检测ARHGEF28表达量的物质在制备用于早产风险筛查的产品中的应用

检测arhgef28表达量的物质在制备用于早产风险筛查的产品中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及检测arhgef28表达量的物质在制备用于早产风险筛查的产品中的应用，尤其涉及检测血浆cfrna中arhgef28表达量的物质在制备用于早产风险筛查的产品中的应用。


背景技术：

2.世界卫生组织(who)将早产定义为妊娠37周之前或妇女末次月经第一日后不到259天的所有分娩。早产是目前发生率较高的产科综合征之一，也是导致新生儿死亡的重要原因之一，并且早产儿面临短期和长期疾病的风险增加。因此，提前识别早产风险尤为重要。目前较为常见的早产预测方法包括超声检查宫颈长度和检测宫颈阴道液分泌物中胎儿纤维连接蛋白(fetalfibronectin，ffn)的含量。但宫颈长度是多个因素作用的结果，宫颈长度的测量时间与测量次数未有确定的标准；ffn含量检测的阳性结果的可靠性有限。因此，上述两种早产预测方法都存在较为明显的局限性。建立新的早产预测方法具有重要的临床意义。
3.最近的研究指出可应用无创血液检测用于预测早产的生物标志物，与此前预测方法相比，无创血液检测技术具有以下优势：操作简便、安全性高、价格低，灵敏度高等。在早产率发生较高的中低收入国家及地区，这种无创性检测方法也能够得到广泛应用。研究调查结果显示，无创血液检测的早产预测标志物可来源于血清、血浆、全血等，种类可以是蛋白质、代谢物、dna、rna等。其中，无细胞循环rna(cfrna)是新提出的无创性诊断疾病的重要分子标记物。已有研究发现，cfrna可预测胎龄、跟踪妊娠健康，在早产领域发挥关键作用。cfrna已成为发现早产新型生物标志物的有力工具，但针对中国人群的早产预测领域研究尚不充分。此外，早产的病因机制具有复杂性，对其了解尚不深入。因此，探索新的方法鉴定早产潜在的cfrna标志物具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的为如何进行早产风险筛查。
5.本发明首先保护一种用于早产风险筛查的系统，可为检测血浆cfrna中arhgef28表达量的系统；根据血浆cfrna中arhgef28表达量获得2-δct值，训练机器学习模型，获得支持向量机的机器学习模型作为分类模型，从而实现早产风险筛查。
6.上述系统中，所述检测血浆cfrna中arhgef28表达量的系统可包括采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对表达量所需的试剂。
7.上述系统中，所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对表达量所需的试剂可为采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂；所述内参为gapdh。
8.上述系统中，所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参
的表达量所需的试剂包括检测arhgef28的引物和检测gapdh的引物；
9.检测arhgef28的引物如seq id no:1和seq id no:2所示；
10.检测gapdh的引物如seq id no:3和seq id no:4所示。
11.上述系统中，所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂还可包括ercc-正向引物和ercc-反向引物；ercc-正向引物和ercc-反向引物用于将孕妇血浆的总rna逆转录为孕妇血浆的cdna(作为外参)。
12.ercc-正向引物的核苷酸序列如seq id no:5所示。
13.ercc-反向引物的核苷酸序列如seq id no:6所示。
14.所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂具体可由所述检测arhgef28的引物和所述检测gapdh的引物组成。
15.所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂具体可由所述检测arhgef28的引物、所述检测gapdh的引物、所述ercc-正向引物和所述ercc-反向引物组成。
16.上述任一所述的系统中，所述早产可为妊娠不足37周分娩。
17.上述任一所述的系统中，所述早产可为晚期早产。所述晚期早产可为妊娠34～37周(不含37周)分娩。
18.本发明还保护采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对表达量所需的试剂在制备用于早产风险筛查的产品中的应用。
19.上述应用中，所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对表达量所需的试剂可为采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂；所述内参为gapdh。
20.上述应用中，所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂包括检测arhgef28的引物和检测gapdh的引物；
21.检测arhgef28的引物如seq id no:1和seq id no:2所示；
22.检测gapdh的引物如seq id no:3和seq id no:4所示。
23.上述应用中，所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂还可包括ercc-正向引物和ercc-反向引物；ercc-正向引物和ercc-反向引物用于将孕妇血浆的总rna逆转录为孕妇血浆的cdna。
24.ercc-正向引物的核苷酸序列如seq id no:5所示。
25.ercc-反向引物的核苷酸序列如seq id no:6所示。
26.上述任一所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂具体可由所述检测arhgef28的引物和所述检测gapdh的引物组成。
27.上述任一所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂具体可由所述检测arhgef28的引物、所述检测gapdh的引物、所述ercc-正向引物和所述ercc-反向引物组成。
28.本发明还保护血浆cfrna中arhgef28作为标志物在制备用于早产风险筛查的产品中的应用。
29.上述应用中，以血浆cfrna中arhgef28作为标志物，根据血浆cfrna中arhgef28表达量获得2-δct值，训练机器学习模型，获得支持向量机的机器学习模型作为分类模型，分
类模型输出0～1的概率值，根据概率值判断早产风险。在本发明的实施例中，0.415以上时认为孕妇早产风险较大，当早产分类模型输出概率值小于0.415时认为孕妇早产风险较小。
30.上述任一所述的应用中，所述早产可为妊娠不足37周分娩。
31.上述任一所述的应用中，所述早产可为晚期早产。所述晚期早产可为妊娠34～37周(不含37周)分娩。
32.本发明根据血浆中arhgef28单个cfrna的表达量建立了用于早产风险筛查的“arhgef28 panel”分类模型。arhgef28 panel由arhgef28单个cfrna组成，分类模型为支持向量机模型，auc可达99.0％；该模型的特异性为91.7％，敏感度为87.5％。对于“arhgef28 panel”分类模型中的arhgef28，本发明的发明人在41份独立队列的血浆样本中使用rt-qpcr验证。通过差异表达分析，验证了相对于足月孕妇，arhgef28在早产孕妇血浆cfrna中的表达具有显著差异。由此可见，本发明提供的“arhgef28 panel”分类模型是以血浆为检测对象，借助血浆cfrna中arhgef28表达量进行早产风险筛查。血浆cfrna中arhgef28可以作为早产标志物，是无创性早产风险筛查工具开发的良好补充。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
33.图1为采用血浆cfrna中arhgef28表达量预测早产的roc曲线分析结果。(a)为arhgef28预测早产在训练集和测试集上的表现，模型为支持向量机模型。(b)为arhgef28预测晚期早产在训练集和测试集上的表现，模型为支持向量机模型。
34.图2为通过rt-qpcr验证“arhgef28 panel”分类模型中的arhgef28的生物标志物，验证队列为24个早产孕妇和17个足月孕妇。mann-whitney u检验。***表示差异显著，p《0.001。
具体实施方式
35.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
36.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
37.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
38.下述实施例中，如无特殊说明，各核苷酸序列的第1位均为5
′
末端核苷酸，末位均为3
′
末端核苷酸。
39.下述实施例中，所有的志愿者或提供者均知情同意。
40.灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率。灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。
41.特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率。特异度越大越好，理想特异度为100％。
42.下述实施例中，早产是指妊娠不足37周分娩。其中，晚期早产胎龄界定为34～37
周，即晚期早产为妊娠34～37周(不含37周)分娩。
43.实施例
44.一、研究对象
45.早产组：入选标准为妊娠结局为早产单胎活产且无严重器质性疾病或精神疾病的孕妇。早产组由24名早产孕妇组成，其中18名为晚期早产孕妇。
46.足月组：入选标准为妊娠结局为足月单胎活产。足月组由17名足月孕妇组成。
47.早产组和足月组的临床特征见表1。
48.表1
[0049] 早产组(n＝24)足月组(n＝17)母亲年龄(岁)30.3
±
3.530.1
±
5.0胎龄(周)34.7
±
1.939.7
±
0.8初产妇(％)54.235.3男性胎儿(％)47.141.0母亲bmi(kg/m2)26.2
±
3.827.4
±
3.6
[0050]
二、双引物rt-qpcr定量检测血浆cfrna的arhgef28 panel(由arhgef28组成)中arhgef28的2-δct值
[0051]
1、采用trizol(invitrogen公司的产品，产品目录号为15596018)提取孕妇血浆的总rna。
[0052]
2、取孕妇血浆的总rna，采用reverse transcription system逆转录试剂盒(promega公司的产品，产品目录号为a3500)进行反转录，得到孕妇血浆的cdna。具体步骤如下：
[0053]
(2-1)制备反应体系1。反应体系1为14.5μl，由10.5μl孕妇血浆的总rna、2μl随机引物、1μl 10mm dntp mix和0.5μl ercc-正向引物稀释液(溶剂为depc)和0.5μlercc-反向引物稀释液(溶剂为depc)组成。ercc-正向引物稀释液中，ercc-正向引物的浓度为0.001μmol/l。ercc-反向引物稀释液中，ercc-反向引物的浓度为0.001μmol/l。
[0054]
ercc-正向引物为：5
’‑
caacggtgcaatctcagcta-3’(seq id no:5)。
[0055]
ercc-反向引物为：5
’‑
cacgaggatgttcctgttga-3’(seq id no:6)。
[0056]
(2-2)将反应体系1置于pcr仪，65℃孵育5min，然后置于冰上2min，得到反应液。
[0057]
(2-3)制备反应体系2。反应体系2为20μl，由14.5μl步骤(2-2)得到的反应液、4μl 10
×
reverse transcriptionbuffer、0.5μl rnasin和1μl amv reverse transcriptase组成。
[0058]
(2-4)将反应体系2置于pcr仪，首先25℃孵育10min，之后42℃孵育60min，最后85℃加热5min(目的为终止反应)，得到孕妇血浆的cdna。
[0059]
随机引物、10
×
reverse transcriptionbuffer、rnasin、dntp mixture和amv reverse transcriptase均为reverse transcription system逆转录试剂盒中的组件。
[0060]
2、以孕妇血浆的cdna为模板，采用qpcrgreen master mix(no rox)实时荧光定量pcr预混试剂(yesen公司的产品，产品目录号为11201es08)在荧光定量pcr仪中进行qpcr，根据输出的ct值，使用2-δct
法获得arhgef28的2
‑△
ct值(以gapdh作为内参)。
[0061]
反应体系为10μl，由1μl孕妇血浆的cdna、2μl正向引物水溶液(浓度为100μm)、2μl反向引物水溶液(浓度为100μm)和5μl qpcr sybr green master mix组成。qpcr sybr green master mix为qpcrgreen master mix(no rox)实时荧光定量pcr预混试剂中的组件。
[0062]
反应程序：95℃2min；95℃10s，60℃30s，50个循环。
[0063]
检测arhgef28和gapdh的正向引物和反向引物的核苷酸序列见表2。
[0064]
表2
[0065][0066]
三、构建“arhgef28 panel”分类模型
[0067]
本发明的发明人根据arhgef28 rt-qpcr的2-δct值，训练机器学习模型，最终确定一个支持向量机的机器学习模型作为分类模型(即“arhgef28 panel”分类模型)。训练数据为qpcr的2-δct值，特征为生物标志物arhgef28。得到的早产分类的支持向量机模型(简称早产分类模型)，具体函数如下：svm_pred＝predict(svm_model，data＝sample_data，decision.values＝true，probability＝t)，sample_data$pred_class《-predict(svm_model，sample_data，probability＝true),sample_data$pred_prob《-attr(sample_data$pred_class，"probabilities")。本发明的发明人发现当早产分类模型输出0～1的概率值，0.415以上时认为孕妇早产风险较大，当早产分类模型输出概率值小于0.415时认为孕妇早产风险较小。
[0068]“arhgef28 panel”分类模型预测早产风险的roc曲线分析结果见图1中(a)。arhgef28 panel由arhgef28单个cfrna组成，分类模型为支持向量机模型，auc可达99.0％；该模型的特异性为91.7％，敏感度为87.5％。
[0069]
本发明的发明人将12例晚期早产孕妇作为阳性训练集，9名足月孕妇作为阴性训练集，建立支持向量机模型；该模型的特异性为77.8％，该模型准确预测了所有晚期早产孕妇(敏感度：100％)(见图1中(b))。
[0070]
四、临床验证结果
[0071]
对于“arhgef28 panel”分类模型中的arhgef28，本发明的发明人在41份独立队列(24个早产孕妇组成的早产组和17个足月孕妇组成的足月组)的血浆样本中使用rt-qpcr验证。通过差异表达分析，验证了相对于足月孕妇，arhgef28在早产孕妇血浆cfrna中的表达具有显著差异(见图2，足月为足月组，早产为早产组)。
[0072]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。
总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.一种用于早产风险筛查的系统，为检测血浆cfrna中arhgef28表达量的系统；根据血浆cfrna中arhgef28表达量获得2-δct值，训练机器学习模型，获得支持向量机的机器学习模型作为分类模型，从而实现早产风险筛查。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述检测血浆cfrna中arhgef28表达量的系统包括采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对表达量所需的试剂。3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于：所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对表达量所需的试剂为采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂；所述内参为gapdh。4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂包括检测arhgef28的引物和检测gapdh的引物；检测arhgef28的引物如seq id no:1和seq id no:2所示；检测gapdh的引物如seq id no:3和seq id no:4所示。5.根据权利要求1至4任一所述的系统，其特征在于：所述早产为妊娠不足37周分娩。6.采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对表达量所需的试剂在制备用于早产风险筛查的产品中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对表达量所需的试剂为采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂；所述内参为gapdh。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述采用实时荧光定量pcr方法检测血浆cfrna中arhgef28相对内参的表达量所需的试剂包括检测arhgef28的引物和检测gapdh的引物；检测arhgef28的引物如seq id no:1和seq id no:2所示；检测gapdh的引物如seq id no:3和seq id no:4所示。9.血浆cfrna中arhgef28作为标志物在制备用于早产风险筛查的产品中的应用。10.根据权利要求6至9任一所述的应用，其特征在于：所述早产为妊娠不足37周分娩。

技术总结
本发明公开了检测ARHGEF28表达量的物质在制备用于早产风险筛查的产品中的应用。本发明根据血浆中ARHGEF28单个cfRNA的表达量建立了用于早产风险筛查的“ARHGEF28Panel”分类模型，ARHGEF28Panel由ARHGEF28单个cfRNA组成，分类模型为支持向量机模型。实验证明，“ARHGEF28Panel”分类模型的AUC可达99.0％，特异性为91.7％，敏感度为87.5％。由此可见，血浆cfRNA中ARHGEF28可以作为早产标志物，是无创性早产风险筛查工具开发的良好补充。本发明具有重要的应用价值。有重要的应用价值。


技术研发人员：朱昱敏 靳和玥
受保护的技术使用者：安徽医科大学
技术研发日：2023.03.17
技术公布日：2023/7/21