患者(hr：3.009；95％ci：1.409～6.427；p＝0.004)，其中类器官敏感组的患者复发风险低，其2年无病生存(dfs)率为86.4％(95％ci：79.0～93.8％)，而类器官耐药组的2年dfs率为64.6％(95％ci：51.1～78.1％)。
[0212]
如图4所示，类器官敏感组的pfs率显著优于耐药组(p《0.001)；
[0213]
如图5所示，类器官敏感组的dfs率显著优于耐药组(p＝0.004)。
[0214]
通过纳入临床大队列数据并将个体患者临床反应和对应类器官反应结合分析，构建受试者工作曲线(roc)得出类器官药敏ic
50
的界值。对个体患者而言，当其对应类器官药敏ic
50
大于该界值时，定义其为类器官耐药，当其对应类器官药敏ic
50
小于该界值时，定义其为类器官敏感。将在该界值的基础上得出的类器官反应和临床反应进行一对一验证得出该类器官药敏检测定义的界值预测患者化疗疗效的敏感性、特异性、准确性、阴性预测值以及阳性预测值。
[0215]
对结直肠癌进行类器官培养及药敏检测，将得出的药敏ic
50
值与我们定义的界值进行对比，从而直接评价个体患者的类器官药敏反应，该反应能预测患者化疗反应，且与预后相关，该类器官药敏ic
50
界值的确定弥补了目前临床缺乏在化疗前进行药物检测的空白，且作为tnm分期系统预测预后的补充，为临床诊疗提供参考。
[0216]
实施例2：
[0217]
本发明实施例提供的结直肠癌类器官药敏评价方法，包括以下步骤：
[0218]
建立类器官药敏评价的标准，建立类器官药敏评价的标准包括药敏评价标准的确定以及区分直肠癌患的药敏性；
[0219]
药敏评价标准的确定：对类器官敏感性进行定义；
[0220]
s1、反应定义，将临床中的有反应定义为cr/pr、trg 0至1级或cea水平降低，而无反应被定义为sd/pd、trg 2至3级或cea水平升高；
[0221]
s2、得出个体患者的临床治疗反应，iv期结直肠癌患者经过临床随访后得出个体患者的临床治疗反应，中位随访时间为12个月；
[0222]
s3、根据个体患者临床治疗反应和对应类器官药敏反应ic
50
值绘制受试者工作曲线(roc)，该roc曲线得出folfox方案的最佳ic
50
截止值为43.26μmol/l；
[0223]
s4、对于个体患者，当其对应类器官药敏ic
50
值高于43.26μmol/l时，定义其为类器官耐药；
[0224]
当其对应类器官药敏ic
50
值低于43.26μmol/l，定义其为类器官敏感。
[0225]
如图3所示，曲线下面积为0.771(95％ci：0.695～0.847)；
[0226]
区分直肠癌患的药敏性：基于药敏评价标准的确定的前提下，进行区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者；
[0227]
s1、类器官反应定义，基于药敏评价标准的确定所得，72个类器官被归为敏感，76个类器官被归为耐药，一对一对比临床反应和类器官反应以评估该定义的界值预测化疗反应的能力；
[0228]
s2、区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者，该界值用于预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.36％(95％ci：63.16～82.89％)、74.68％(95％ci：61.11～81.94％)、75％(95％ci：65.54～80.41％)、72.22％(95％ci：66.25～81.82％)和77.63％(95％ci：64.56～80.56％)。
[0229]
结果表明定义的结直肠癌类器官药敏ic
50
的界值可有效区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者。
[0230]
如表1所示，该界值预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值(ppv)和阴性预测值(npv)分别为75.36％、74.68％、75％、72.22％和77.63％；
[0231]
药敏评价标准的验证：基于建立类器官药敏评价的标准的前提下，验证不同分期的结直肠癌患者的药物敏感性；
[0232]
药敏评价标准的验证包括样本准备、类器官培养、药物检测、临床治疗以及临床随访；
[0233]
样本准备：对标本进行取样，并对样本进行储存并送往实验室。
[0234]
s1、标本取样，手术标本离体30分钟内对肿瘤组织进行取样，并及时将样本送往实验室；
[0235]
s2、样本储存，在运输前，将样本在4℃下储存在rpmi 1690中，并添加5％青霉素-1-链霉素，青霉素-1-链霉素的添加用于预防样本存储时微生物污染。
[0236]
类器官培养：对肿瘤组织进行样本处理并对其进行培养；
[0237]
s1、肿瘤组织预处理，将新鲜肿瘤组织在含有5％抗生素的10ml平衡盐溶液中洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小；
[0238]
s2、肿瘤组织消化处理，基于s1的前提下，将切碎后的组织放置于5ml胶原酶ii型dmem/f12中，并将切碎后的肿瘤组织充分混匀后放置于振荡器上在37℃下消化3小时；
[0239]
s3、去除红细胞，将消化后的组织通过100μm滤网进行过滤，将过滤得到的悬浮液以1200g离心2分钟，并通过加入红细胞裂解缓冲液除去红细胞；
[0240]
s4、类器官构造，将所得肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶和类器官培养基的混合物中；
[0241]
将30μl混合物胶滴铺在24孔细胞培养板中并在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10分钟以硬化matrigel胶；
[0242]
matrigel胶硬化后，将相应的培养基加入到每个培养孔中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育；
[0243]
培养基更换次数为2～3天一次。
[0244]
药物检测：基于类器官培养成功后对类器官进行加药处理，测定细胞活力值以评估药物敏感性。
[0245]
s1、类器官解离铺板，类器官培养成功后，使用1x tryple从基质胶中收获类器官，机械解离成小簇；
[0246]
将类器官重悬于2％基质胶/类器官培养基(200～1000簇/ml)中，并将类器官均匀铺板于384孔板中；
[0247]
s2、加药处理，在铺板48小时后，将氟尿嘧啶、奥沙利铂、氟尿嘧啶和奥沙利铂联合以及对照组加入384孔细胞培养板上；
[0248]
氟尿嘧啶和奥沙利铂浓度均在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
[0249]
氟尿嘧啶和奥沙利铂联合方案以1：1的比例加入氟尿嘧啶和奥沙利铂，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
[0250]
s3、测定细胞活力，药物暴露96小时后，使用celltiter-glo 3d细胞活力检测试剂盒测定细胞活力，并根据对照组将结果标准化；
[0251]
s4、评估药物敏感性，使用graphpad prism 7.0分析数据，并使用非线性回归(曲线拟合)方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度(ic
50
)值，以ic
50
值大小评估药物敏感性。
[0252]
临床治疗：对不同分期的结直肠患者进行术后化疗；
[0253]
iii期和ii期结直肠癌患者方案：进行根治性手术，术后进行辅助化疗。
[0254]
此为一例iii期结直肠癌患者：首先进行根治性手术，然后进行folfox方案辅助化疗。
[0255]
临床随访：定期的为患者进行检查一次胸部和腹部的增强ct；
[0256]
此例患者为iii期结直肠癌术后接受辅助化疗的患者，化疗期间每个周期测量血液cea水平，每4个周期进行ct检查(必要时行mri或pet-ct检查)，直到8个周期的folfox/xelox化疗结束。
[0257]
使用实体瘤反应评估标准(版本1.1)评估影像学反应，其中包括完全反应(cr)，部分反应(pr)，稳定性疾病(sd)和进行性疾病(pd)。
[0258]
此例患者计算得到的类器官药敏ic
50
值为12.6μmol/l。根据定义的ic
50
界值发现，该患者为类器官敏感组，患者术后出现复发、转移或肿瘤相关死亡的可能性较小，建议常规随访与术后复查，选择常规辅助治疗策略。实施例3：
[0259]
本发明实施例提供的结直肠癌类器官药敏评价方法，包括以下步骤：
[0260]
建立类器官药敏评价的标准，建立类器官药敏评价的标准包括药敏评价标准的确定以及区分直肠癌患的药敏性；
[0261]
药敏评价标准的确定：对类器官敏感性进行定义；
[0262]
s1、反应定义，将临床中的有反应定义为cr/pr、trg 0至1级或cea水平降低，而无反应被定义为sd/pd、trg 2至3级或cea水平升高；
[0263]
s2、得出个体患者的临床治疗反应，iv期结直肠癌患者经过临床随访后得出个体患者的临床治疗反应，中位随访时间为12个月；
[0264]
s3、根据个体患者临床治疗反应和对应类器官药敏反应ic
50
值绘制受试者工作曲线(roc)，该roc曲线得出folfox方案的最佳ic
50
截止值为43.26μmol/l；
[0265]
s4、对于个体患者，当其对应类器官药敏ic
50
值高于43.26μmol/l时，定义其为类器官耐药；
[0266]
当其对应类器官药敏ic
50
值低于43.26μmol/l，定义其为类器官敏感。
[0267]
如图3所示，曲线下面积为0.771(95％ci：0.695～0.847)；
[0268]
区分直肠癌患的药敏性：基于药敏评价标准的确定的前提下，进行区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者；
[0269]
s1、类器官反应定义，基于药敏评价标准的确定所得，72个类器官被归为敏感，76
个类器官被归为耐药，一对一对比临床反应和类器官反应以评估该定义的界值预测化疗反应的能力；
[0270]
s2、区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者，该界值用于预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.36％(95％ci：63.16～82.89％)、74.68％(95％ci：61.11～81.94％)、75％(95％ci：65.54～80.41％)、72.22％(95％ci：66.25～81.82％)和77.63％(95％ci：64.56～80.56％)；
[0271]
结果表明定义的结直肠癌类器官药敏ic
50
的界值可有效区分化疗敏感和非敏感结直肠癌患者。
[0272]
如表1所示，该界值预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值(ppv)和阴性预测值(npv)分别为75.36％、74.68％、75％、72.22％和77.63％。
[0273]
药敏评价标准的验证：基于建立类器官药敏评价的标准的前提下，验证不同分期的结直肠癌患者的药物敏感性；
[0274]
药敏评价标准的验证包括样本准备、类器官培养、药物检测、临床治疗以及临床随访；
[0275]
样本准备：对标本进行取样，并对样本进行储存并送往实验室。
[0276]
s1、标本取样，手术标本离体30分钟内对肿瘤组织进行取样，并及时将样本送往实验室；
[0277]
s2、样本储存，在运输前，将样本在4℃下储存在rpmi 1690中，并添加5％青霉素-1-链霉素，青霉素-1-链霉素的添加用于预防样本存储时微生物污染。
[0278]
类器官培养：对肿瘤组织进行样本处理并对其进行培养；
[0279]
s1、肿瘤组织预处理，将新鲜肿瘤组织在含有5％抗生素的10ml平衡盐溶液中洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小；
[0280]
s2、肿瘤组织消化处理，基于s1的前提下，将切碎后的组织放置于5ml胶原酶ii型dmem/f12中，并将切碎后的肿瘤组织充分混匀后放置于振荡器上在37℃下消化3小时；
[0281]
s3、去除红细胞，将消化后的组织通过100μm滤网进行过滤，将过滤得到的悬浮液以1200g离心2分钟，并通过加入红细胞裂解缓冲液除去红细胞；
[0282]
s4、类器官构造，将所得肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶和类器官培养基的混合物中；
[0283]
将30μl混合物胶滴铺在24孔细胞培养板中并在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10分钟以硬化matrigel胶；
[0284]
matrigel胶硬化后，将相应的培养基加入到每个培养孔中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育；
[0285]
培养基更换次数为2～3天一次。
[0286]
药物检测：基于类器官培养成功后对类器官进行加药处理，测定细胞活力值以评估药物敏感性；
[0287]
s1、类器官解离铺板，类器官培养成功后，使用1x tryple从基质胶中收获类器官，机械解离成小簇；
[0288]
将类器官重悬于2％基质胶/类器官培养基(200～1000簇/ml)中，并将类器官均匀铺板于384孔板中；
[0289]
s2、加药处理，在铺板48小时后，将对应药物和对照组加入384孔细胞培养板上；
[0290]
化疗药物浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
[0291]
靶向药物浓度在3μmol/l至0.01236μmol/l，采用3倍稀释的6个浓度梯度；
[0292]
联合方案以1：1的比例加入相应的药物，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；
[0293]
s3、测定细胞活力，药物暴露96小时后，使用celltiter-glo 3d细胞活力检测试剂盒测定细胞活力，并根据对照组将结果标准化；
[0294]
s4、评估药物敏感性，使用graphpad prism 7.0分析数据，并使用非线性回归(曲线拟合)方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度(ic
50
)值，以ic
50
值大小评估药物敏感性。
[0295]
临床治疗：对不同分期的结直肠患者进行术后化疗；
[0296]
iv期结直肠癌患者方案：mdt小组会诊；
[0297]
mdt团队认为原发灶和转移灶可以同时切除，则患者接受根治性手术和术后辅助化疗；
[0298]
mdt团队认为原发灶和转移灶不能同时切除或需要分阶段切除，则患者接受新辅助化疗或转化治疗，并再次进行mdt会诊以评估手术时机；
[0299]
此为一例iv期结直肠癌患者，首先进行多学科治疗(mdt)小组会诊。mdt团队决定原发灶和转移灶不能同时切除，因此该患者首先接受了folfox方案新辅助化疗，新辅助化疗完成后再行手术治疗。
[0300]
临床随访：定期的为患者进行检查一次胸部和腹部的增强ct；
[0301]
对于接受新辅助化疗或转化治疗后再接受手术的患者，每个化疗周期测量血液cea水平，并在化疗4个周期后进行ct检查(必要时行mri或pet-ct检查)；
[0302]
使用trg等级对手术标本进行病理反应评估以评估化疗疗效，该患者手术标本的病理反应评估为trg 2级，表明该患者的新辅助化疗疗效不佳；
[0303]
此例患者计算得到的类器官药敏ic
50
值为122.7μmol/l。根据定义的ic
50
界值发现，该患者为类器官耐药组，患者术后出现复发、再次转移或肿瘤相关死亡的可能性较大，建议密切随访与术后复查，必要时改变治疗方案。
[0304]
实施例4
[0305]
(1)样本准备：手术标本离体30分钟内对肿瘤组织进行取样，然后立即送往实验室，并在4℃下储存在rpmi 1690(l220kj，basalmedia)中，添加5％青霉素-1-链霉素(bl505a，biosharp)。
[0306]
(2)类器官培养：新鲜肿瘤组织用含有5％抗生素的10ml hank平衡盐溶液(hbss)洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小。将切碎的组织置于5ml 5mg/ml胶原酶ii型(invitrogen)dmem/f12中并置于振荡器上在37℃下消化约3小时。消化完成后过滤，将过滤得到的悬浮液以1200g离心2分钟，并通过加入红细胞裂解缓冲液(00443357，invitrogen ebioscience)除去红细胞。将所得肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶(corning，356235)和类器官培养基的混合物中。然后，将30μl基质胶细胞悬浮液滴在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10分钟。一旦基质胶硬化，将相应的培养基加入到每个培养板中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育。培养基每2～3天更换一次。
[0307]
(3)药物检测：类器官培养成功后，使用1x tryple(gibco)从基质胶中收获类器官，然后解离成小簇。随后，将类器官重悬于2％基质胶/类器官培养基(200～1000簇/ml)中，并一式三份分配到384孔板(corning)中。为了最大限度地提高细胞活力，在接种前用0.1％的胶原蛋白(thermo fisher)孵育板。在接种后48小时，将对应药物和对照组(dmso，abt-263/navitoclax)加入384孔组织培养板上。化疗药物浓度范围为200μmol/l至6.25μmol/l，按2倍稀释6个浓度。靶向药物浓度在3μmol/l至0.01236μmol/l之间，采用3倍稀释液6个浓度。联合方案以1：1的比例加入相应的药物，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度。药物暴露96小时后，使用celltiter-glo 3d细胞活力测定(promega)测定细胞活力，并根据对照组将结果归一化。使用graphpad prism 7.0软件分析数据，并使用非线性回归(曲线拟合)方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度(ic
50
)值。利用细胞活力的剂量-反应曲线的ic
50
值评估药物敏感性。
[0308]
(4)临床治疗：此为一例iii期结直肠癌患者，首先进行根治性手术，然后进行辅助化疗。
[0309]
(5)临床随访：患者定期进行血液cea水平、胸腹部增强ct检测，如有必要可行肝脏mri或pet-ct检测。对于该患者根治术后接受术后辅助化疗者,每个周期测量血液cea水平，每4个周期进行ct(mri或pet-ct)检测直到8个周期的folfox/xelox化疗结束。使用实体瘤反应评估标准(recist)版本1.1(recist 1.1)评估影像学反应，其中包括完全反应(cr)，部分反应(pr)，稳定病(sd)和进行性疾病(pd)。完成半年化疗后，对患者进行随访主要为cea水平在前3年每3个月测量一次，每6个月至5年，5年后每1年测量一次。每6～12个月检查一次胸部和腹部的增强ct。
[0310]
此例患者计算得到的类器官药敏ic
50
值为12.6μmol/l。根据定义的ic
50
界值发现，该患者为类器官敏感组，患者术后出现复发、转移或肿瘤相关死亡的可能性较小，建议常规随访与术后复查，选择常规辅助治疗策略。实施例5
[0311]
(1)样本准备：手术标本离体30分钟内对肿瘤组织进行取样，然后立即送往实验室，并在4℃下储存在rpmi 1690(l220kj，basalmedia)中，添加5％青霉素-1-链霉素(bl505a，biosharp)。
[0312]
(2)类器官培养：新鲜肿瘤组织用含有5％抗生素的10ml hank平衡盐溶液(hbss)洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小。将切碎的组织置于5ml 5mg/ml胶原酶ii型(invitrogen)dmem/f12中并置于振荡器上在37℃下消化约3小时。消化完成后过滤，将过滤得到的悬浮液以1200g离心2分钟，并通过加入红细胞裂解缓冲液(00443357，invitrogen ebioscience)除去红细胞。将所得肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶(corning，356235)和类器官培养基的混合物中。然后，将30μl基质胶细胞悬浮液滴在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10分钟。一旦基质胶硬化，将相应的培养基加入到每个培养板中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育。培养基每2～3天更换一次。
[0313]
(3)药物检测：类器官培养成功后，使用1x tryple(gibco)从基质胶中收获类器官，然后解离成小簇。随后，将类器官重悬于2％基质胶/类器官培养基(200～1000簇/ml)中，并一式三份分配到384孔板(corning)中。为了最大限度地提高细胞活力，在接种前用0.1％的胶原蛋白(thermo fisher)孵育板。在接种后48小时，将对应药物和对照组(dmso，abt-263/navitoclax)加入384孔组织培养板上。化疗药物浓度范围为200μmol/l至6.25μ
mol/l，按2倍稀释6个浓度。靶向药物浓度在3μmol/l至0.01236μmol/l之间，采用3倍稀释液6个浓度。联合方案以1：1的比例加入相应的药物，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度。药物暴露96小时后，使用celltiter-glo 3d细胞活力测定(promega)测定细胞活力，并根据对照组将结果归一化。使用graphpad prism 7.0软件分析数据，并使用非线性回归(曲线拟合)方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度(ic
50
)值。利用细胞活力的剂量-反应曲线的ic
50
值评估药物敏感性。
[0314]
(4)临床治疗：此为一例iv期结直肠癌患者，首先进行多学科治疗(mdt)小组会诊。mdt团队决定原发灶和转移灶不能同时切除，因此该患者首先接受了folfox方案新辅助化疗，新辅助化疗完成后再行手术治疗。
[0315]
(5)临床随访：定期的为患者进行检查一次胸部和腹部的增强ct；
[0316]
对于接受新辅助化疗后再接受手术的患者，每个化疗周期测量血液cea水平，并在化疗4个周期后进行ct检查(必要时行mri或pet-ct检查)；
[0317]
使用trg等级对手术标本进行病理反应评估以评估化疗疗效，该患者手术标本的病理反应评估为trg 2级，表明该患者的新辅助化疗疗效不佳；
[0318]
此例患者计算得到的类器官药敏ic
50
值为122.7μmol/l。根据定义的ic
50
界值发现，该患者为类器官耐药组，患者术后出现复发、再次转移或肿瘤相关死亡的可能性较大，建议加强随访密度、增加术后复查内容和次数，选择较为积极的辅助治疗策略。
[0319]
应当注意，本发明的实施方式可以通过硬件、软件或者软件和硬件的结合来实现。硬件部分可以利用专用逻辑来实现；软件部分可以存储在存储器中，由适当的指令执行系统，例如微处理器或者专用设计硬件来执行。本领域的普通技术人员可以理解上述的设备和方法可以使用计算机可执行指令和/或包含在处理器控制代码中来实现，例如在诸如磁盘、cd或dvd-rom的载体介质、诸如只读存储器(固件)的可编程的存储器或者诸如光学或电子信号载体的数据载体上提供了这样的代码。本发明的设备及其模块可以由诸如超大规模集成电路或门阵列、诸如逻辑芯片、晶体管等的半导体、或者诸如现场可编程门阵列、可编程逻辑设备等的可编程硬件设备的硬件电路实现，也可以用由各种类型的处理器执行的软件实现，也可以由上述硬件电路和软件的结合例如固件来实现。
[0320]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种结直肠癌类器官药敏评价系统，其特征在于，所述结直肠癌类器官药敏评价系统包括：标准建立模块，用于建立类器官药敏评价标准，基于药敏评价标准区分化疗敏感性和非敏感性；标准验证模块，用于对建立类器官药敏评价标准进行验证。2.如权利要求1所述的结直肠癌类器官药敏评价系统，其特征在于，所述标准建立模块包括：药敏标准确定单元，用于药敏评价标准的确定；患癌标准区分单元，用于直肠癌患药敏性的区分。3.如权利要求1所述的结直肠癌类器官药敏评价系统，其特征在于，所述标准验证模块包括：样本准备单元，用于对标本进行取样，并对样本进行储存并送往实验室；类器官培养单元，用于对肿瘤组织进行样本处理并对其进行培养；药物检测单元，用于基于类器官培养成功后对类器官进行加药处理，测定细胞活力值以评估药物敏感性；临床治疗单元，用于采用folfox方案新辅助化疗；临床随访单元，用于定期的为患者进行检查一次胸部和腹部的增强ct。4.如权利要求1所述的结直肠癌类器官药敏评价系统，其特征在于，所述标准建立模块包括：类器官耐药定义单元，用于当对应类器官药敏ic
50
值高于43.26μmol/l时，定义为类器官耐药；类器官敏感定义模块，用于当对应类器官药敏ic
50
值低于43.26μmol/l，定义为类器官敏感；定义界值模块，用于区分化疗敏感性和非敏感性，预测结直肠癌化疗反应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.36％，95％ci：63.16～82.89％；74.68％，95％ci：61.11～81.94％；75％，95％ci：65.54～80.41％；72.22％，95％ci：66.25～81.82％；和77.63％，95％ci：64.56～80.56％。5.如权利要求3所述的结直肠癌类器官药敏评价系统，其特征在于，所述样本准备单元包括：标本取样子单元，用于手术标本离体30min内对肿瘤组织进行取样并送往实验室；样本储存子单元，用于，在运输前，将样本在4℃下储存在rpmi 1690中，并添加5％青霉素-1-链霉素，青霉素-1-链霉素的添加用于预防样本存储时微生物污染。6.如权利要求3所述的结直肠癌类器官药敏评价系统，其特征在于，所述类器官培养单元包括：肿瘤组织预处理子单元，用于将新鲜肿瘤组织在含有5％抗生素的10ml平衡盐溶液中洗涤8～10次，用剪刀切碎至1
×1×
1mm大小；肿瘤组织消化处理子单元，用于将切碎后的组织置于5ml胶原酶ii型dmem/f12中，并将切碎后的肿瘤组织充分混匀后放置于振荡器于37℃下消化3h；去除红细胞子单元，用于将消化后的组织通过100μm滤网进行过滤，将过滤得到的悬浮
液以1200g离心2min，并通过加入红细胞裂解缓冲液除去红细胞；类器官构造子单元，用于将肿瘤细胞洗涤、计数并重悬于matrigel胶和类器官培养基的混合物中；将30μl混合物胶滴铺在24孔细胞培养板中并在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育10min以硬化matrigel胶；matrigel胶硬化后，将相应的培养基加入到每个培养孔中，并将细胞在37℃和5％co2细胞培养箱中孵育。7.如权利要求3所述的结直肠癌类器官药敏评价系统，其特征在于，所述药物检测子单元，包括：类器官解离铺板子单元，用于类器官培养成功后，使用1x tryple从基质胶中收获类器官，机械解离成小簇；将类器官重悬于2％200～1000簇/ml的基质胶/类器官培养基中，并将类器官均匀铺板于384孔板中；加药处理子单元，用于在铺板48h后将对应药物和对照组加入384孔细胞培养板；测定细胞活力子单元，用于药物暴露96h后，使用celltiter-glo 3d细胞活力检测试剂盒测定细胞活力，并根据对照组将结果标准化；评估药物敏感性子单元，用于使用graphpadprism 7.0分析数据，使用非线性回归方程的剂量-反应曲线计算最大半抑制浓度值，以ic
50
值大小评估药物敏感性。8.如权利要求7所述的结直肠癌类器官药敏评价系统，其特征在于，加药处理子单元包括：第一稀释子单元，用于化疗药物浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度；第二稀释子单元，用于靶向药物浓度在3μmol/l至0.01236μmol/l，采用3倍稀释的6个浓度梯度；第三稀释子单元，用于联合方案以1：1的比例加入相应的药物，浓度在200μmol/l至6.25μmol/l，采用2倍稀释的6个浓度梯度。9.一种基于权利要求1～8任意一项所述结直肠癌类器官药敏评价系统的结直肠癌类器官药敏评价方法，其特征在于，所述结直肠癌类器官药敏评价方法包括以下步骤：建立类器官药敏评价标准，基于药敏评价标准区分化疗敏感性和非敏感性；对建立类器官药敏评价标准进行验证。10.一种计算机设备，其特征在于，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述计算机程序被所述处理器执行时，使得所述处理器执行权利要求9所述的结直肠癌类器官药敏评价方法。

技术总结
本发明属于药物敏感性检测技术领域，公开了一种结直肠癌类器官药敏评价和预后预测系统、方法及设备，所述结直肠癌类器官药敏评价系统包括：标准建立模块，用于建立类器官药敏评价标准，基于药敏评价标准区分化疗敏感性和非敏感性；标准验证模块，用于对建立类器官药敏评价标准进行验证。所述结直肠癌类器官药敏评价方法包括：建立类器官药敏评价标准，基于药敏评价标准区分化疗敏感性和非敏感性；对建立类器官药敏评价标准进行验证。本发明能够定量、直接、个体化对结直肠癌类器官药敏结果进行分析，定义的IC


技术研发人员：唐雨婷 严俊 薛巍松 王挺 张彪 陈振邦 王世杰 董淑敏
受保护的技术使用者：南方医科大学南方医院
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/7/21