适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用与流程

1.本发明涉及原位测序领域，具体涉及一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用。


背景技术：

2.细胞是生物体结构和功能的基本单位。自1839年细胞学说建立后，无数科学家致力于研究细胞的解构、功能及彼此间的关系等，以期探明生命的本质。1958年，沃森和克里克提出中心法则，阐述了遗传信息在生物大分子之间传递的顺序，分子生物学时代就此拉开序幕。在此基础上，基因组学、转录组学、蛋白组学等现代生物学科蓬勃发展，科学家们在探寻生命活动奥秘研究上扬帆起航。其中，mrna由dna转录而来，在核糖体的协助下合成蛋白质，是遗信息的传递者，蛋白质翻译的蓝图，在生命活动中起着至关重要的作用。迄今，全世界有数以万计的科研人员致力于mrna的研究。
3.技术变革是推动研究发展的根本。早期对mrna的研究受制于实验技术，需要先从细胞或组织中提取出mrna，再通过northern印迹杂交法(northern blot)、荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time pcr，qpcr)、第一代测序技术等来研究。此类方法费时费力，能获取的信息也很有限。随着二代测序技术的推广，科学家们逐步实现了对mrna的大规模并行测序，开发出一系列的rna测序技术(rna-seq)。在过去的十年中，rna-seq已经成为在全转录组范围内分析差异基因表达和mrna差异剪接的重要工具，包括单细胞基因表达、翻译和rna结构等。
4.传统的rna测序(如bulk rna-seq)是将一整块组织中的rna提取出来进行建库、测序，获得此区域内各种细胞转录本的平均表达水平。但组织中不同细胞发挥的功能不同，mrna表达水平也有差异，常规rna-seq的均一化策略会掩盖掉许多重要信息。为了探寻组织中不同细胞的特点和功能，2009年，汤富酬教授基于前人技术进行改良，形成了第一个的真正意义的单细胞rna测序技术(single cell rnasequencing,scrna-seq)。
5.2013年，nature method将年度技术授予单细胞测序。该技术能够提供每个细胞的rna表达谱，并鉴定异质细胞群中的稀有细胞，极大推动了发育生物学、神经生物学、癌症机理等方面的研究。scrna-seq方法和bulk rna-seq技术共同发挥功能，为研究者们提供了关于组织或细胞群体的高度详细的数据，提高了人们对组织内细胞的身份信息和状态的认知。然而，此类方法共同的缺点是失去了mrna在细胞中的空间信息。这类信息非常重要，因为特定的细胞类型及组织与生命活动密切相关。
6.为了对转录本的空间信息进行研究，以分析细胞环境与基因表达之间的密切关系，科学家们提出空间转录组学(spatial transcriptomics，st)。其中，基于成像的rna原位测序方法(in situ sequencing,iss)，可以直接对处于组织环境中的细胞中的mrna进行测序，这样既能得到单个细胞特定转录本的具体序列，还能得到其空间位置和对应的表达水平，能将获得的mrna信息标定到它真实的地方，是相对理想的方式。
7.目前，常用的mrna原位测序根据其捕获转录本的方法可分为两类：
8.1)一类是非靶向捕获转录本的方法，代表技术有fisseq、insta-seq。此类方法理论上能对捕获所有转录本，检测细胞内所有转录本的信息，但实际中此类技术特异性较差，获得的数据中rrna信号较多，mrna的检测效率较低，且往往步骤较繁琐，目前应用不多。
9.2)另一类方法为靶向捕获转录本的方法，代表技术为starmap(spatially-resolved transcript amplicon readout mapping)。该类方法通常依赖锁式探针(padlock probe)，用此种探针对某一特定转录本进行原位捕获，此类方法通常较为灵敏、特异，但测序通量较低，一条锁式探针只能检测一个位点的一种突变，想要进行稍长的测序就需设计多条探针，操作繁琐且成本较高。
10.如图1所示：经典锁式探针在进行原位测序时，一旦待测序列上存在突变，则需要基于先验的知识设计并合成多种探针。当待测位点存在一个点突变时，因突变结果可能是a\t\c\g其中任意一种，需要分别合成出对应的探针，至少有4种，还需要知道突变碱基的具体位置，才能用经典的锁式探针捕获。一旦存在连续几个突变，甚至是多种突变同时出现，就需要设计大量的探针来检测。一次实验使用多种经典探针，不仅大大增加了成本，还会降低杂交效率、增加非特异性。
11.如何直接、靶向且简单地对核酸进行原位测序，是目前技术开发的当务之急。


技术实现要素：

12.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用，本发明使用半闭合的锁式探针，特异性杂交目的核酸，通过连接的方式，将一段单链随机脱氧核糖核苷酸填补进锁式探针形成的gap中，形成完整的环状结构，通过滚环扩增的方式原位放大捕获的信息，再通过连接测序对gap中对应的序列进行解读，最后进行图像分析获得转录本的空间信息。该方法仅需4轮连接测序，即可测得核酸上连续4个碱基的序列。使用普通锁式探针，测得4个碱基序列需设置44＝256条探针，本方法仅需1条，大大减少了探针设计工作量和制备的成本。本发明可以直接原位测序rna，无需将其反转录为cdna，且保留了空间信息，减少操作步骤的同时提高了检测效率。该方法可检测一段未知序列，无需先验知识，特异性强，容错率高。
13.为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：
14.本发明提供了一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，包括以下步骤：
15.1)探针的设计
16.根据待检序列筛选出杂交效率高、特异性好、无高级结构的靶向区域，设置杂交探针；其中，所述的杂交探针包括半闭合锁式探针和rca引发探针；
17.所述半闭合锁式探针与待检序列的靶向序列互补后会在半闭合锁式探针5’和3’端间形成空缺，
18.所述空缺由x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段(5
’‑
nnnn-3’)填补并与待检序列的靶向序列(即为测序目标)互补；其中，x为2、3、4、5、6、7、8
……
；
19.2)探针预处理
20.对杂交探针中的半闭合锁式探针、x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的5’端进行磷酸化；
21.3)样品杂交
22.在待测样本上制备一个反应腔室，用4％的多聚甲醛(pfa)对样本进行固定，然后用甲醇脱水和变性，再将含有杂交探针的体系加入其中孵育一段时间；
23.4)连接反应
24.将含有x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的连接体系加入到反应腔室中，使与待检序列互补配对的半闭合锁式探针上的空缺(gap)被填补，形成闭合的环状结构；
25.5)滚环扩增
26.rca引发探针同时与待检序列的靶向序列和半闭合锁式探针互补，在phi29 dna聚合酶的作用下，以rca引发探针为引物，半闭合锁式探针形成的环状结构为模板，进行滚环扩增，将目标信号放大；
27.6)对靶序列原位测序(应用连接测序的原理)
[0028]ⅰ.原位测序
[0029]
将含有锚定引物和测序引物的测序体系加入反应腔室中进行原位测序反应，对半闭合锁式探针之间的空缺(gap)中第一位碱基对应的序列进行测序成像，解读靶向序列的空间位置及序列信息；
[0030]ⅱ.同法依次解读半闭合锁式探针之间的空缺(gap)中其它位置碱基序列的信息；
[0031]ⅲ.对上述获得的多轮测序信息进行匹配，解读半闭合锁式探针之间形成空缺(gap)对应的靶向序列。
[0032]
进一步地，所述步骤1)中，待检序列的靶向序列由4段连续的靶序列a、d、b和c组成，所述半闭合锁式探针由5’端至3端’为a’序列，loop序列和b’序列，
[0033]
所述a’序列和b’序列分别与靶序列a、靶序列b互补，所述半闭合锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成；
[0034]
所述空缺的序列d’与靶序列d互补。
[0035]
再进一步地，所述步骤1)中，所述空缺的序列d’由y段序列组成，所述y小于x且y为1、2、3、4、5、6、7、8
……
(即：x＝x 1
+x 2
+
……
+x y
，x为空缺中所有碱基的数量，y为组成空缺中随机序列的段数，x为每段序列中碱基的数量)。
[0036]
再进一步地，所述空缺的序列d’中，x为2～8个，y为1～6。
[0037]
再进一步地，所述步骤1)中，x为4个(所述空缺的序列d’由4个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段组成)，y为1个。
[0038]
再进一步地，所述步骤2)中，对单链脱氧核糖核酸随机片段的5’端进行磷酸化。
[0039]
再进一步地，所述步骤2)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为t4多聚核苷酸激酶(pnk)。
[0040]
再进一步地，所述步骤4)中，连接酶反应体系的连接酶为splint r连接酶。
[0041]
再进一步地，所述步骤6)中，对靶序列原位测序
[0042]ⅰ.原位测序
[0043]
将含有锚定引物和测序引物的测序体系加入反应腔室中进行原位测序反应，对半闭合锁式探针之间的空缺(gap)中第一位碱基对应的序列进行测序成像，解读靶向序列的数量、空间位置及序列信息；
[0044]ⅱ.同法依次解读半闭合锁式探针之间的空缺(gap)中第二位、第三位、第四位碱基序列的信息；
[0045]ⅲ.对上述获得的四轮测序信息进行匹配，解读半闭合锁式探针之间形成空缺(gap)对应的靶向序列。
[0046]
本发明还提供了一种上所述的适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法在点突变检测中的应用。
[0047]
本发明的原理：
[0048]
本发明中，半闭合锁式探针与待检序列的靶向序列互补后会在半闭合锁式探针5’和3’端间形成空缺，
[0049]
该空缺可以被x个碱基长的单链脱氧核糖核酸随机片段填补，连接锁式探针形成完整的环状结构。该过程依赖于连接酶对随机片段5’及3’端碱基与靶序列精准互补配对的识别，任意一端不匹配则无法被连接酶连接形成闭环。同时，随机片段中间部分和靶序列不完全匹配时，由于杂交形成的氢键作用力较弱，随机片段很容易从靶序列上解离下来。只有完全互补配对的片段才能稳定填补进空缺(gap)内，并被连接酶连接到锁式探针上。靶序列包括但不局限于dna或者rna。
[0050]
本发明的有益效果：
[0051]
1.特异性高：本发明使用半闭合的锁式探针捕获特异的转录本，且使用单链脱氧核糖核酸随机片段填补gap，其信号扩增取决于两部分：锁式探针捕获区同靶序列的精准互补配对，以及随机片段的精准填补。只有同时满足上述条件的目标片段才能最终被检测到，提高了方法特异性。
[0052]
2.探针设计简单，成本低。传统原位测序技术要测得连续4个碱基序列，需设置44＝256条探针，本发明仅需1条锁式探针，配合4碱基单链脱氧核糖核酸随机片段，即可测得rna上连续4个碱基的序列。探针设计简化，且极大缩减了成本。
[0053]
3.可用于检测基因突变。本发明可针对序列上存在的点突变，或者一定长度的连续突变进行直接测序，在肿瘤突变检测中具有较好的应用前景。对于单个位点的缺失突变本发明也可检，比如：使用预期形成4个碱基的gap的锁式探针检测某个可能存在缺失突变的位点，在连接体系中额外加入3碱基单链脱氧核糖核酸随机片段，如若发生缺失突变，则此锁式探针形成3碱基gap，也能被填补上，通过后续测序即可得知缺失突变的信息。
[0054]
4.该方法可直接检测一段未知序列的核酸，设计探针时只需要知道其两侧片段即可。
[0055]
5.成像条件普适性高：共聚焦成像系统即可实现信号解读。本发明通过滚环扩增的方法放大信号，其结果亮度高，能用共聚焦成像系统检出。
[0056]
6.本发明可实现单细胞水平上的原位测序。
[0057]
7.本发明直接靶向mrna，无需将其反转录为cdna，能提高准确度，节省成本，操作简便。
[0058]
8.连接步骤利用splintr酶，更加特异、高效。
[0059]
综上所述，本发明通过使用半闭合的锁式探针，在splintr酶的作用下使4碱基单链脱氧核糖核酸随机片段准确填补在gap中，形成一个完整的环状结构，再通过滚环扩增放大信号，读取测序结果。相比于传统的方法，本发明探针设计更简单，省时省力，成本低，能
直接地捕获到mrna上的序列，对于检测突变有良好的应用前景。且本发明运用共聚焦成像系统捕获信号，无需超分辨成像系统，降低了实验成本和难度，易于普及。
附图说明
[0060]
图1为经典锁式探针的设计图；
[0061]
图2为本发明的杂交探针的设计图；
[0062]
图3为本发明的fill-in方法的技术流程图；
[0063]
图4为本发明的fill-in方法的测序成像效果图；
[0064]
图中，红色点代表测得的序列是鸟嘌呤g，靛青色点代表胞嘧啶c。
具体实施方式
[0065]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
[0066]
本发明提供了一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，包括以下步骤：
[0067]
1)探针的设计
[0068]
根据待检序列筛选出杂交效率高、特异性好、无高级结构的靶向区域，设置杂交探针；其中，所述的杂交探针包括半闭合锁式探针和rca引发探针；
[0069]
所述半闭合锁式探针与待检序列的靶向序列互补后会在半闭合锁式探针5’和3’端间形成空缺，
[0070]
所述空缺由x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段(5
’‑
nnnn-3’)填补并与待检序列的靶向序列(即为测序目标)互补；其中，x为2、3、4、5、6、7、8
……
；
[0071]
2)探针预处理
[0072]
对杂交探针中的半闭合锁式探针、x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的5’端进行磷酸化；
[0073]
3)样品杂交
[0074]
在待测样本上制备一个反应腔室，用4％的多聚甲醛(pfa)对样本进行固定，然后用甲醇脱水和变性，再将含有杂交探针的体系加入其中孵育一段时间；
[0075]
4)连接反应
[0076]
将含有x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的连接体系加入到反应腔室中，使与待检序列互补配对的半闭合锁式探针上的空缺(gap)被填补，形成闭合的环状结构；
[0077]
5)滚环扩增
[0078]
rca引发探针同时与待检序列的靶向序列和半闭合锁式探针互补，在phi29 dna聚合酶的作用下，以rca引发探针为引物，半闭合锁式探针形成的环状结构为模板，进行滚环扩增，将目标信号放大；
[0079]
6)对靶序列原位测序(应用连接测序的原理)
[0080]ⅰ.原位测序
[0081]
将含有锚定引物和测序引物的测序体系加入反应腔室中进行原位测序反应，对半闭合锁式探针之间的空缺(gap)中第一位碱基对应的序列进行测序成像，解读靶向序列的空间位置及序列信息。
[0082]ⅱ.同法依次解读半闭合锁式探针之间的空缺(gap)中其它位置碱基序列的信息。
[0083]ⅲ.对上述获得的多轮测序信息进行匹配，解读半闭合锁式探针之间形成空缺(gap)对应的靶向序列。
[0084]
基于上述方法，根据实际情况进行如下检测：
[0085]
实施例1
[0086]
利用上述原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，对β-actin转录本上4个碱基长的序列进行原位测序
[0087]
1.杂交探针的设计
[0088]
根据待检序列的靶向序列，筛选出杂交效率高、特异性好、无高级结构的区段，设计杂交探针，该杂交探针靶向mrna上一段序列。表1
[0089][0090]
2.探针预处理
[0091]
应用t4多聚核苷酸激酶(pnk)对半闭合锁式探针、4碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的5’端进行磷酸化处理；
[0092]
3.样品杂交
[0093]
①
该方法在细胞样品上进行试验。要培养细胞至足够的数量进行试验，并且为方便后续操作，首先，在玻璃底培养皿中培养细胞至80％满，在实验前弃掉培养基，在玻璃底培养皿上制备一个反应腔室。pbst(含0.1％ tween-20的pbs)洗3次，去除残留培养基以及其它杂质。
[0094]
②
为了使细胞保持形态，并让其中的mrna保持原本的空间位置，用4％多聚甲醛对细胞固定10分钟，反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟，除去多余的pfa。
[0095]
③
为使细胞中原有的水分脱去，方便试剂进入和反应，在固定好的细胞上加入预冷的100％甲醇，立即放入-80℃孵育15分钟，进行组织脱水和变性。反应完成后，将样品从-80℃取出，置于室温平衡5分钟，然后将液体弃掉，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0096]
④
为了增加细胞通透性，让后续反应试剂中大分子试剂易于进入细胞，使用0.1m盐酸溶液透化细胞膜，使细胞膜上形成孔洞结构。该过程室温下处理细胞5分钟，反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0097]
⑤
细胞处理完成后，将含有锁式探针的杂交液加入到细胞样品上，探针的终浓度为100nm。37℃孵育过夜后，锁式探针结合到目标mrna上，形成互补结构。反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0098]
4.连接反应
[0099]
锁式探针杂交到mrna上后，需要将形成的缺口填补。这时，将含有4碱基随机片段
的连接体系加入到反应腔室里，随机片段的终浓度为100nm。25℃孵育2个小时，在连接酶的作用下，与rna互补配对的随机片段连接上半闭合锁式探针，形成完整的环状结构。反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0100]
5.滚环扩增
[0101]
锁式探针成环后，为了读取目标序列信息，要将捕获到的信息放大，此步骤采用滚环扩增的方式扩增锁式探针。配置含phi29dna聚合酶的滚环扩增体系，以rca引发探针为引物，完成连接反应的半闭合锁式探针为模板，混匀后加入到反应腔室中，30℃孵育2小时。反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0102]
6.原位测序(应用连接测序的原理)
[0103]
①
第一轮测序
[0104]
a.将含有锚定引物anchor-1和4种测序引物的连接测序体系加入反应腔室中进行原位测序反应，25℃孵育2小时。锚定引物和测序引物的序列如表2所示。
[0105]
表2
[0106][0107]
反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。加入0.1μg/ml的dapi染细胞核，室温孵育5分钟。反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0108]
b.应用leica tcs sp8激光共聚焦进行成像，对待测的第一位碱基进行测序结果读取，同时解读目标mrna的数量、空间位置及序列信息。设置好不同荧光对应的通道，观察并设置细胞信号的范围，以0.4μm的步径对样品进行层扫，然后叠加各层图像获得整体信号的图像。
[0109]
②
第二轮测序
[0110]
a.配置70％甲酰胺洗脱缓冲液，加入至反应腔室中，室温孵育5分钟，将第一轮的测序信号洗脱掉。反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0111]
b.将含有锚定引物anchor-2和4种测序引物的连接测序体系加入反应腔室中，按照第一轮测序的反应时间及流程，对待测的第二位碱基进行测序结果读取。第二轮成像时，必须保持与第一次成像时相同的位置及参数。
[0112]
③
第三轮测序
[0113]
a.配置70％甲酰胺洗脱缓冲液，加入至反应腔室中，室温孵育5分钟，将第二轮的测序信号洗脱掉。反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0114]
b.将含有锚定引物anchor-3和4种测序引物的连接测序体系加入反应腔室中，按照第一轮测序的反应时间及流程，对待测的第三位碱基进行测序结果读取。第三轮成像时，必须保持成像时相同的位置及参数。
[0115]
③
第四轮测序
[0116]
a.配置70％甲酰胺洗脱缓冲液，加入至反应腔室中，室温孵育5分钟，将第三轮的测序信号洗脱掉。反应完成后弃掉液体，室温下pbst洗3次，每次5分钟。
[0117]
b.将含有锚定引物anchor-4和4种测序引物的连接测序体系加入反应腔室中，按照第一轮测序的反应时间及流程，对待测的第四位碱基进行测序结果读取。第四轮成像时，必须保持成像时相同的位置及参数。
[0118]
7.数据分析
[0119]
对上述获得的四轮测序信息进行匹配，解读出锁式探针形成的gap中捕获的mrna序列。
[0120]
如图4所示：靶序列位于β-actin基因转录的mrna上，待测部分为其上一段4个碱基长的序列，根据已有资料，序列为5
’‑
ggcc-3’。试验过程中，使用的测序探针发出不同的荧光颜色，分别对应着测序到了不同的碱基。其对应关系如下：绿色——测序到a(腺嘌呤)；红色——测序到c(胞嘧啶)；品红色——测序到t(胸腺嘧啶)；靛青色——测序到g(鸟嘌呤)。从待测序列5’端向3’端依次测序，根据我们的实验结果，得到的图像颜色为：红色-红色-靛青色-靛青色，即对应测序的结果为：5
’‑
ggcc-3’，与预期完全相符。
[0121]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：包括以下步骤：1)探针的设计根据待检序列筛选出杂交效率高、特异性好、无高级结构的靶向区域，设置杂交探针；其中，所述的杂交探针包括半闭合锁式探针和rca引发探针；所述半闭合锁式探针与待检序列的靶向序列互补后会在半闭合锁式探针5’和3’端间形成空缺，所述空缺由x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段填补并与待检序列的靶向序列互补；其中，x为2、3、4、5、6、7、8
……
；2)探针预处理对杂交探针中的半闭合锁式探针、x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的5’端进行磷酸化；3)样品杂交在待测样本上制备一个反应腔室，用4％的多聚甲醛(pfa)对样本进行固定，然后用甲醇脱水和变性，再将含有杂交探针的体系加入其中孵育一段时间；4)连接反应将含有x个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的连接体系加入到反应腔室中，使与待检序列互补配对的半闭合锁式探针上的空缺(gap)被填补，形成闭合的环状结构；5)滚环扩增rca引发探针同时与待检序列的靶向序列和半闭合锁式探针互补，在phi29 dna聚合酶的作用下，以rca引发探针为引物，半闭合锁式探针形成的环状结构为模板，进行滚环扩增，将目标信号放大；6)对靶序列原位测序ⅰ.原位测序将含有锚定引物和测序引物的测序体系加入反应腔室中进行原位测序反应，对半闭合锁式探针之间的空缺中第一位碱基对应的序列进行测序成像，解读待检序列的靶向序列的空间位置及序列信息；ⅱ.同法依次解读半闭合锁式探针之间的空缺中其它位置碱基序列的信息；ⅲ.对上述获得的多轮测序信息进行匹配，解读半闭合锁式探针之间形成空缺对应的靶向序列。2.根据权利要求1所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述步骤1)中，待检序列的靶向序列由4段连续的靶序列a、d、b和c组成，所述半闭合锁式探针由5’端至3端’为a’序列，loop序列和b’序列，所述a’序列和b’序列分别与靶序列a、靶序列b互补，所述半闭合锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成；所述空缺的序列d’与靶序列d互补。3.根据权利要求2所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述空缺的序列d’由y段序列组成，所述y小于x且y为1、2、3、4、5、6、7、8
……
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4.根据权利要求3所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述空缺的序列d’中，x为2～8个，y为1～6。5.根据权利要求4所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述步骤1)中，x为4个，y为1个。6.根据权利要求1所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述步骤2)中，对单链脱氧核糖核酸随机片段的5’端进行磷酸化。7.根据权利要求1所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述步骤2)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为t4多聚核苷酸激酶。8.根据权利要求1所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述步骤4)中，连接酶反应体系的连接酶为splint r连接酶。9.根据权利要求5所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述步骤6)中，对靶序列原位测序ⅰ.原位测序将含有锚定引物和测序引物的测序体系加入反应腔室中进行原位测序反应，对半闭合锁式探针之间的空缺中第一位碱基对应的序列进行测序成像，解读靶向序列的数量、空间位置及序列信息；ⅱ.同法依次解读半闭合锁式探针之间的空缺中第二位、第三位、第四位碱基序列的信息；ⅲ.对上述获得的四轮测序信息进行匹配，解读半闭合锁式探针之间形成空缺对应的靶向序列。10.一种权利要求1所述的适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法在点突变检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用，该方法通过设计捕获靶向区域的半闭合锁式探针，通过连接酶填补探针上的空缺，经滚环扩增实现对待检未知序列的测序，多轮连接测序可解析X个待检碱基。依据其探针设计特点，可对未知核酸序列测序，能应用于肿瘤点突变检测、连续突变检测等。可实现单细胞、单分子、单碱基分辨率的基因序列原位解读。该方法可进行高通量组织原位检测，获得组织样本不同细胞的目标序列的原位空间谱图，无需进行高难度的体外寡量特异性细胞富集建库测序。且信号解读不依赖于超分辨成像平台，在个体发育、遗传育种、肿瘤微环境及临床病理检测等领域均有较好的应用前景。病理检测等领域均有较好的应用前景。病理检测等领域均有较好的应用前景。


技术研发人员：曹罡 张凌凯 吴小凤 戴金霞
受保护的技术使用者：鲲羽生物科技（江门）有限公司
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/7/21