一株嗜线虫诺卡氏菌及其在玫瑰白粉病防治中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株嗜线虫诺卡氏菌及其在玫瑰白粉病防治中的应用。


背景技术：

2.玫瑰白粉病是由毡毛叉丝单囊壳菌（podosphaera pannosa）侵染所引起的、发生在玫瑰上的病害，主要危害玫瑰叶片及花蕾。近年来，随着玫瑰品种结构优化、种植区域和规模扩大，白粉病频发，危害呈加重趋势，在温室条件下栽培的玫瑰白粉病发病率在70%左右，严重影响玫瑰的品质和产量。
3.目前人们通过广泛使用化学杀菌剂、培育抗病品种，在一定程度上减轻白粉病的危害，但白粉病病原菌不断产生新的生理小种，使植株抗性减弱甚至消失、病原菌抗药性增强。同时，化学药剂的大量使用导致玫瑰农残超标、环境污染加重。因此，发掘新的生防资源并研发高效、安全、无毒、环境友好型的生防制剂对玫瑰生产意义重大。
4.与传统的化学农药相比，微生物源生防制剂具有环境相容性好、安全、无残留、不易产生抗药性等优点，通常被认为是传统化学农药的有效替代物。 微生物源生防制剂相关的理论和技术的研究日益为人们所关注，已经成为生物防治研究的热点，一些微生物源生防制剂在病害防治、环境保护等领域中发挥了重要作用。


技术实现要素：

5.本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一株嗜线虫诺卡氏菌及其在玫瑰白粉病防治中的应用，用以提供一种运用于玫瑰白粉病防治的微生物源菌剂研发的菌株，避免或减少由不合理使用化学农药所导致的抗药性增强、环境污染和人类健康威胁问题。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：本发明公开的嗜线虫诺卡氏菌rbj，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省科学院微生研究所，510070，保藏日期2022年11月28日，保藏编号gdmcc no:63014 。
7.如上所述的嗜线虫诺卡氏菌rbj，其中，嗜线虫诺卡氏菌rbj菌株的培养方法包括：将菌株接种到r2a培养基(r2a培养基配方：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，ph 7 .0-7 .4)斜面上，于30℃条件下培养7天后获得斜面种子；将斜面种子接种到三角瓶中的r2a液体培养基(未添加琼脂的r2a培养基)中，于30℃、180 rpm条件下振荡培养5天后获得液体种子；将液体种子按5％的体积比例接入发酵罐中的r2a液体培养基中，在30℃，150 rpm条件下搅拌发酵96 h后获得嗜线虫诺卡氏菌rbj菌株发酵液。
8.本发明公开的嗜线虫诺卡氏菌rbj在玫瑰白粉病防治中的应用。优选的，利用嗜线虫诺卡氏菌rbj菌株发酵液用清水稀释30倍后喷雾玫瑰植株地上部分。
9.应用中以嗜线虫诺卡氏菌rbj的菌悬液、发酵产物、培养液或含有其的菌剂应用在制备防治玫瑰白粉病制剂产品中，该制剂产品以上述物质为活性成分，还可以包括其他适用的辅料，按常规剂量添加，制备成实用的产品剂型。
10.使用时，在植物生长过程中进行喷雾处理；喷雾为上述嗜线虫诺卡氏菌rbj在特定培养基中的菌悬液、发酵液、培养液或含有其的菌剂。
11.本发明的优点是：1、本发明利用嗜线虫诺卡氏菌rbj菌株制备的菌剂在盆栽试验中对玫瑰白粉病的防效可达81.2%，在温室大田试验中防效可达70.3%，且可明显提高玫瑰的品质和产量。
12.2、本发明利用嗜线虫诺卡氏菌rbj菌株制备的微生物菌剂，防治效果好、稳定性好、安全环保、不易产生抗性，且制备简单、使用成本低，便于大规模生产及推广应用。
实施方式
13.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
14.实施例1：嗜线虫诺卡氏菌（nocardioides nematodiphilus ）rbj的分离、鉴定1、菌株分离本发明发明人在探索玫瑰益生微生物时，采用传统的平板稀释涂布法从玫瑰健康叶片中分离、筛选，获得了一株对多种植物病原菌真菌菌丝生长具有极强的抑菌活性的菌株，编号为rbj。
15.2、rbj菌株的形态学鉴定菌株rbj接种到r2a培养基上，在30
°
c下培养7天，菌落呈乳白色至白色，光滑、圆形，菌落直径1.0-3.0 mm；细胞呈革兰氏染色阳性、需氧、非运动、杆状（宽0.4-0.6 μm，长0.9-1.0 μm）。该菌株在5-40
°
c的温度范围内生长，最适生长温度30
°
c; 在ph 6.0-9.0的范围内可以生长，最适生长ph为7.0。
16.3、rbj菌株的生理生化特征rbj菌株能够耐受含3.0%nacl的r2a培养基，过氧化氢试验、酸性磷酸酶水解试验、碱性磷酸酶试验、α-葡萄糖苷酶试验均为阳性；氧化酶试验、明胶酶试验、脂肪酶试验、脲酶试验均为阴性主要脂肪酸为iso-c16:0，mk-8（h4）为主要呼吸醌。
17.4、rbj菌株的分子学鉴定利用通用引物27f和1492r 对rbj菌株的16s rrna基因进行pcr扩增，经过dna测序获得的序列通过ezbiocloud（https://www.eabiocloud.net）数据库blast比对及序列分析，利用mega x构建系统发育树，确定rbj菌株的分类地位。rbj菌株的16s rdna与nocardioides nematodiphilus （genbank accession：kctc49528）的同一性最高，为99.9%。
18.结合rbj菌株的形态学特征、生理生化特征及16s rrna基因序列比对结果，将该
rbj菌株鉴定为嗜线虫诺卡氏菌（nocardioides nematodiphilus）。
19.该菌株是研发玫瑰白粉病生物农药的潜在生防菌株，而该细菌的抗真菌活性及其在玫瑰真菌病害防治中的应用未见报道。
20.实施例2：嗜线虫诺卡氏菌rbj对盆栽玫瑰白粉病的温室防治试验rbj菌剂的制备：将嗜线虫诺卡氏菌rbj液体种子按5％的体积比例接入发酵罐中的r2a液体培养基中，在30℃，150 rpm条件下搅拌发酵96 h后获得rbj菌剂，备用。
21.供试药剂：rbj菌剂，按本发明上述方法制备；对照化学农药为25%的乙嘧酚磺酸酯，山东青岛奥迪斯生物科技有限公司生产。
22.试验方法：在昆明市晋宁区玫瑰种植基地温室大棚内选取白粉病严重的植株27盆，带回实验室，编号并贴标签。
23.试验处理：rbj菌剂处理：rbj菌剂用清水稀释30倍后均匀喷雾到玫瑰植株上；化学农药处理：25%的乙嘧酚磺酸酯用清水稀释600倍后均匀喷雾到玫瑰植株上；空白对照处理：r2a液体培养基用清水稀释30倍后均匀喷雾到玫瑰植株上。每处理3个重复，每重复3盆。喷药后的玫瑰在自然条件下放置2 h，待植株上药液风干后移至27℃、相对湿度为65% 、光-暗周期为12 h-12 h、光照度3000 lx的人工气候培养室中，肥水管理按常规方法进行。每隔2天观察一次，并做好记录。
24.观察3次后发现，rbj菌剂处理和25%的乙嘧酚磺酸酯化学农药处理的植株白粉病菌丝变干、变薄，没有之前的蓬松感，孢子不易抖落，白粉病也没有加重的趋势，而空白对照处理的白粉病有加重的趋势。
25.在第一次处理10天后按照相同的方法进行第二次处理，之后每隔2天观察一次，观察3次后发现，rbj菌剂处理和25%的乙嘧酚磺酸酯化学农药处理的植株白粉病菌丝变干、变黑，除了原来的白粉残体，几乎无新增的白粉病。而空白对照处理的白粉病加重明显。
26.防效计算：以上各处理的玫瑰在2次药剂处理后，随机选取玫瑰叶片每盆5片，每处理共45片进行病级分级，统计病叶率并计算病情指数和防效。
27.白粉病调查分级标准：0 级：无病斑；1 级：病斑面积占整个叶片面积小于5%；3 级：病斑面积占整个叶片面积为5.1%～10%；5 级：病斑面积占整个叶片面积为10.1%～25%；7 级：病斑面积占整个叶片面积为25.1%～50%；9 级：病斑面积占整个叶片面积大于50%。
28.病情指数=100
×
∑(该级病叶数
×
病级值)/(调查总叶数
×
最高级代表值)防治效果=[（空白对照病情指数-处理病情指数）/ 空白对照病情指数]
×
100%。
[0029]
试验结果：在温室条件下rbj菌剂对玫瑰白粉病的防效为为81.2%，25%的乙嘧酚磺酸酯的防效为81.9%；二者差异不显著。
[0030]
表1 温室和大田条件下rbj菌剂及25%的乙嘧酚磺酸酯对玫瑰白粉病的防效表试验条件rbj菌剂25%的乙嘧酚磺酸酯温室试验81.2%a81.9%a大田试验70.3%a71.6%a注：同一栏中数值后的字母相同则表示差异不显著；反之则差异显著。
[0031]
实施例3：嗜线虫诺卡氏菌rbj对玫瑰白粉病的大田防治试验rbj菌剂的制备：将嗜线虫诺卡氏菌rbj液体种子按5％的体积比例接入发酵罐中的r2a液体培养基中，在30℃，150 rpm条件下搅拌发酵96小时后获得rbj菌株发酵液，备用。
[0032]
供试药剂：rbj菌剂，按本发明上述方法制备；对照化学农药为25%的乙嘧酚磺酸酯，山东青岛奥迪斯生物科技有限公司生产。
[0033]
玫瑰品种：粉玫试验地点：昆明市晋宁区宝峰街道玫瑰种植基地温室大棚内试验方法：田间试验共设3个处理。rbj菌剂处理：rbj发酵液用清水稀释30倍后均匀喷雾到玫瑰植株上；化学农药处理：25%的乙嘧酚磺酸酯用清水稀释600倍后均匀喷雾到玫瑰植株上；空白对照处理：r2a液体培养基用清水稀释30倍后均匀喷雾到玫瑰植株上。每处理3次重复，各处理间设保护行，小区面积为31.5m2，每小区栽种玫瑰306株，小区随机排列。试验于白粉病初发期，即：有零星的叶片发病，按各药剂的稀释倍数用清水稀释后均匀喷雾于玫瑰整个植株。试验期间各处理田间管理、水肥管理、环境调控等处理措施保持一致，按常规方法进行。
[0034]
防效计算：第一次用药10天后进行第二次药剂处理，第二次药剂处理10天后，采用3点取样法取玫瑰叶片进行病级分级，统计病叶率并计算病情指数和防效。白粉病调查分级标准参照本发明的实施例2。
[0035]
试验结果：从表1能够看出，在大田条件下rbj菌剂对玫瑰白粉病的防效为70.3%，25%的乙嘧酚磺酸酯的防效为71.6%；二者差异不显著。实际应用表明：利用rbj菌株制备的菌剂，能高效防治玫瑰白粉病。
[0036]
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一株嗜线虫诺卡氏菌（nocardioides nematodiphilus）rbj，其特征在于：保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省科学院微生研究所，510070，保藏日期2022年11月28日，保藏编号gdmcc no:63014。2.如权利要求1所述的嗜线虫诺卡氏菌rbj，其特征在于：嗜线虫诺卡氏菌rbj菌株的培养方法包括：将菌株接种到r2a培养基斜面上，于30℃条件下培养7天后获得斜面种子；将斜面种子接种到三角瓶中的r2a液体培养基中，于30℃、180 rpm条件下振荡培养5天后获得液体种子；将液体种子按5％的体积比例接入发酵罐中的r2a液体培养基中，在30℃，150 rpm条件下搅拌发酵96 h后获得嗜线虫诺卡氏菌rbj菌株发酵液。3.如权利要求1所述的嗜线虫诺卡氏菌rbj在玫瑰白粉病防治中的应用。4.如权利要求3所述的嗜线虫诺卡氏菌rbj在玫瑰白粉病防治中的应用，其特征在于：嗜线虫诺卡氏菌rbj菌株发酵液用清水稀释30倍后喷雾玫瑰植株地上部分。

技术总结
本发明公开了一株嗜线虫诺卡氏菌及其在玫瑰白粉病防治中的应用，涉及微生物技术领域，所述嗜线虫诺卡氏菌RBJ保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省科学院微生研究所，510070，保藏日期2022年11月28日，保藏编号GDMCC NO:63014。本发明提供的嗜线虫诺卡氏菌RBJ可以用于制备防治玫瑰白粉病的微生物菌剂，制备的微生物菌剂能高效防治玫瑰白粉病，防效可达70.3%，且具有防效稳定、无毒、无害、易工业化生产、使用成本低等特点。使用成本低等特点。


技术研发人员：董琼娥 莫明和 田云霞 张振荣 钱玲 苏虹 梁志妹 童江云
受保护的技术使用者：昆明市农业科学研究院
技术研发日：2023.03.06
技术公布日：2023/7/21