KIF23在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用

kif23在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及kif23在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用。


背景技术：

2.多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,pcos)是育龄妇女常见的一种内分泌失调和生殖功能障碍性疾病，以慢性无排卵(排卵功能紊乱或丧失)和高雄激素血症为特征，临床表现主要为月经失调、不孕、多毛和肥胖等，伴有胰岛素抵抗、高胰岛素血症和高脂血症等代谢异常，对生殖发育健康影响极大。
3.pcos的临床表现存在异质性，对该疾病诊断的方法还有待完善。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供kif23(驱动蛋白家族成员23)在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用，以解决上述问题中的至少一种。
6.本发明的第二目的在于提供kif23联合utp6(u3小核仁rna相关蛋白14同源物)和/或pias4(活化stat 4蛋白抑制因子，sumo e3 ligase protein inhibitor of activated stat 4)在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用。
7.本发明的第三目的在于提供一种用于诊断多囊卵巢综合征的试剂。
8.本发明的第四目的在于提供一种用于诊断多囊卵巢综合征的试剂盒。
9.第一方面，本发明提供了kif23在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用，所述kif23为kif23基因的mrna或蛋白。
10.作为进一步技术方案，所述产品包括试剂或试剂盒，通过检测受试者体内kif23基因的mrna或蛋白的表达量来诊断多囊卵巢综合征。
11.作为进一步技术方案，所述kif23基因的mrna或蛋白在多囊卵巢综合征患者中表达下调。
12.第二方面，本发明提供了kif23联合utp6和/或pias4在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用，所述kif23为kif23基因的mrna或蛋白；
13.所述utp6为utp6基因的mrna或蛋白；
14.所述pias4为pias4基因的mrna或蛋白。
15.作为进一步技术方案，所述产品包括试剂或试剂盒，通过检测受试者体内kif23基因的mrna或蛋白的表达量，以及utp6基因和/或pias4基因的mrna或蛋白的表达量来诊断多囊卵巢综合征。
16.作为进一步技术方案，所述kif23基因的mrna或蛋白在多囊卵巢综合征患者中表达下调；
17.所述utp6基因的mrna或蛋白在多囊卵巢综合征患者中表达下调；
18.所述pias4基因的mrna或蛋白在多囊卵巢综合征患者中表达下调。
19.第三方面，本发明提供了一种用于诊断多囊卵巢综合征的试剂，所述试剂包括用于检测kif23基因mrna的引物或用于检测kif23基因蛋白的生物大分子。
20.作为进一步技术方案，所述试剂还包括用于检测utp6基因mrna的引物或用于检测utp6基因蛋白的生物大分子；
21.和/或，所述试剂还包括用于检测pias4基因mrna的引物或用于检测pias4基因蛋白的生物大分子。
22.作为进一步技术方案，所述生物大分子包括抗体或抗体功能片段。
23.第四方面，本发明提供了一种用于诊断多囊卵巢综合征的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂。
24.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
25.经发明人研究发现，与健康受试者相比，kif23在多囊卵巢综合征患者中表达下调，kif23的表达与多囊卵巢综合征相关，通过检测kif23的表达量能够实现多囊卵巢综合征的诊断。此外，经发明人进一步研究发现，与健康受试者相比，utp6和pias4在多囊卵巢综合征患者中存在差异表达，utp6和pias4的表达与多囊卵巢综合征相关，将kif23与utp6和pias4联合用于多囊卵巢综合征的诊断具有更高的检测准确度。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为pcos组和对照组kif23基因的表达量；
28.图2为pcos组和对照组utp6基因的表达量；
29.图3为pcos组和对照组pias4基因的表达量；
30.图4为kif23基因用于诊断pcos的roc曲线；
31.图5为kif23基因和utp6基因联合用于诊断pcos的roc曲线；
32.图6为kif23基因和pias4基因联合用于诊断pcos的roc曲线；
33.图7为kif23基因、utp6基因和pias4基因联合用于诊断pcos的roc曲线；
34.图8为实施例2提供的wb实验结果；
35.图9为pcos组和对照组kif23蛋白的表达量；
36.图10为pcos组和对照组utp6蛋白的表达量；
37.图11为pcos组和对照组pias4蛋白的表达量；
38.图12为kif23蛋白用于诊断pcos的roc曲线。
具体实施方式
39.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的
所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
40.第一方面，本发明提供了kif23在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用，所述kif23为kif23基因的mrna或蛋白。
41.经发明人研究发现，与健康受试者相比，kif23在多囊卵巢综合征患者中表达下调，kif23的表达与多囊卵巢综合征相关，通过检测kif23的表达量能够实现多囊卵巢综合征的诊断。
42.作为进一步技术方案，所述产品包括但不限于试剂或试剂盒，通过检测受试者体内kif23基因的mrna或蛋白的表达量来诊断多囊卵巢综合征。
43.第二方面，本发明提供了kif23联合utp6和/或pias4在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用，所述kif23为kif23基因的mrna或蛋白；
44.所述utp6为utp6基因的mrna或蛋白；
45.所述pias4为pias4基因的mrna或蛋白。
46.经发明人进一步研究发现，与健康受试者相比，utp6和pias4在多囊卵巢综合征患者中差异表达下调，utp6和pias4的表达与多囊卵巢综合征相关，将kif23与utp6和pias4联合用于多囊卵巢综合征的诊断具有更高的检测准确度。
47.作为进一步技术方案，所述产品包括但不限于试剂或试剂盒，通过检测受试者体内kif23基因的mrna或蛋白的表达量，以及utp6基因和/或pias4基因的mrna或蛋白的表达量来诊断多囊卵巢综合征。
48.需要说明的是，以上“和/或”是指可以是utp6基因的mrna或蛋白，也可以是pias4基因的mrna或蛋白，还可以是utp6基因和pias4基因的mrna或蛋白。
49.第三方面，本发明提供了一种用于诊断多囊卵巢综合征的试剂，所述试剂包括用于检测kif23基因mrna的引物或用于检测kif23基因蛋白的生物大分子。
50.本发明提供的试剂通过特异性识别kif23基因mrna的引物以实现对kif23基因mrna表达量的检测，或者通过特异性识别kif23基因蛋白的生物大分子以实现对kif23基因蛋白表达量的检测。本发明提供的试剂通过检测kif23基因的mrna或蛋白的表达量来诊断多囊卵巢综合征。
51.作为进一步技术方案，所述试剂还包括用于检测utp6基因mrna的引物或用于检测utp6基因蛋白的生物大分子；
52.和/或，所述试剂还包括用于检测pias4基因mrna的引物或用于检测pias4基因蛋白的生物大分子。
53.通过对kif23，以及utp6和/或pias4进行联合检测，能够进一步提高本发明试剂用于诊断多囊卵巢综合征的准确度。
54.蛋白的检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该蛋白发生抗原抗体反应，且标记有荧光标记的生物大分子等。
55.作为进一步技术方案，所述生物大分子包括抗体或抗体功能片段。
56.在一些优选的实施方式中，所述试剂的检测样本包括卵细胞或外周血。
57.第四方面，本发明提供了一种用于诊断多囊卵巢综合征的试剂盒，所述试剂盒包
括上述试剂。
58.本发明提供的试剂盒包括以上试剂，具有该试剂的全部有益效果，能够用于诊断多囊卵巢综合征。
59.下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
60.实施例1
61.1、临床标本纳入
62.入选标准：标本均来自中国医学科学院北京协和医院妇产科。
63.对照组：
64.①
年龄20-35岁；
65.②
无pcos，不合并卵巢囊肿、卵巢功能衰退等影响卵巢功能的疾病；
66.③
采用长方案促排卵；
67.④
bmi稳定于18.5至26kg/m2之间。
68.pcos组：
69.①
年龄20-35岁；
70.②
根据鹿特丹标准诊断pcos；
71.③
采用长方案促排卵；
72.④
bmi稳定于18.5至26kg/m2之间。
73.排除标准：
74.包含其他因素不孕；
75.①
高泌乳素血症、甲状腺功能异常；
76.②
2型糖尿病；
77.③
血清fsh》10miu/ml；
78.④
子宫内膜异位症。
79.pcos患者按照长方案进行促排卵治疗，患者通过gnrh激动剂进行降调，然后予以fsh或hmg进行卵巢刺激，当三枚卵泡直径达到18mm，予以hcg促卵泡成熟，36小时后取卵。对照组采用长方案促排卵，并获得卵细胞。pcos组和对照组的卵子来源信息汇总如表1所示。
80.表1人卵子来源信息汇总
[0081][0082]
[0083]-缩写:bmi,体重指数；d2,第2天；fsh,促卵泡激素；lh,促黄体激素；e2,雌二醇；testosterone，睾酮；tsh,促甲状腺激素；t3,三碘甲腺原氨酸；t4,四碘甲状腺素；ldl-c,低密度脂蛋白胆固醇；hdl-c,高密度脂蛋白胆固醇；tg,甘油三酯；t-cho,总胆固醇；ivf,体外受精；prolactin，催乳素。-p-value of《0.05代表统计学差异显著.数值mean
±
sd(范围)表示。
[0084]
2、单细胞测序
[0085]
采用illumina hiseq 4000对上述获得的卵细胞进行测定，获得scrna-seq数据。
[0086]
单细胞转录组scrna-seq文库制备包括：
[0087]
1)细胞样品准备：用巴斯德吸管吸取不同时期生殖细胞，重悬于1
×
pbs后置于ep管最底部。冰上操作。
[0088]
2)第一链cdna合成：配制lysis buffer，加入含有单个细胞的ep管中，加入oligo(dt)vn primer,dntp mix,轻轻混匀后于pcr仪器反应。反应条件：72℃延伸3min；立即置于冰上2min。配制逆转录反应体系，进行42℃ 90min；70℃ 15min；4℃冷却。
[0089]
3)全长cdna扩增及纯化：配制pcr扩增体系，混匀后于pcr仪器反应。反应条件：98℃变性10s；65℃退火15s；72℃延伸6min(16个cycle)；72℃延伸5min；4℃冷却。经磁珠分选后纯化，使用agilent 2100bioanalyzer进行产物质控与鉴定。
[0090]
4)文库构建与上机：将上述产物片段后按dna文库制备试剂盒操作后上机至illumina hiseq平台，采用pe150模式测序。
[0091]
3、结果
[0092]
pcos组和对照组kif23基因的表达量如图1所示，pcos组和对照组utp6基因的表达量如图2所示，pcos组和对照组pias4基因的表达量如图3所示。结果表明，与对照组相比，pcos组中kif23基因表达下调，utp6基因和pias4基因差异表达下调，kif23基因、utp6基因或pias4基因具有作为诊断标志物用于pcos诊断的潜力。
[0093]
发明人根据kif23基因、utp6基因和pias4基因的测序数据，建立了kif23基因用于诊断pcos的roc曲线(图4)，auc值为0.639；将kif23基因和utp6基因联用，建立了kif23基因和utp6基因联合用于诊断pcos的roc曲线(图5)，auc值为0.741；将kif23基因和pias4基因联用，建立了kif23基因和pias4基因联合用于诊断pcos的roc曲线(图6)，auc值为0.778；将kif23基因、utp6基因和pias4基因联用，建立了kif23基因、utp6基因和pias4基因联合用于诊断pcos的roc曲线(图7)，auc值为0.787。结果表明，kif23基因单独作为诊断标志物用于pcos的诊断具有一定的准确度，将kif23基因联合utp6基因和/或pias4基因共同用于pcos的诊断，具有相较于单一标志物(kif23基因)具有更高的准确度。
[0094]
实施例2
[0095]
发明人对pcos患者和健康受试者的外周血进行提取全蛋白以验证上述结论。抗凝管收集血液，每300ul蛋白提取液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul蛋白稳定剂，冰上操作。取300ul全血样品，加入300ul冷却的蛋白提取液，充分混匀，4℃震荡10分钟，12000g，离心10分钟后收集上清，即为全血总蛋白。
[0096]
pcos患者(pcos组)和健康受试者(对照组)的纳入标准同实施例1，临床信息如表2所示。
[0097]
表2pcos组和对照组的临床信息
[0098][0099][0100]-缩写:bmi,体重指数；d2,第2天；fsh,促卵泡激素；lh,促黄体激素；e2,雌二醇；testosterone，睾酮；tsh,促甲状腺激素；t3,三碘甲腺原氨酸；t4,四碘甲状腺素；ldl-c,低密度脂蛋白胆固醇；hdl-c,高密度脂蛋白胆固醇；tg,甘油三酯；t-cho,总胆固醇；ivf,体外受精；prolactin，催乳素。-p-value of《0.05代表统计学差异显著.数值mean
±
sd(范围)表示。
[0101]
wb实验结果如图8所示，pcos组和对照组kif23蛋白的表达量如图9所示，pcos组和对照组utp6蛋白的表达量如图10所示，pcos组和对照组pias4蛋白的表达量如图11所示。结果表明，与对照组相比，pcos组中kif23蛋白、utp6蛋白和pias4蛋白差异表达下调，验证了kif23基因以及与utp6基因和/或pias4基因能够作为标志物用于pcos的诊断。
[0102]
发明人根据kif23蛋白的表达量数据，建立了kif23蛋白用于诊断pcos的roc曲线(图12)，auc值为0.943。结果表明，kif23蛋白单独作为诊断标志物用于pcos的诊断具有较高的准确度。
[0103]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.kif23在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用，其特征在于，所述kif23为kif23基因的mrna或蛋白。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒，通过检测受试者体内kif23基因的mrna或蛋白的表达量来诊断多囊卵巢综合征。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述kif23基因的mrna或蛋白在多囊卵巢综合征患者中表达下调。4.kif23联合utp6和/或pias4在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用，其特征在于，所述kif23为kif23基因的mrna或蛋白；所述utp6为utp6基因的mrna或蛋白；所述pias4为pias4基因的mrna或蛋白。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒，通过检测受试者体内kif23基因的mrna或蛋白的表达量，以及utp6基因和/或pias4基因的mrna或蛋白的表达量来诊断多囊卵巢综合征。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述kif23基因的mrna或蛋白在多囊卵巢综合征患者中表达下调；所述utp6基因的mrna或蛋白在多囊卵巢综合征患者中表达下调；所述pias4基因的mrna或蛋白在多囊卵巢综合征患者中表达下调。7.一种用于诊断多囊卵巢综合征的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于检测kif23基因mrna的引物或用于检测kif23基因蛋白的生物大分子。8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括用于检测utp6基因mrna的引物或用于检测utp6基因蛋白的生物大分子；和/或，所述试剂还包括用于检测pias4基因mrna的引物或用于检测pias4基因蛋白的生物大分子。9.根据权利要求7或8所述的试剂，其特征在于，所述生物大分子包括抗体或抗体功能片段。10.一种用于诊断多囊卵巢综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求7-8任一项所述的试剂。

技术总结
本发明提供了KIF23在制备诊断多囊卵巢综合征的产品中的应用，涉及生物技术领域。经发明人研究发现，与健康受试者相比，KIF23在多囊卵巢综合征患者中表达下调，KIF23的表达与多囊卵巢综合征相关，通过检测KIF23的表达量能够实现多囊卵巢综合征的诊断。此外，经发明人进一步研究发现，与健康受试者相比，UTP6和PIAS4在多囊卵巢综合征患者中存在差异表达，UTP6和PIAS4的表达与多囊卵巢综合征相关，将KIF23与UTP6和PIAS4联合用于多囊卵巢综合征的诊断具有更高的检测准确度。的诊断具有更高的检测准确度。的诊断具有更高的检测准确度。


技术研发人员：权利要求书1页说明书7页附图6页
受保护的技术使用者：中国医学科学院北京协和医院
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/21