一种版纳绳蚋抗栓肽Sibanin及其应用

一种版纳绳蚋抗栓肽sibanin及其应用
技术领域
1.本发明属于生物应用技术领域，具体涉及一种版纳绳蚋抗栓肽sibanin及其应用。


背景技术：

2.吸血节肢动物叮咬牛、羊、马、人等宿主时，造成其血管破损，宿主将立即启动生理性止血反应阻止出血。生理性止血主要包括三个过程（1）血管收缩：血管产生神经源性收缩和肌源性收缩。（2）血小板止血栓的形成：血小板粘附、聚集于暴露的内皮下胶原上，最终形成血小板止血栓堵塞伤口，达到初步的止血，也称一期止血。（3）血液凝固：凝血因子按一定顺序相继激活，最终使得可溶的纤维蛋白原转变为不溶的纤维蛋白，并交织成网，以加固止血栓，称二期止血。最后，局部纤维组织增生，并长入血凝块，达到永久性止血。因此，吸血节肢动物要想顺利地从宿主身上吸血，其唾液腺中必须含有一些活性分子能够抑制宿主生理性止血的这三个过程。吸血节肢动物唾液腺中活性成分的功能研究具有积极的潜在应用价值，如从水蛭唾液腺中发现的抗凝蛋白——水蛭素（hirudin）及其衍生物bivalirudin等已在临床上用于预防外科手术后的深静脉血栓，减轻脑出血后的脑水肿症状等。
3.血小板在血栓形成过程中起到至关重要的作用，抗血小板聚集药物目前在临床上用于预防和治疗血栓性疾病，然而具有刺激胃肠道以及出血风险增加等副作用，因此亟待开发新型的副作用小的抗血栓药物。研究吸血节肢动物唾液蛋白的结构和功能，可以挖掘、开发一些具有潜在药用价值的先导活性分子。蚋虫（双翅目：蚋科），俗称黑蝇（black fly），是一种骚扰人和家畜的吸血节肢动物，通过吸食宿主的血液获取营养进行产卵和繁殖。版纳绳蚋是我国西双版纳地区的一种吸血昆虫，其唾液腺中抗血栓成分的鉴定和功能研究尚未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种版纳绳蚋（simulium bannaense）抗栓肽sibanin；第二目的在于提供所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin的应用。
5.本发明的第一目的是这样实现的，所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明的第二目的是这样实现的，所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin在制备抑制血小板聚集产品中的应用。
7.本发明的版纳绳蚋抗栓肽sibanin是中国吸血昆虫版纳绳蚋唾液腺抗栓肽基因编码的一种第六位半胱氨酸和第五十六位半胱氨酸、第十五位半胱氨酸和第三十九位半胱氨酸、第三十一位半胱氨酸和第五十二位半胱氨酸组成三对分子内二硫键的环状多肽，由91个氨基酸残基构成，其氨基酸序列为seq id no:1所示。
8.该版纳绳蚋抗栓肽前体的编码基因genbank accession mk689374由461个核苷酸组成，其核苷酸序列为seq id no:2所示，其自5’端至3’端序列为：atgaagataatcgcaatcagtgtaatgttcctgctttgccttggtcatgttatcgcaacaaatgaggacttttgcaaccaacccatggaagtaggt
atttgcagagccctattgaagcgttactattatgactcagctgtgaagcgatgcaaggtgttttactatggaggctgcgaaggaaacgggaataatttcctaacgagaaaggagtgccggttgaagtgtatgccggacgcaactccagataaaccaagaaaaccaaaagacaagaggaaaaacaagaaaaacaaaaaacaaacaacaccacttccaccagtaatatcgttggactgaaattaaattcagtgcatcattcagcaagggttgactgtagtttttttttgagaattattacttgtcgtgtgcaacaactaagtaaaaaaaatagttttttcaaaaacaaaaaaaaaaaaataaaaaaa，其中，第58
–
330位核苷酸为版纳绳蚋抗栓肽sibanin的编码基因。
9.本发明的有益效果在于：提供一种新的抗栓肽sibanin，本发明的抗栓肽能够抑制血小板聚集，并且在体内具有显著的抑制血栓形成功能；另外该抗栓肽经原核表达获得，容易大规模工业化生产。
附图说明
10.图1为抗栓肽sibanin原核表达与纯化后的sds-page电泳图；其中，a为原核表达sibanin的sds-page电泳图：m表示marker，泳道1是pet-30a诱导（空载）的蛋白条带，泳道2是未加iptg诱导的大肠杆菌裂解产物的蛋白条带，泳道3是加入0.8m m iptg诱导后，大肠杆菌可溶性裂解产物的蛋白条带，泳道4是iptg诱导后的大肠杆菌上清的蛋白条带，泳道5是iptg诱导后的大肠杆菌破碎后沉淀物的蛋白条带；b为纯化后sibanin的sds-page电泳图：m表示marker，泳道1是0.5mg/ml bsa，泳道2是纯化后的sibanin；图2为抗栓肽sibanin对血小板聚集的抑制作用示意图；其中，a-不同浓度的sibanin（100nm，500nm，1000nm）对adp诱导的血小板聚集的抑制作用；b-不同浓度的sibanin（500nm，1000nm，2000nm）对collagen诱导的血小板聚集的抑制作用；图3为抗栓肽sibanin对鼠尾静脉血栓形成的抑制作用示意图；其中，a-不同浓度的抗栓肽sibanin（5mg/kg，10mg/kg）作用24小时后，鼠尾血栓长度变化；b-抗栓肽sibanin作用24小时后，鼠尾血栓长度统计（n=5）。
具体实施方式
11.下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
12.本发明所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin的氨基酸序列如seq id no.1所示。
13.本发明所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin的应用为所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin在制备抑制血小板聚集产品中的应用。
14.所述的产品为药品、食品或保健食品。
15.所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
16.下面以具体的实施案例对本发明进行进一步说明：实施例1
17.版纳绳蚋抗栓肽sibanin的发现通过检索，从美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站的核酸数据库中发现一条基因序列
genbank accession mk689374，其核苷酸序列为seq id no:2所示，长度为416bp，其编码的蛋白前体如seq id no:3所示。
18.将该基因序列用ncbi网站的blastx软件（http://blast.st-va.ncbi. nlm.nih.gov/blast.cgi?program=blastx&page_type=blastsearch&link_loc=blasthome）进行序列比对分析结果表明，该基因的编码产物可能为kunitz家族蛋白酶抑制剂前体。进一步将该基因编码的蛋白前体序列用信号肽预测软件signalp（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?signalp）进行分析，并结合已报道的其它动物来源kunitz家族蛋白酶抑制剂序列进行比较分析，确定该蛋白酶抑制剂前体成熟过程中酶切位点为-ala19-thr20-之间，即该基因（seq id no：2）的第58
–
330位核苷酸为该蛋白酶抑制剂成熟肽的编码基因。从而获得该蛋白酶抑制剂的成熟肽序列含有91个氨基酸残基tnedfcnqpmevgicrallkryyydsavkrckvfyyggcegngnnfltrkecrlkcmpdatpdkprkpkdkrknkknkkqttplppvisld（氨基酸单字母简写序列）；其中，第六位半胱氨酸和第五十六位半胱氨酸、第十五位半胱氨酸和第三十九位半胱氨酸、第三十一位半胱氨酸和第五十二位半胱氨酸组成三对分子内二硫键，我们将其命名为sibanin。
19.实施例2
20.原核表达版纳绳蚋抗栓肽sibanin（一）重组质粒pet-30a-sibanin的构建1）pet-30a质粒dna的制备接种pet-30a质粒的大肠杆菌载体菌株（novagen，美国）于5ml含氨苄的lb培养基中，37℃摇床中培养过夜，使用质粒提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，中国）提取质粒。
21.2）双酶切pet-30a质粒dna在37℃，nde i和xho i（takara，日本）双酶切pet-30a+质粒，双酶切体系为20μl。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切取目的条带，利用凝胶dna回收试剂盒（北京百泰克生物科技有限公司，中国）回收双酶切产物，置-20℃保存备用。
22.3）sibanin目的基因的制备由上海生工生物工程技术服务有限公司基因合成sibanin的核苷酸序列，即sibanin蛋白前体的基因序列（seq id no：2）的第58
–
330位核苷酸，且于5’端加6
×
his融合表达标签序列。
23.4）酶切产物的连接将回收的双酶切产物线性pet-30a+质粒和目的基因在t4 dna连接酶（takara，日本）作用下进行反应，16℃连接过夜。
24.（二）重组质粒的转化将连接产物转化至用cacl
2-mgcl2法制备的大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，取适量转化产物涂布至含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基平板上，经37℃培养16小时，用pcr检测，将阳性克隆送生物公司进行测序并确认含有sibanin成熟肽基因序列。
25.（三）sibanin重组蛋白诱导表达挑取重组阳性克隆接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的液体lb培养基，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100接种至1l新鲜的lb培养基中，37℃振荡培养约3小时，使
od
600
达到0.6，加入iptg至终浓度为0.4mmol/l，28℃继续培养诱导3小时。
26.（四）重组表达产物sibanin的分离纯化1）his-tag融合蛋白收集诱导产物于10000rpm，离心10分钟收获菌体。将菌体用100ml ph 8.0，0.1mol/l pbs重悬后，超声裂解10分钟，8000rpm离心10分钟，弃上清，将收集到的诱导沉淀物重悬于上述缓冲液中，然后超声、离心，条件同前。超声裂解沉淀用含有6mol/l尿素的缓冲液重悬，冰浴60分钟，4℃，16000rpm离心30分钟，经0.45μm滤膜过滤，上样于已经用变性缓冲液平衡好的his bind resin（merck，德国）亲和层析柱，收集his-tag融合蛋白。
27.2）包涵体的复性用梯度稀释的方法对包涵体进行复性，透析缓冲液依次为含6mol/l尿素的20mmol/l的tris-hcl，ph 6.0；含4mol/l尿素的20mmol/l的tris-hcl，ph 6.5；含3mol/l尿素的20mmol/l的tris-hcl，ph 6.8；含2mol/l尿素的20mmol/l的tris-hcl，ph 7.2；含1mol/l尿素的20mmol/l的tris-hcl，ph 7.4；不含尿素的20mmol/l的tris-hcl，ph7.4，每次透析换2次缓冲液，每次换液时间间隔5小时。
28.3）sibanin的分离纯化将复性的重组蛋白通过rtev蛋白酶切割his标签。切割产物在0.1m，ph 6.0的pbs缓冲液透析12小时后，上样于快速液相色谱ge
ꢀä
kta纯化系统的superdex 75 10/300 gl柱（10
×
300mm,24ml volume,ge,美国），用0.1m，ph 6.0的pbs缓冲液进行洗脱，收集的组分用sds-page凝胶电泳鉴定样品的质量，结果如图1所示。
29.实施例3
30.抗栓肽sibanin的药理实验取获得的版纳绳蚋重组蛋白sibanin进行如下药理活性检测。
31.（一）抗栓肽sibanin对adp或collagen诱导的血小板聚集的抑制作用健康人血小板用血浆稀释至2.5
×
108个/ml。取富血浆血小板300μl，与终浓度为3.75 μm sibanin于37℃保温5分钟后，加入2μm的adp或1μg/μl的collagen（sigma，美国）诱导聚集，在血小板聚集仪上检测5分钟内的聚集曲线变化。空白组为未加sibanin孵育的血小板。实验结果表明：100nm、500nm和1000nm的sibanin对adp诱导的血小板聚集的抑制率分别为24.15%，56.14%和80.45%；500nm、1000nm和2000nm的sibanin对collagen诱导的血小板聚集的抑制率分别为15.29%，49.43%和92.84%。版纳绳蚋抗栓肽sibanin能作为制备抑制血小板聚集药物的应用。
32.（二）抗栓肽sibanin对鼠尾静脉血栓形成的抑制作用角叉菜胶（carrageenan，type i，sigma，美国）致鼠尾血栓模型来检测抗栓肽sibanin的作用。取24只balb/c雄性小鼠（体重17-22g）随机分成4组（n＝6），第1组为生理盐水阴性对照组，第2组为0.2mg/kg apixaban（bristol myers squibb&pfizer，美国）阳性对照组，第3、4组分别给予5、10mg/kg的sibanin样品处理30分钟后，小鼠腹腔注射生理盐水溶解的浓度为1％的角叉菜胶。6小时后，尾静脉再次注射同剂量的样品。48小时后，根据尾部皮肤颜色变化来判定血栓形成的出现率和平均长度。sibanin的体内药理实验表明：浓度为10mg/kg的sibanin处理48小时后能完全清除角叉菜胶诱导的鼠尾静脉血栓。版纳绳蚋抗栓肽sibanin能作为制备治疗血栓性疾病药物的应用。
33.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种版纳绳蚋抗栓肽sibanin，其特征在于，所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种权利要求1所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin的应用，其特征在于，所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin在制备抑制血小板聚集产品中的应用。3.根据权利要求2所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin的应用，其特征在于，所述的产品为药品、食品或保健食品。4.根据权利要求2所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin的应用，其特征在于，所述的版纳绳蚋抗栓肽sibanin在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种版纳绳蚋抗栓肽Sibanin和应用，属于生物医学领域。该抗栓肽Sibanin是吸血昆虫版纳绳蚋抗栓肽基因编码的一种第六位半胱氨酸和第五十六位半胱氨酸、第十五位半胱氨酸和第三十九位半胱氨酸、第三十一位半胱氨酸和第五十二位半胱氨酸组成三对分子内二硫键的环状蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。本发明的抗栓肽能够抑制由ADP或胶原诱导的血小板聚集，并且在体内具有显著的抑制血栓形成功能；另外该抗栓肽经原核表达获得，容易大规模工业化生产，能作为制备抑制血小板聚集、治疗血栓性疾病药物的应用。治疗血栓性疾病药物的应用。治疗血栓性疾病药物的应用。


技术研发人员：武静 杨海龙 何艳梅 卫林 木丽仙 沈艳
受保护的技术使用者：昆明医科大学
技术研发日：2022.12.28
技术公布日：2023/7/21