对微波辐射损伤敏感的抗氧化酶GPX4

对微波辐射损伤敏感的抗氧化酶gpx4
技术领域
1.本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及一种对微波辐射损伤敏感的抗氧化酶gpx4。


背景技术：

2.微波是一种频率在300mhz-300 ghz之间的电磁波，目前已广泛应用于军事、通讯、工业、医疗等各个领域。研究表明，微波暴露可危害人类健康，尤其是中枢神经系统的损伤。而海马神经元是微波暴露损伤效应的敏感靶标之一。微波暴露海马神经元损伤效应与氧化应激反应的激活密切相关。
3.因此，亟需发现敏感分子靶标用于微波辐射致神经元损伤的检测。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
5.本发明涉及一种对微波辐射损伤敏感的抗氧化酶：gpx4。本发明利用神经元中gpx4对微波辐射极度敏感的特性，通过采用免疫印迹等方法，检测神经元中gpx4相对表达量的下调水平，提供一种适用于微波辐射致神经元损伤的检测方法。
6.本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
7.谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,gpx4)是第四个含有硒元素的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,gpx)成员。gpx4的主要作用是在谷胱甘肽(glutathione,gsh)存在的情况下将有毒的脂质氢过氧化物还原为无毒的脂质醇，以保护细胞免遭氧化应激损伤。同时，敲除gpx4可导致小鼠胚胎死亡。因此gpx4不仅是一种限制性的gsh利用酶，也是一种最重要的硒蛋白。然而，gpx4作为关键氧化应激反应蛋白，在微波辐射致神经元损伤中的作用尚未见报道。发明人经过实验发现，在神经元损伤中，相比于其他蛋白，谷胱甘肽过氧化物酶4具有高特异性和高敏感性，可以作为经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物。
8.因此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物。根据本发明的实施例，所述生物标志物为谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4。发明人经过深入研究发现，经微波辐射后，在损伤的神经元中，相比于其他蛋白，谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达显著下调，表明谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4对微波辐射敏感，可以作为经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物。
9.根据本发明的实施例，所述神经元为海马组织神经元。
10.在本发明的另一个方面，本发明提出了谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4在作为确定经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物中的用途。
11.根据本发明的实施例，所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4在作为确定经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物中的用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
12.根据本发明的实施例，微波辐射后，所述神经元中的所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量降低，是出现所述神经元损伤的指示；微波辐射后，所述神经元中的所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量未降低，是未出现所述神经元损伤的指示。由此，能够对经微波辐射后是否发生神经元损伤进行准确判断，该方法具有操作简单、检测速度快、准确度高等优点。
13.根据本发明的实施例，所述神经元为海马组织神经元。
14.在本发明的又一个方面，本发明提出了检测谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于确定经微波辐射后生物样本是否出现神经元损伤。利用该试剂盒可以检测谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达水平，如谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4活性或编码谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4基因的表达量，从而可以快速、准确地确定经微波辐射后是否发生了神经元损伤，为微波辐射的生物医学研究和临床诊断分析奠定了基础。
15.根据本发明的实施例，所述试剂包括选自质谱试剂、免疫组织化学试剂和蛋白免疫印迹试剂中的至少之一。采用上述试剂，能够快速、准确地对神经元中的谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4表达量进行检测，且具有准确度高、使用方便等优点。
16.在本发明的又一个方面，本发明提出了谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4功能促进剂在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗经微波辐射后出现的神经元损伤或经微波辐射后出现的神经元损伤所引起的疾病或病症。如前所述，经微波辐射后，神经元中的谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4表达水平显著下调。进而，采用谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4功能促进剂以提升谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4表达水平，从而有助于预防或治疗经微波辐射后出现的神经元损伤或经微波辐射后出现的神经元损伤所引起的疾病或病症。
17.在本发明的又一个方面，本发明提出了一种确定经微波辐射后是否出现神经元损伤的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：测定经微波辐射前后生物样本中谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量；以及基于微波辐射前后生物样本中谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的变化，确定神经元是否损伤。由此，利用本发明的方法可以准确地确定经微波辐射后是否出现神经元损伤。
18.根据本发明的实施例，微波辐射后，所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量降低，是出现神经元损伤的指示；微波辐射后，所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量未降低，是未出现神经元损伤的指示。由此，该方法能够对经微波辐射后是否发生神经元损伤进行准确判断，该方法具有操作简单、检测速度快、准确度高等优点。
19.根据本发明的实施例，所述生物样本选自海马组织。
20.根据本发明的实施例，所述海马组织选自离体海马组织。
21.需要说明的是，本技术中所述的“离体海马组织”可以是经购买获得的，也可以是自行分离获得的。
22.在本发明的又一个方面，本发明提出了一种构建神经元损伤模型的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用微波辐射待建模型；测定辐射后待建模型组织中谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达水平；基于辐射后待建模型海马组织中谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达水平，确定目标模型。由此，根据本发明实施例的方法可以准确地构建出神经元损伤的模型。
23.根据本发明的实施例，辐射后谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达水平降低，是待建模型为目标模型的指示。
24.根据本发明的实施例，所述待建模型为海马组织。
25.根据本发明的实施例，所述海马组织选自离体海马组织。
26.需要说明的是，本技术中所述的“离体海马组织”可以是经购买获得的，也可以是自行分离获得的。
27.根据本发明的实施例，所述微波辐射的参数如下：微波频率为2～3ghz，平均功率密度为20～40mw/cm2，辐射时间为10～20分钟。
28.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
29.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
30.图1是根据本发明实施例的大鼠海马神经元显微结构的变化图，其中：
31.图1a为假辐射组(sham组)海马神经元显微结构；
32.图1b为微波辐射组(mw组)海马神经元显微结构；
33.图2是根据本发明实施例的大鼠海马神经元超微结构的变化图，其中：
34.图2a为sham组海马神经元超微结构；
35.图2b为mw组海马神经元超微结构；
36.图3是根据本发明实施例的海马组织抗氧化酶gpx4的表达变化图，其中：
37.图3a为sham组和mw组gpx4和gapdh蛋白免疫印迹条带；
38.图3b为gpx4和gapdh蛋白表达量统计图，*示p《0.05；
39.图4是根据本发明实施例的sham组和mw组的海马神经元细胞活力统计图；
40.图5是根据本发明实施例的ht22细胞抗氧化酶gpx4的表达变化图，其中：
41.图5a为sham组和mw组gpx4和gapdh蛋白免疫印迹条带；
42.图5b为gpx4和gapdh蛋白表达量统计图，*示p《0.05；
43.图6是根据本发明实施例的ht22细胞构建gpx4过表达后细胞中gpx4和gapdh蛋白免疫印迹条带；
44.图7是根据本发明实施例的ht22细胞构建gpx4过表达后sham组和mw组的海马神经元细胞活力统计图。
具体实施方式
45.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
46.实施例1对大鼠进行微波暴露
47.将体重180～200g(6～8周龄)二级雄性wistar大鼠随机分为2组，每组6只：假辐射
组(sham组)和微波辐射组(mw组)。采用微波辐射源进行全身均匀辐射。大鼠置于自制的辐射盒中，辐射盒不含金属物质，且大鼠在辐射盒中的体位固定。辐射参数为中心频率1.5ghz，平均功率密度30mw/cm2，辐射时间15min。sham组同样置于辐射盒内和辐射平台上，微波源不开机，其他条件与mw组相同。
48.实施例2大鼠海马神经元光镜观察
49.于辐射后1天，大鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g)后，断头处死，即刻取脑组织，并放入10％缓冲福尔马林固定。随后进行脱水、透明及浸蜡，石蜡包埋、切片及he染色，最后采用中性树胶封固，于光镜下观察海马神经元显微结构。
50.结果发现，sham组海马区神经元呈正常形态结构，锥体细胞核大而圆，均匀淡染，位于细胞中央，胞质呈弱嗜酸性，见图1中a；微波组部分海马神经元变性，表现为核固缩、深染，胞体皱缩呈梭形，见图1中b。提示微波辐射可导致海马神经元显微结构损伤。
51.实施例3大鼠海马神经元透射电镜观察
52.于辐射后1天，大鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠后，断头处死，即刻于冰上取1mm3海马组织块，并将其迅速置于2.5％戊二醛中固定，锇酸固定后，包埋切片，光镜下定位，醋酸铀和硝酸铅双重染色，最后于透射电镜下观察海马神经元超微结构改变。
53.结果发现，sham组海马超微结构基本正常，神经元胞核清晰，核膜完整，胞浆内线粒体、粗面内质网等形态较一致，分布均匀，见图2中a；微波组海马神经元线粒体肿胀空化、嵴断裂、消失(黄色箭头示)，见图2中b，表明微波辐射可导致海马神经元超微结构损伤。
54.实施例4大鼠海马组织抗氧化酶gpx4的检测
55.于辐射后1天，大鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠后，断头处死，即刻于冰上剥离海马组织。采用含蛋白酶抑制剂的ripa裂解液提取海马组织总蛋白，并采用bca法进行蛋白质浓度测定。采用jess分离试剂盒，按照其操作说明，于jess系统上对gpx4蛋白的表达进行检测分析。计算gpx4蛋白表达量和gapdh蛋白表达量的比值以获得gpx4的相对表达量。
56.结果表明，与sham组相比，mw组gpx4蛋白表达显著下调(p＜0.05)，见图3中a和图3中b所示。
57.实施例5对小鼠海马神经元ht22细胞进行微波暴露
58.将ht22细胞随机分为2组：假辐射组(sham组)和微波辐射组(mw组)。采用与实施例1一致的微波辐射参数。sham组同样置于辐射平台上，微波源不开机，其他条件与mw组相同。
59.实施例6小鼠海马神经元ht22细胞活力检测
60.采用cck-8试剂盒评估微波辐射后ht22细胞活力。于450nm波长下，采用酶标仪测量平均光密度值。
61.结果见图4所示，与sham组相比，mw组海马神经元细胞活力显著下调(p＜0.001)。
62.实施例7小鼠海马神经元ht22细胞抗氧化酶gpx4的检测
63.采用含蛋白酶抑制剂的ripa裂解液提取ht22细胞总蛋白，并采用bca法进行蛋白质浓度测定。采用jess分离试剂盒，按照其操作说明，于jess系统上对gpx4蛋白的表达进行检测分析。计算gpx4蛋白表达量和gapdh蛋白表达量的比值以获得gpx4的相对表达量。
64.结果表明，与sham组相比，mw组gpx4蛋白表达显著下调(p＜0.05)，见图5所示。
65.实施例8gpx4过表达小鼠海马神经元ht22细胞构建
66.采用ubigpx4-sv40-puro慢病毒载体转染ht22细胞，构建gpx4过表达(gpx4-oe)
ht22细胞。同时，阴性对照(nc)ht22细胞转染空载体。采用western blot方法验证gpx4过表达。结果见图6所示，与nc组相比，gpx4-oe组gpx4蛋白表达升高。
67.实施例9对gpx4过表达ht22细胞进行微波暴露
68.将gpx4-oe和nc ht22细胞均随机分为2组：假辐射组(sham组)和微波辐射组(mw组)。采用与实施例1一致的微波辐射参数。sham组同样置于辐射平台上，微波源不开机，其他条件与mw组相同。
69.实施例10gpx4过表达ht22细胞活力检测
70.采用cck-8试剂盒评估微波辐射后gpx4-oe和nc ht22细胞活力。于450nm波长下，采用酶标仪测量平均光密度值。
71.结果见图7所示，gpx4过表达可逆转mw引起的ht22细胞活力下降(p》0.05)。
72.本发明最终发现微波辐射后gpx4在神经元中特异性下调，提示gpx4是对微波辐射敏感的抗氧化酶，是一种可用于检测微波辐射致神经元损伤的方法。
73.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
74.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种确定经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4；任选地，所述神经元为海马组织神经元。2.谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4在作为确定经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物中的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，微波辐射后，所述神经元中的所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量降低，是出现所述神经元损伤的指示；任选地，所述微波辐射后，所述神经元中的所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量未降低，是未出现所述神经元损伤的指示；任选地，所述神经元为海马组织神经元。4.检测谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于确定经微波辐射后生物样本是否出现神经元损伤。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂包括选自质谱试剂、免疫组织化学试剂和蛋白免疫印迹试剂中的至少之一。6.谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4功能促进剂在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗经微波辐射后出现的神经元损伤或经微波辐射后出现的神经元损伤所引起的疾病或病症。7.一种确定经微波辐射后是否出现神经元损伤的方法，其特征在于，包括：测定经微波辐射前后生物样本中谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量；以及基于微波辐射前后生物样本中谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的变化，确定神经元是否损伤；任选地，微波辐射后，所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量降低，是出现神经元损伤的指示；任选地，微波辐射后，所述谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达量未降低，是未出现神经元损伤的指示；任选地，所述生物样本选自海马组织；任选地，所述海马组织选自离体海马组织。8.一种构建神经元损伤模型的方法，其特征在于，包括：利用微波辐射待建模型；测定辐射后待建模型组织中谷胱甘肽过氧化酶蛋白4物的表达水平；基于辐射后待建模型海马组织中谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达水平，确定目标模型；任选地，辐射后谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达水平降低，是待建模型为目标模型的指示；任选地，所述待建模型为海马组织；任选地，所述海马组织选自离体海马组织。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在，所述微波辐射的参数如下：微波频率为2～3ghz，平均功率密度为20～40mw/cm2，辐射时间为10～20分钟。

技术总结
本发明提出了一种确定经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物，所述生物标志物为谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4，所述神经元为海马组织神经元。经微波辐射后，在损伤的神经元中，相比于其他蛋白，谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4的表达显著下调，表明谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4对微波辐射敏感，可以作为经微波辐射后是否出现神经元损伤的生物标志物。出现神经元损伤的生物标志物。


技术研发人员：彭瑞云 王浩宇 赖云菲 董霁 赵黎 王惠 张静 徐新萍 姚斌伟
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2023.03.15
技术公布日：2023/7/21