一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因CRK41的应用

一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术，具体涉及一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用。


背景技术：

2.植物生长过程中不可避免地遭受来自外界环境的各种胁迫，包括生物和非生物胁迫。其中，土壤盐碱化是是限制作物生产、威胁粮食安全的主要非生物胁迫之一，会抑制植物的生长和发育，但多种植物具有复杂的机制来响应盐胁迫，使其能够在高盐的环境中生长。这些机制中，微管骨架的动态变化至关重要。植物细胞微管骨架除参与细胞分裂、细胞运动和细胞形态外，在响应胁迫信号转导过程中也发挥重要作用，可将信号从质膜通过细胞质传递至细胞核。快速的微管解聚和聚合构成的微管骨架动态，可将胁迫信号放大，激活细胞内复杂的调控网络，通过多种细胞活动，响应胁迫反应。
3.微管是高度动态的聚合物，可以解聚和聚合，参与各种细胞过程。微管的聚合-解聚动力学受到一系列发育过程以及环境刺激和应力条件的影响。微管已被确定为在信号放大中起作用，以及在处理与盐胁迫密切相关的应激信号中是不可分割的组成部分。在拟南芥中，微管的稳定性和动态影响耐盐性。
4.有证据表明，crk41是通过质膜蛋白将盐胁迫信号转导到细胞中，参与调节盐胁迫。通过检索，并未发现盐胁迫下微管解聚与crk41基因的作用相关报道。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术的情况，本发明的目的在于提供拟南芥crk41基因在植物盐胁迫下对微管解聚影响的应用，本发明构建crk41基因的过表达载体，进而获得了过表达纯合株系，购买并筛选鉴定获得crk41的纯合突变体。之后通过与野生型的gfp-tubulin(微管蛋白)进行杂交获得荧光标记的微管纯合株系，观察crk41负责的由盐胁迫触发的微管解聚。
6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.本发明提供了影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用。
8.本发明所提供的拟南芥盐胁迫响应调控基因crk41来源于拟南芥(arabidopsis thaliana)，其核苷酸序列如seq no.1所示。
9.进一步的，可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
10.进一步的，使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上增强型启动子，花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子。
11.进一步的，微管可视化采用稳定表达gfp-tubulin的野生型，crk41,35s:crk41-1,35s:crk41-2进行测定。
12.进一步的，盐胁迫下crk41影响mpk3和mpk6的表达。
13.进一步的，微管可视化表明mpk3和mkp6是crk41调控盐胁迫诱导的微管解聚的重要组分。
14.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
15.本发明通过基因工程技术将crk41基因进行过表达，然后获得过表达载体，将该载体转化进野生型株系中，经过筛选得到crk41基因过表达纯合株系。本发明通过实验首次证明crk41负责由盐胁迫触发的微管解聚，mpk3/6信号通路在其中发挥重要作用，负责维持微管稳定性的信号通路的协调，这是赋予植物抗盐胁迫的关键因素，可以认为crk41基因对提高植物盐胁迫性具有潜在的应用价值。
附图说明
16.图1盐胁迫下crk41影响微管的解聚。其中：a.微管解聚情况。b.(a)图条件下铺板细胞的微管数量统计(n》18)。
17.图2盐胁迫下crk41影响mpk3和mpk6的表达。其中：a.mpk3的表达情况。b.mpk6的表达情况。
18.图3盐胁迫下突变株crk41mpk3和crk41mpk6影响微管的解聚。其中：a.微管解聚情况。b.(a)图条件下铺板细胞的微管数量统计(n》18)。
具体实施方式
19.下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
20.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
21.实施例1：拟南芥crk41基因转基因株系在盐胁迫下对微管的影响
22.一.拟南芥crk41基因突变体的获得
23.在拟南芥数据库中获得crk41基因的cds序列，其长度为1998bp，编码含有665个氨基酸的蛋白质，该基因的核苷酸序列如seq no.1所示。拟南芥crk41基因t-dna插入突变体从拟南芥资源中心获得，再对其进行纯合体筛选和鉴定。
24.二.拟南芥crk41基因转基因株系35s:crk41的获得
25.1.拟南芥crk41基因过量表达株系的获得
26.(1)构建组成型表达启动子35s驱动的crk41的过量表达载体(35s:crk41)：根据拟南芥crk41基因的cds序列，设计基因特异引物，其序列如下(5'-3')：
27.crk41-f:atgactagttcttgttctttgtc；
28.crk41-r:acgagcatcgaactcggtaatt；
29.通过pcr技术扩增crk41基因，并将其扩增产物进行回收、纯化后克隆到cloning vector克隆载体上，获得blunt-t-crk41重组质粒；
30.(2)将blunt-t-crk41重组质粒经过质粒pcr测序确认后，使用限制性内切酶xbai与kpni对blunt-t-crk41重组质粒和psuper 1300-myc质粒进行双酶切，将crk41基因连接到psuper 1300-myc中35s启动子后面获得过量表达载体psuper 1300-crk41；
31.(3)将过量表达载体psuper 1300-crk41转化至农杆菌gv3101感受态中，再通过花序侵染法转化拟南芥中，获得crk41基因过量表达株系35s:crk41。
32.2.crk41转基因纯合株系的筛选
33.(1)将单株受到侵染后的crk41基因过量表达株系的种子做为t0代；
34.(2)将t0代种子在含有卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的培养基上培养，挑选根和子叶均正常生长的植株种在1/2ms培养基中，单株收到的种子为t1代；
35.(3)将t1代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选后代绿苗：黄苗分离比为3：1的株系中的绿苗种在1/2ms培养基中，单株收到的种子为t2代；
36.(4)将t2代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选后代均是绿苗的株系种在1/2ms培养基中，收到的种子即为crk41基因过量表达的纯合转基因株系的种子，分别命名为35s:crk41-1、35s:crk41-2。
37.三.拟南芥幼苗细胞的微管解聚观察与数据分析
38.1.使用稳定表达gfp-tubulin的野生型,crk41,35s:crk41-1,35s:crk41-2突变体进行该测定。
39.2.取材：选取光下生长7d的上述拟南芥幼苗。
40.3.处理：加入nacl进行处理，未处理作对照，室温孵育。
41.4.检测：将处理的拟南芥材料置于激光共聚焦显微镜下观察(40x)，每隔一定时间扫描一次，获得图像，结果如图1a所示。激发光为488nm；发射光为505-530nm。
42.5.分析：图像用imagej软件进行分析，统计细胞的微管数量。在细胞内画一条50μm长的直线，使之尽可能多地与细胞内的微管交叉，统计交叉点数即为微管数量，结果如图1b所示。
43.在nacl处理之前，微管组织和密度方面没有观察到显著差异。经nacl处理后，col-0、crk41突变株的微管发生解聚；35s:crk41过表达株系显示出较弱的解聚作用。此外，与野生型相比，crk41突变体表现出更为快速的皮质微管解聚。结果表明，crk41是控制微管在盐胁迫下解聚的关键因素。
44.实施例2：盐胁迫下mpk3、mpk6受到crk41的诱导表达
45.1.处理：选取生长7d的拟南芥野生型，crk41,35s:crk41-1和35s:crk41-2幼苗，分别用水和150mm nacl进行处理12h。
46.2.提取rna：取0.1g上述处理的植物幼苗材料放入研钵中,倒入充足的液氮进行研磨至粉末状,加入1mltrizol试剂,剧烈振荡30s混匀,室温静置5min,12000rpm离心10min；取上清,加入200μl氯仿,充分振荡30s,冰上静置3min后,4℃,12000rpm离心10min；吸取上清(最上层)转移至新离心管,加入等体积预冷的异丙醇,-20℃冰箱静置30min左右；12000rpm,4℃,离心15min,弃上清；白色沉淀加入75％乙醇进行清洗,12000rpm,4℃,离心5min,弃上清；重复一次,4℃重新离心30s,用枪头吸掉剩余残液；放在冰盒上,放入超净台干燥10min,加入50μl depc水溶解,nanodrop测定rna浓度。
47.3.反转录合成cdna(20μl反应体系)：
[0048]5×
primescript buffer 4μl
[0049]
oligo dt primer(50μm)1μl
[0050]
random 6mers(100μm)1μl
[0051]
total rna 1μg
[0052]
rt enzyme mix i 1μl
[0053]
上述反应加入rnase free ddh2o至20μl,37℃水浴15min,85℃酶失活5s,-20℃保
存。
[0054]
4.实时荧光定量聚合酶链式反应(real-timepcr)分析mpk3和mpk6的表达
[0055]
cdna1μl
[0056]
forwardprimer(10μm)0.4μl
[0057]
reverseprimer(10μm)0.4μl
[0058]
sybrpremixextaq10μl
[0059]
ddh2o7.8μl
[0060]
总共20μl体系按下列程序进行扩增：
[0061][0062]
5.检测mpk3和mpk6表达的引物，其序列如下(5'-3')：
[0063]
mpk3-f:gatttgtgatttcggtcttgc；
[0064]
mpk3-r:tttaccagggaacaaaggct；
[0065]
mpk6-f:cattatccgaagaacattgcc；
[0066]
mpk6-r:tacttggtttcaaatccctgtg。
[0067]
盐胁迫下，mpk3和mpk6的基因水平在野生型和crk41突变体中均发生明显上调，且在crk41突变体上调更明显，但在crk41过表达株系35s:crk41-1和35s:crk41-2中未发生明显变化。说明，crk41调控盐胁迫下mpk3和mpk6的表达。
[0068]
实施例3：mpk3、mpk6调节crk41在盐胁迫下微管的解聚
[0069]
拟南芥幼苗细胞的微管解聚观察与数据分析
[0070]
1.使用稳定表达gfp-tubulin的野生型,crk41,crk41mpk3,crk41mpk6突变体进行该测定。
[0071]
2.取材：选取光下生长7d的上述拟南芥幼苗。
[0072]
3.处理：加入nacl进行处理，未处理作对照，室温孵育。
[0073]
4.检测：将处理的拟南芥材料置于激光共聚焦显微镜下观察(40x)，每隔一定时间扫描一次，获得图像，结果如图3a所示。激发光为488nm；发射光为505-530nm。
[0074]
5.分析：图像用imagej软件进行分析，统计细胞的微管数量。在细胞内画一条50μm长的直线，使之尽可能多地与细胞内的微管交叉，统计交叉点数即为微管数量，结果如图3b所示。
[0075]
在nacl处理下，野生型、crk41mpk3和crk41mpk6突变体发生微管解聚，微管密度降低。crk41mpk3显示出与野生型相似的微管解聚水平；然而，crk41mpk6突变体显示出减弱的解聚。结果表明，mpk3和mpk6促进crk41突变体的微管解聚，并且mpk3和mpk6的缺失抑制crk41突变体微管的解聚。这些数据表明，在crk41突变体中，mpk3和mpk6通过解聚微管来调节对盐胁迫的反应。

技术特征：
1.一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用，其特征在于：本发明所提供的拟南芥盐胁迫响应调控基因crk41来源于拟南芥(arabidopsisthaliana)，其核苷酸序列如seqno.1所示。2.根据权利要求1所述的一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用，其特征在于：可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。3.根据权利要求2所述的一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用，其特征在于：使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上增强型启动子，花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子。4.根据权利要求1-3所述的一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用，其特征在于：微管可视化采用稳定表达gfp-tubulin的野生型，crk41,35s:crk41-1,35s:crk41-2进行测定。5.根据权利要求1-4所述的一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用，其特征在于：crk41调控mpk3和mpk6的基因表达。6.根据权利要求1-5所述的一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因crk41的应用，其特征在于：微管可视化表明mpk3和mkp6是crk41调控盐胁迫诱导的微管解聚的重要组分。

技术总结
本发明提供了一种影响盐胁迫下微管解聚的新基因CRK41的应用。所述CRK41基因调控MPK3和MPK6的基因表达，本发明通过基因工程技术获得了拟南芥CRK41基因的过表达载体，并由此获得了拟南芥的过量表达纯合株系，并通过筛选和鉴定获得了crk41的突变体纯化株系；所述拟南芥CRK41基因负责由盐胁迫触发的微管解聚，MPK3/6信号通路在其中发挥重要作用，负责维持微管稳定性的信号通路的协调，这是赋予植物抗盐胁迫的关键因素，可以认为CRK41基因对提高植物盐胁迫性具有潜在的应用价值。植物盐胁迫性具有潜在的应用价值。植物盐胁迫性具有潜在的应用价值。


技术研发人员：周飒 罗秋玲 杨彩妮 吴恒宇 王璐 叶冬林 吉南希
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2023.01.17
技术公布日：2023/7/21