一种高效降解烟碱的产脲节杆菌Pu17及其应用的制作方法

一种高效降解烟碱的产脲节杆菌pu17及其应用
技术领域
1.本发明涉及农业微生物技术领域，具体地，涉及一种高效降解烟碱的产脲节杆菌pu17及其应用。


背景技术：

2.烟草(nicotiana tabacum l.)是我国一种重要的经济农作物，烟草是含有生物碱的农作物，其生物碱主要包括烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱4种，其中烟碱占烟草总生物碱含量的94％以上。烟碱(nicotine)又名尼古丁，分子式c
10h14
n2，是由吡啶环与吡咯环组成的结构稳定的有毒杂环化合物，广泛存在于多种茄科(solanaceae)植物中，是烟草和卷烟的重要质量评价因素。烟碱是吸烟成瘾的关键成分，且对人体也有一定程度的损伤。研究表明，烟碱可以轻易穿过血脑屏障和生物膜对人体造成影响，尤其是当妇女处在妊娠期时，会导致新生儿易患病，神经和智力发育也会受阻。随着烟草制品的大量生产和消费，含有烟碱、氨基联苯、萘胺和苯并(a)芘等有毒物质的烟草废弃物进入了环境，这些有害物质无法回收利用，已经产生严重的环境问题。欧盟已将每千克烟碱含量超过500mg的烟草废弃物规定为“有毒有害物”，其他国家也规定了相应的标准。如果处理不当，这些废物可能损害人类健康和环境。数据显示，生产1t卷烟需要排放60t以上烟草废水。近年来，由于片面追求产量，大量施加氮肥造成我国部分产区烤烟烟叶烟碱含量过高，尤其上部烟叶烟碱含量过高，无法在卷烟配方中使用，许多卷烟厂上部烟叶均积压严重。我国白肋烟的烟碱含量也比美国的高得多，严重影响国产混合型卷烟的发展。因此，降低烟叶的烟碱含量是我国烟草行业亟待解决的问题之一。
3.烟碱含量是决定烟叶品质优劣的主要指标之一。优质烤烟的烟碱含量一般为1.5％～3.5％，然而我国部分地区烟叶的烟碱含量偏高，特别是上部烟叶，有的烟碱平均含量在4％以上，这不仅严重影响了烟叶品质，对吸烟者的神经也会产生更强的刺激作用，进而危害身心健康。此外，烟叶品质中烟草化学成分也很重要。目前烟草化学协调性指标，包括糖蛋比(总糖：蛋白质)、糖碱比(还原糖：烟碱)、氮碱比(总氮：烟碱)、钾氯比(钾：氯)和油碱比(焦油：烟碱)。糖蛋比又称施木克值，用来衡量烟叶的香气、吃味，施木克值为2～2.5比较合适。糖碱比可以衡量劲头和醇和性，以6～8为好。糖碱比适宜，则其他化学成分也大体趋于平衡；氮碱比，与烟叶颜色、香味有关，比值增大，色淡香味不足，过低则味浓且刺激性大，一般以1为宜。钾氯比是一种燃烧性指标，10以下为好。油碱比是吸烟安全性指标，10以下为好。
4.目前对于烟碱的降解主要集中在物理和化学处理方法，因此寻找一种有效，绿色降解烟碱的方法成为烟草研究方面的一个重要的课题。微生物降解菌具有降解能力强、功能微生物种类丰富、降解途径多样、对环境影响小等特性，是一种低成本、高效率的烟碱处理方法，对降低烟碱含量、减少烟碱污染、提高烟草废弃物利用率、保护水资源与生态环境等方面都具有重要意义。国内外在多年前就开始研究利用微生物降解降低烟叶中烟碱，并有丰富的经验。目前微生物烟碱降解菌多属于假单胞菌属(pseudomonas)、节杆菌属
(acetobacter)、苍白杆菌属(palebacillus)和农杆菌属(agrobacterium)。brown&williamson烟草公司利用假单胞杆菌对烟草中的烟碱进行降解，发现用假单胞杆菌菌液对白肋烟和烤烟的混合烟丝(1∶1)进行18h处理后，烟碱含量平均从2.00％降到了0.85％，使每支卷烟的烟碱含量从1.58mg降到了0.98mg(einosuke wada,microbial d egradation of the tobacco alkaloids,and some related compounds.archives of biochemistry and biophysics.1957nov；72(1):145-62.)。frankenburg发现从烟草种子表面分离出的微生物可将烟碱降解成甲酰胺、氨、草酸以及微量的丙二酸和琥珀酸(frankenburg wg.myosmine in cigar tobacco.archives of biochem istry.1949sep；23(2):333-5.frankenburg wg,gottscho am.nicotinic acid in processed cigar tobacco.arch biochem.1949mar；21(1):247.frankenburg,w.g.,transformation products of nicotine in fermented tobacco.science.1948.107(2782):p.427-8.)；wada从土壤中分离出a型和b型细菌，a型细菌仅能降解烟碱，b型菌不仅能降解烟碱同时还可分解去甲基烟碱和假木贼碱，b型菌属于假单胞菌(pseudomonas,g-)；geiss等人从一种雪茄烟叶上分离出可降解烟碱的假单胞恶臭菌(pseudomonas putida,g-)和可以同时除去烟碱和硝酸盐的纤维单胞菌(cellulomonas sp.)。wang等从烟草根际土壤中分离出一种高效降解的菌株agrobacterium sp.strain s33，它能在最优的培养条件下将1g/l烟碱在6h内完全降解(wang,s.n.,z.liu and p.xu,biodegradation of nicotine by a newly isolatedagrobacterium sp.strain s33.journal of applied microbiology,2009.107(3):p.838-847.)；张娟从湖南省的烟草土壤中筛得菌株pseudomonas marginalis.nd，可在2d内将1g/l液体培养基中的烟碱降解70.40％(张娟,烟碱降解菌的筛选及其酶的纯化与性质研究,2012.)。陈洪等人进行了微生物酶降解烟碱试验(陈洪等,微生物酶法降解烟草总植物碱试验.烟草科技,2004(4):第12-16页)，王革等人从烟叶上分离出3株对烟碱具有较强降解能力的菌株(王革,王颖琦,李松等。微生物发酵烟叶降解尼古丁、蛋白质[j].烟草科学研究,2001(2):66.)。
[0005]
国内陈德鑫等使用短小芽孢杆菌mk21处理烟丝发现，发酵5d后烟丝烟碱降解率为26.3％，烟丝的香气成分也得到了改善。利用微生物降解烟碱，特别是使用微生物直接处理大田时期的烟叶，既可以降低烟叶中过高的烟碱含量，还可以改善卷烟香气的成分比例，从而提高烟叶资源的利用率，具有较强的研究开发价值(陈德鑫，许家来，马志远，等.一株新的具有高效降低烟碱含量的短小芽孢杆菌mk21的分离筛选及作用研究[j].中国烟草学报，2013(1)：60-64.)
[0006]
中国专利cn113462611a公开了一种降解尼古丁的产脲类节杆菌及其应用。但其降解尼古丁的效率低，培养104h后，才可完全降解2g/l尼古丁。并且其仅在室内实验研究阶段，而大田环境比实验室条件更复杂，降解效率通常会大打折扣，该菌很难应用于真正大田中降解尼古丁；而且该菌仅降解烟碱，烟碱只是烟草成分之一，因此该菌也不能保障烟草化学协调性和各品质指标，难以应用于实际生产。
[0007]
综上，目前降解烟碱的微生物的降解效率不高，作用单一，仅在室内研究阶段，难以在复杂的大田环境和实际生产中应用，不能保障烟草化学协调性和各品质指标，无法提供更好的使用价值。因此，急需培养出更加高效降解烟碱的菌株，协调烟草品质，发挥更广泛的应用价值。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种高效降解烟碱的产脲节杆菌pu17及其应用。
[0009]
本发明的第一个目的是提供一种产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17。
[0010]
本发明的第二个目的是提供所述产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在降解烟碱和/或制备降解烟碱的生物制剂中的应用。
[0011]
本发明的第三个目的是提供一种降解烟碱的生物制剂。
[0012]
本发明的第四个目的是提供一种降解烟碱的方法。
[0013]
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
[0014]
一种产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17，所述产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17已于2022年6月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为gdmcc no：62557。
[0015]
所述产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在降解烟碱和/或制备降解烟碱的生物制剂中的应用。
[0016]
一种降解烟碱的生物制剂，所述生物制剂中含有权利要求1所述的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17或含有该菌的发酵产物。
[0017]
优选地，所述生物制剂中含有权利要求1所述的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17的浓度为1
×
108～1
×
10
10
cfu/ml。
[0018]
更优选地，产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17的浓度为1
×
108cfu/ml。
[0019]
一种降解烟碱的方法，用所述的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17或所述生物制剂降解烟碱。
[0020]
优选地，所述烟碱为烟草中的烟碱。
[0021]
更优选地，将所述的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17喷施于烟草叶片。
[0022]
更优选地，将浓度为1
×
108～1
×
10
10
cfu/ml或1
×
108cfu/ml的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17原菌液稀释14.9～15.1倍后，喷施于烟草叶片，每亩烟草喷施所述原菌液0.9～1.1l。
[0023]
更优选地，稀释倍数为15倍。
[0024]
更优选地，每亩烟草喷施所述原菌液1l。
[0025]
更优选地，将所述生物制剂喷施于烟草叶片。
[0026]
更优选地，将所述含有产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17的浓度为1
×
108～1
×
10
10
cfu/ml或1
×
108cfu/ml的生物制剂稀释14.9～15.1倍后，喷施于烟草叶片，每亩烟草喷施所述生物制剂0.9～1.1l。
[0027]
更优选地，稀释倍数为15倍。
[0028]
更优选地，每亩烟草喷施所述生物制剂1l。
[0029]
更优选地，所述烟草为打顶期烟草。
[0030]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0031]
本发明的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17具有以烟碱为唯一碳氮源生长的能力，在含有2g/l烟碱的选择性培养基上培养30h，即可使烟碱含量下降80％。
[0032]
在含有其他碳氮源的情况下，该菌依然会优先利用烟碱作为代谢物质，具有较强的烟碱代谢能力，在含有2g/l烟碱的lb培养基上培养7.5h，即可使烟碱含量下降90％以上，10h时可完全降解烟碱，降解烟碱效率高。
[0033]
该菌在烟草植株上也具有显著的降解烟碱能力，在烟草植株喷施含有产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17及其发酵产物的菌液24h，使烟草植株的烟碱含量下降了约30％；在复烤烟片上喷施产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17，降低了烟叶的烟气浓度和劲头，提高了烟气的舒适性，提高了烟叶的配方适用性。
附图说明
[0034]
图1为产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在含烟碱的选择性培养基的平板分离照片。其中a为含2g/l烟碱的选择性培养基，b为含3g/l烟碱的选择性培养基。
[0035]
图2为产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在含烟碱的lb培养基的照片。其中a为
×
1倍的照片，b为
×
7.5倍的照片。
[0036]
图3为产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17的分子鉴定系统发育树。
[0037]
图4为产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在含2g/l烟碱的选择性培养基培养后，烟碱的降解曲线。其中od600为菌量，峰面积为hplc检测的烟碱吸收峰面积。
[0038]
图5为产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在含2g/l的lb培养基培养后，烟碱的降解曲线。其中od600为菌量，峰面积为hplc检测的烟碱吸收峰面积。
[0039]
图6为在烟草上喷施产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17后，烟草中烟碱的含量。
具体实施方式
[0040]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0041]
实施例1菌株的分离、培养与鉴定
[0042]
一、实验方法
[0043]
1、配制培养基
[0044]
(1)lb培养基：将10g蛋白胨、5g酵母抽提物、10g nacl和15g琼脂，溶于1l无菌ddh2o水中，调ph至7.0，121℃高压灭菌20min。lb培养基为液体培养基时不加琼脂。
[0045]
(2)微量元素溶液配制：用0.1mol/l hcl将0.4g mnso4·
7h2o、0.2g cacl2·
2h2o和0.2g feso4·
7h2o溶解并定容至100ml。
[0046]
选择性培养基(2g/l)：将13.3g k2hpo4、4g kh2po4、0.2g mgso4·
7h2o、0.5ml微量元素溶液和18g琼脂混合，调ph至7.0，121℃高压灭菌20min，冷却至70℃，加入2.2ml质量浓
度为90％的液体烟碱，所述液体烟碱经0.22μm滤膜过滤。
[0047]
选择性培养基(3g/l)：将13.3g k2hpo4、4g kh2po4、0.2g mgso4·
7h2o、0.5ml微量元素溶液和18g琼脂混合，调ph至7.0，121℃高压灭菌20min，冷却至70℃，加入3.3ml纯度为90％的液体烟碱，所述液体烟碱经0.22μm滤膜过滤。
[0048]
所述选择性培养基以烟碱为唯一碳源和氮源，烟碱浓度为分别为2g/l和3g/l。选择性培养基为液体培养基时不加琼脂。
[0049]
2、从土壤中筛选烟碱降解菌
[0050]
称取来源于湖南省永州市烟草生产技术中心的1.0g土样，加入装有30ml pbs的三角瓶中，摇床30℃，转速150r/min，富集培养48h。
[0051]
在超净台中吸取1ml富集培养的上清液，加入到装有30ml液体选择性培养基中，摇床30℃，转速150r/min驯化培养48h后，在烟碱固体培养基上稀释平板分离。
[0052]
平板分离的方法为：吸取1ml驯化培养的上清液，加入到含有9ml灭菌pbs的试管中，摇匀，即得10-1
倍的菌液；同理制取10-2
、10-3
、10-4
、10-5
和10-6
倍的菌液。分别取浓度为10-3
、10-4
、10-5
和10-6
倍菌各0.1ml，每个稀释倍数做3个重复，分别用平板涂布玻璃珠涂布于选择性培养基平板，30℃培养4d。挑选单个菌落进一步划线分离，重复操作，直到获得纯单一菌落并编号。
[0053]
选择性培养基中有单菌落长出后，每个单菌落至少在lb平板培养基上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照，用接种环挑划线后长出的单菌落再转接至lb液体培养基中，30℃，180rpm摇菌至指数生长期时，将细菌保存于含体积浓度15％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。挑选一株生长状态最好的菌株进行鉴定并进一步研究其降解烟碱的作用。
[0054]
3、分子生物学鉴定
[0055]
(1)用天根生物公司的细菌基因组dna提取试剂盒(tianamp bacteria dna kit)抽提实施例1步骤2得到的烟碱降解菌的单克隆菌株基因组dna，并以提取的dna为模板，以16s rdna通用引物27f(5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)为上下游引物，扩增菌株的16s rdna。
[0056]
pcr反应体系如表1所示，将pcr扩增体系轻轻混匀后，短暂离心，置于pcr仪上按照：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃，5min；4℃，end的程序反应，pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后测序。
[0057]
表1细菌16s rdna pcr扩增体系(20μl)
[0058][0059]
(2)菌株系统发育分析
[0060]
用seqman软件分析测序质量并将正反序列拼接，将获得的16s rdna基因序列在
ncbi进行blast比对，选取亲缘关系较近的菌株序列，并用软件mega 7，以neighbour-joining法构建系统发育树，调整bootstrap值并检验进化树的可靠性。
[0061]
二、实验结果
[0062]
如图1中a所示，为含2g/l烟碱选择性培养基的平板分离照片，如图1中b所示，为含3g/l烟碱选择性培养基的平板分离照片。
[0063]
如图2中a所示，为含2g/l烟碱lb平板培养基中，菌株在
×
1倍显微镜下的分离照片，如图2中b所示，为含2g/l烟碱lb平板培养基中，菌株在
×
7.5倍显微镜下的分离照片，菌株在lb平板上形成圆形、边缘整齐的不透明灰白色菌落，为革兰氏阴性菌，生长温度为30℃，生长ph7.0；营养要求不高，在普通lb培养基及烟碱培养基上均生长良好。
[0064]
本发明纯化分离的菌株的16srrna核苷酸序列如seq id no：1所示。如图3所示，本发明纯化分离的菌株与paenarthrobacter ureafaciens(nr029281.1)相似性最高，其分类单元：细胞生物，细菌界，土壤细菌群，放线菌门、放线菌纲，微球菌科，微球菌属，产脲节杆菌。将本发明纯化分离的菌株命名为产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17，并于2022年6月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为gdmcc no：62557，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0065]
实施例2产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17对选择性培养基中烟碱的降解情况
[0066]
一、实验方法
[0067]
1、制作烟碱标准曲线
[0068]
将烟碱配置成250mg/ml、500mg/ml、750mg/ml、1000mg/ml、1250mg/ml和1500mg/ml七个浓度梯度标准液，用高效液相色谱制定烟碱浓度标准曲线。色谱柱为：agilenttc-c18；流动相为：甲醇和含0.02mol磷酸氢二钠缓冲液(ph＝4.2)的水溶液，体积比为10：90；柱温为：30℃、流速为：1ml/min、进样量为：10μl，检测波长为：259nm。
[0069]
2、按照实施例1配置200ml烟碱含量为2g/l的烟碱液体选择性培养基，设置实验组为接种实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17的培养基，接种1％ lb菌悬液(od＝1)；对照组为不接种菌株的烟碱液体选择性培养基。将实验组和对照组放在30℃培养箱中培养。
[0070]
3、检测方法：分别在步骤2培养0h、5h、10h、15h、20h、25h和30h时，在超净台各取2ml菌液，其中1ml用孔径0.22μm的滤膜将菌株滤掉，得到待测液，用高效液相色谱检测待测液中烟碱含量，检测方法与步骤1相同；将另外1ml菌体，1000g离心2min，用pbs重悬，用酶标仪测定其od600，每个孔200μl，3个重复组。
[0071]
二、实验结果
[0072]
如图4所示，实验组的烟碱含量在培养15h开始下降，在培养30h内下降80％，证明实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17具有以烟碱为唯一碳氮源生长的能力。
[0073]
实施例3产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17对lb培养基中烟碱的降解情况
[0074]
一、实验方法
[0075]
1、制作标准曲线
[0076]
与实施例2相同。
[0077]
2、培养方法
[0078]
向lb培养基中加入烟碱，配置200ml烟碱含量为2g/l的lb培养基，lb培养基的配置方法与实施例1相同。设置实验组为接种实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17的培养基，接种1％ lb菌悬液(od＝1)，对照组为未接种菌株的烟碱含量为2g/l的lb液体培养基。将实验组和对照组放在30℃培养箱中培养。
[0079]
3、检测方法
[0080]
分别在步骤2培养0h、2.5h、5h、7.5h和10h时，在超净台各取2ml菌液，其中1ml用孔径0.22μm的滤膜将菌株滤掉，得到待测液，用高效液相色谱检测待测液中烟碱含量，检测方法与实施例2相同；将另外1ml菌体，1000g离心2min，用pbs重悬，用酶标仪测定其od600，每个孔200μl，3个重复组。
[0081]
二、实验结果
[0082]
如图5所示，实验组的烟碱含量在5h内下降50％以上，在7.5h内下降90％以上，10h时可完全降解烟碱；并且根据数据显示，在10h时od600还未达到稳定期，表明其具备很强的降解更高浓度烟碱的能力。证明实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在含有其他碳氮源的情况下，依然会优先利用烟碱作为代谢物质，表明实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17有较强的烟碱代谢能力。
[0083]
实施例4产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17对烟草植株上烟碱的降解情况
[0084]
一、实验方法
[0085]
1、菌体的培养和配置
[0086]
准备1l产脲节杆菌pu17菌株(产脲节杆菌pu17菌株的浓度为1
×
108cfu/ml，由于菌株是存活状态，一直在生长，因此菌液中产脲节杆菌pu17菌株的浓度为1
×
108～1
×
10
10
cfu/ml)菌液，菌液中含有产脲节杆菌pu17及其发酵产物，用于烟草喷施。
[0087]
2、pu17菌株处理方法
[0088]
种植一亩烟草(云烟87)至打顶期。烟草打顶后，将1l菌液稀释到15l水中，对烟草上中部叶进行喷施。对照组喷施清水。喷洒后，在0h、24h、30h、48h和120h分别取随机烟草植株第四片叶，检测其烟碱含量。
[0089]
3、检测方法
[0090]
取烟叶立刻称其鲜重，烘干(105℃处理30min，再70℃处理6h)，烘干后称烟叶干重。将烘干后的烟叶磨碎，过100目筛子，获得烟草粉末。取0.1g烟草粉末和0.2g活性炭到150ml锥形瓶中，然后往锥形瓶中加入25ml 0.5mol/l的盐酸，得烟草活性炭混合液。用酒精灯将烟草活性炭混合液加热到沸腾(100～101kpa常压下)，保持沸腾5min；溶液冷却至室温(25℃)后，用水在250ml容量瓶中进行定容；定容后，过滤，弃最开始10ml滤液，取30ml剩下的滤液，用分光光度仪在236nm、259nm和282nm进行比色，测其吸光值，之后根据公式计算得到烟碱含量。公式为：
[0091]
烟碱(mg/g)＝1.059
×
[a
259-0.5
×
(a
236
+a
282
)]
×v×
1000/[样品数
×
(1-含水量)
×
34.3
×
1000]
[0092]
二、实验结果
[0093]
如图6所示，与对照组相比，实验组在24h时烟碱含量下降了约30％，之后烟碱含量逐渐回补，到120h时烟碱含量相比于对照组仍下降了约10％。因此实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在烟草植株上也能降解烟碱。
[0094]
实施例5pu17菌株处理后烟草的感官评价
[0095]
一、实验方法
[0096]
用实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17对2022年永州产地的b2f等级(云烟87)的复烤片烟进行处理：将实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17菌液以浓度为1
×
108cfu/ml均匀喷洒在复烤片烟上，并不断轻柔翻动烟叶，平衡水分静置30min；水分平衡后，将烟叶置于室内阴凉处，并遮光处理，时间为3天。处理后完毕后，将烟叶切丝并烘干，烟丝水分控制在12％～12.5％，进行感官质量评价，以没有经过处理的同批样品作为对照。
[0097]
其中，感官质量得分＝(香气质
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0.35+香气量
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0.25+杂气
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0.1+刺激性
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0.15+余味
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0.15)
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11.11。
[0098]
二、实验结果
[0099]
如表2所示，
[0100]
用实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17进行处理，显著改善2022年永州产地的云烟87风格特征指标，降低了烟气浓度和劲头，表明烟碱含量降低。
[0101]
另外根据结果显示，用实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17降解处理后，2022永州产地的云烟87的品质特征指标也有显著提高。品质特征指标不仅跟烟碱有关，还与糖含量、总氮含量、糖碱比值和氮碱比值等相关。
[0102]
综合来看，用实施例1产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17降解处理后，除了烟碱含量降低明显降低，浓度和劲头的风格特征指标明显改善；而且还影响了其他品质特征指标，烟气的舒适性提高，烟叶的配方适用性提高。表2产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17对云烟87等级的复烤烟的烟碱降解处理情况
[0103][0104][0105]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17，其特征在于，所述产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17已于2022年6月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为gdmcc no：62557。2.权利要求1中所述产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17在降解烟碱和/或制备降解烟碱的生物制剂中的应用。3.一种降解烟碱的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中含有权利要求1所述的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17或含有该菌的发酵产物。4.根据权利要求3所述降解烟碱的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中含有权利要求1所述的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17的浓度为1
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108～1
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10
10
cfu/ml。5.根据权利要求4所述降解烟碱的生物制剂，其特征在于，产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17的浓度为1
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108cfu/ml。6.一种降解烟碱的方法，其特征在于，用权利要求1所述的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17或权利要求3～5任一所述生物制剂降解烟碱。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述烟碱为烟草中的烟碱。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)pu17喷施于烟草叶片。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将权利要求3～5任一所述生物制剂喷施于烟草叶片。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述烟草为打顶期烟草。

技术总结
本发明公开了一种高效降解烟碱的产脲节杆菌Pu17及其应用。产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)Pu17具有以烟碱为唯一碳氮源生长的能力，在含有2g/L烟碱的选择性培养基上培养30h，烟碱含量下降80％。在有其他碳氮源的情况，优先用烟碱为代谢物，具有较强烟碱代谢能力，在含有2g/L烟碱的LB培养基上培养7.5h，烟碱含量下降90％以上，10h时可完全降解烟碱。在烟草植株喷施所述菌株24h，烟碱含量下降约30％；在复烤烟片上喷施所述菌株，降低了烟叶的烟气浓度和劲头，提高了烟气的舒适性和烟叶的配方适用性。的舒适性和烟叶的配方适用性。的舒适性和烟叶的配方适用性。


技术研发人员：彭琛 金丰良 张学伟 许小霞 陈越立 张舒昊 金保锋 黄玲 梁耀星 古政坤 战磊 王玉胜 张玺
受保护的技术使用者：广东中烟工业有限责任公司
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/7/21