一种微量蛋白检测方法

1.本发明属于蛋白检测领域，尤其涉及一种微量蛋白检测方法。


背景技术：

2.目前总蛋白的常用检测方法包括：凯氏定氮法，双缩脲法，酚试剂法，紫外分光光度法，染料结合法，比浊法，bca定量法。其中bca定量法灵敏度高，稳定性好，检测蛋白质浓度范围在20-200 μg/ml，微量bca定量方法在0.5-10 μg/ml。临床上用邻苯三酚红钼法检测尿液中的总蛋白含量，现有检测方法的灵敏度低，只能检测微克级别的蛋白。


技术实现要素：

3.本发明实施例的目的在于提供一种微量蛋白检测方法，旨在解决检测方法的灵敏度低，只能检测微克级别的蛋白的问题。
4.本发明实施例是这样实现的，一种微量蛋白检测方法，所述微量蛋白检测方法包括如下步骤：步骤一、配制蛋白质溶液，并通过聚苯乙烯孔板进行吸附，随后进行洗涤；步骤二、采用溶剂热法合成二氧化钛纳米粒子，并向孔板中加入二氧化钛，使其与孔板蛋白相结合，并在结合后进行洗涤；步骤三、向孔板中加入显色液，并通过紫外光进行照射，将刃天青（c
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h6nnao4）转化为试卤灵（c
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h7no2）；步骤四、通过酶标仪对蛋白质溶液中的荧光数值进行读取并记录。
5.作为本发明更进一步的方案，步骤一中所述的配制蛋白质溶液，并通过聚苯乙烯孔板进行吸附，具体包括如下步骤：s1、用天平称取10 mg人血清蛋白，并用1ml磷酸盐缓冲液配置浓度为10 mg/ml的标准品；s2、用磷酸盐缓冲液将人血清蛋白稀释至浓度分别为1、2、3、4、5 ng/ml 的溶液；s3、将四个浓度的标准品加入到酶标板中，每孔加入200 μl样品，每个浓度设置三个平行孔并在37 ℃的环境下孵育5 min，再用浓度为10 mm，ph 7.4的磷酸缓冲液洗涤，每孔加入360 μl，每次1 min，用力甩干，一共洗涤三次。
6.作为本发明更进一步的方案，步骤二中所述的采用溶剂热法合成二氧化钛纳米粒子，具体包括如下步骤：s1、在室温环境下向不断搅拌的10 ml甲醇溶液中加入5 ml钛酸四丁酯，再滴加0.8 ml氢氟酸，继续搅拌0.5 h后将混合溶液转到40 ml聚四氟乙烯高压反应釜中；s2、在恒温干燥箱中180 ℃反应24 h，随后在室温下冷却，将所得到的产物进行离心，并用乙醇溶液洗涤5次，水洗涤2次；s3、将得到的固体白色沉淀，取100 mg分散在20 ml的浓度为0.1 m的氢氧化钠溶液中过夜搅拌；
s4、将溶液通过5000 rpm转速离心5 min去除上清液，随后将沉淀分散在20 ml超纯水中，用2 ml离心管分装为10管，通过13000 rpm转速离心15 min去除上清液，取其中一管60 ℃烘干称重，其他样品放置在4 ℃备用。
7.作为本发明更进一步的方案，步骤二中所述的向孔板中加入二氧化钛，具体包括如下步骤：s1、用浓度为40 mm，ph 5.0的磷酸-吐温缓冲液分散二氧化钛纳米粒子，使其胶体浓度为20 μg/ml，其中吐温的终浓度为1/10000（v/v）；s2、向酶标板的每孔加入s1中配制的溶液，在37 ℃环境下孵育5 min；s3、对孔板进行洗涤，每孔加入360 μl浓度为40 mm，ph 5.0的磷酸-吐温缓冲液，每次1 min，用力甩干，一共洗涤三次。
8.作为本发明更进一步的方案，步骤三中所述的向孔板中加入显色液，并通过紫外光进行照射，具体包括如下步骤：s1、称取1.28 g的tris溶于1 l超纯水中，其浓度为10 mm，用2 m的氯化氢调节ph为6.8，加入1 ml浓度为5 mm的刃天青水溶液；s2、在聚苯乙烯孔板中每孔加入显色液220 μl，在uv-254 nm紫外光下光照5 min。
9.作为本发明更进一步的方案，步骤四中所述的通过酶标仪对蛋白质溶液中的荧光数值进行读取并记录，具体包括如下步骤：s1、用移液器将反应产物取出200 μl，转移至黑色酶标板中，采用酶标仪的荧光模块读数；s2、检测每个孔的荧光强度f，建立f与白蛋白标准品质量浓度c之间的标准曲线；s3、将尿液实际样品用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，按照上述步骤与标准样品相同操作检测荧光强度f,带入标准曲线计算实际样本中的蛋白含量。
10.本发明实施例提供的一种微量蛋白检测方法，具有以下有益效果：本研究提出了一种新的微量蛋白检测方法，通过催化反应实现信号放大，具有操作便捷，速度快，成本低特点，并以尿蛋白检测为例，验证来了方法的可行性，灵敏度，稳定性，具有很高的实际应用价值，为临床尿蛋白检测提供了一种新的解决方案。
附图说明
11.图1为本发明实施例提供的二氧化钛纳米粒子透射电镜图；图2为本发明实施例提供的人血清白蛋白检测标准曲线图。
具体实施方式
12.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
13.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
14.在本发明实施例中，一种微量蛋白检测方法，其特征在于，所述微量蛋白检测方法包括如下步骤：步骤一、配制蛋白质溶液，并通过聚苯乙烯孔板进行吸附，随后进行洗涤；
步骤二、采用溶剂热法合成二氧化钛纳米粒子，并向蛋白质溶液中加入二氧化钛，使其与孔板蛋白相结合，并在结合后进行洗涤；步骤三、向孔板中加入显色液，并通过紫外光进行照射，将刃天青（c
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h6nnao4）转化为试卤灵（c
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h7no2）；步骤四、通过酶标仪对蛋白质溶液中的荧光数值进行读取并记录。
15.实施例一：以钛酸四丁酯和氢氟酸为原料在甲醇中通过溶剂热法合成了20 nm左右的二氧化钛纳米粒子：（附图1）合成方法：在室温条件下搅拌过程中将5 ml钛酸四丁酯滴加到10 ml甲醇中，再滴加0.8 ml氢氟酸，继续搅拌0.5 h后将上述混合溶液转到40 ml聚四氟乙烯高压反应釜。在恒温干燥箱中180 ℃反应24 h。
16.洗涤方法：室温冷却后，将所得到的产物离心并用乙醇洗涤5次，水洗涤两次。将得到的固体白色沉淀，取100 mg分散在20 ml的0.1 m氢氧化钠溶液中过夜搅拌。5000 rpm, 5 min离心去除上清液，将沉淀分散在20 ml超纯水中，用2 ml的离心管分装为10管，13000 rpm, 15 min离心去除上清液，取其中一管60 ℃烘干称重，其他样品放置在4 ℃备用。
17.实施例二：配制不同浓度的标准品溶液，与聚苯乙烯孔板孵育：具体方法：用分析天平称取10 mg人血清白蛋白（hsa）用1 ml磷酸盐缓冲液（pbs）配制浓度为10 mg/ml的标准品，然后再用pbs将hsa稀释至的浓度为1、2、3、4、5 ng/ml,将五个浓度的标准品加入到酶标板中，每孔加入200 μl样品，每个浓度设置三个平行孔。在恒温烘箱中，37 ℃孵育5 min。然后将孔板中的液体用力甩出，并在吸水纸上拍干。用多通道移液器一次性加入配制好的磷酸缓冲液pb（10 mm，ph 7.4），每孔加入360 μl，静置1 min，用力甩干，一共洗涤三次。
18.实施例三：二氧化钛纳米粒子与孔板蛋白结合：具体方法：二氧化钛结合液的配制pbt：1 l磷酸缓冲液pb（40 mm，ph 5.0）其中加入100 μl吐温-20。取100 ml pbt加入二氧化钛2 mg，将上述溶液超声10 min,作为工作液。在酶标板的每个孔中加入200 μl的工作液，在37 ℃条件下孵育5 min。然后将孔板中的液体用力甩出，并在吸水纸上拍干，用pbt洗涤，每孔加入360 μl，静置1 min，用力甩干，一共洗涤三次。
19.实施例四：在孔板中加入显色液，在紫外光照射条件下实现光催化具体方法：显色液配制：称取1.28 g的tris溶于1 l超纯水中，其浓度为10 mm，用2 m的hcl调节ph为6.8，刃天青（rz）终浓度为5 μm。在聚苯乙烯孔板中每孔加入显色液220 μl，在uv-254 nm紫外光（两根8 w灯管）下光照5 min，然后在涡旋震荡器上混匀。
20.实施例五：酶标仪读数：具体方法：用移液器将上述反应产物取出200 μl，转移至黑色酶标板中，采用酶标仪的荧光模块读数，使用ex:590 nm(20 nm),em:620 nm(20 nm)模块检测每个孔的荧光强度f，建立f与白蛋白标准品质量浓度c之间的标准曲线。（附图2）实施例六：实际样本检测：具体方法：将尿液实际样品用pbs稀释10000倍，按照上述步骤与标准样品相同操作检测荧光强度f,带入标准曲线计算蛋白含量，然后乘以10000倍，即为尿液样本中的实际蛋白含量。
21.本研究提出了一种新的微量蛋白检测方法，通过催化反应实现信号放大，具有操作便捷，速度快，成本低特点，并以尿蛋白检测为例，验证来了方法的可行性，灵敏度，稳定性，具有很高的实际应用价值，为临床尿蛋白检测提供了一种新的解决方案。
22.二氧化钛具有优异的化学稳定性和氧化还原性能，是一种低毒、低成本的光催化剂，广泛应用于太阳能电池和废水中有毒有机物的净化。当二氧化钛纳米颗粒的表面暴露在紫外光下时（λ《384 nm），电荷的分离发生在粒子表面，产生带正电的空穴和电子，粒子表面的电子可以还原周围介质中的分子，粒子表面的空穴可以被相应的空穴清除剂清除，从而实现光催化过程的持续进行。
23.在这项研究中，建立一种基于二氧化钛与蛋白相互作用的光催化荧光开启方法，用于样本中的总蛋白含量分析。
24.蛋白质在聚苯乙烯孔板上的包被量与溶液中的蛋白质浓度直接相关。二氧化钛纳米粒子可以通过磷酸盐的作用非特异吸附在包被蛋白的孔板上。本实验利用刃天青作为二氧化钛光催化的底物，用tris作为空穴清除，在光照条件下，刃天青能够被还原为荧光产物试卤灵，导致荧光信号的开启。荧光强度的增加直接与加入到微孔中的蛋白浓度直接相关。通过检测产物的荧光强度，建立荧光强度与人血清白蛋白标准品浓度的线性关系，通过线性关系就可以计算待测样品的浓度。
25.吐温能够极大增强二氧化钛对孔板蛋白的吸附能力。在吐温增强作用下，该检测方法非常灵敏，可以在半个小时之内非特异检测出1 ng/ml的人血清白蛋白。最后以尿液为实际样本，对其总蛋白含量做了定量分析。结果表明我们的方法可以用于尿液中总蛋白测定，对肾病筛查具有巨大的应用潜力。
26.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种微量蛋白检测方法，其特征在于，所述微量蛋白检测方法包括如下步骤：步骤一、配制蛋白质溶液，并通过聚苯乙烯孔板进行吸附，随后进行洗涤；步骤二、采用溶剂热法合成二氧化钛纳米粒子，并向孔板中加入二氧化钛，使其与孔板蛋白相结合，并在结合后进行洗涤；步骤三、向孔板中加入显色液，并通过紫外光进行照射，将刃天青转化为试卤灵；步骤四、通过酶标仪对孔板中的荧光数值进行读取并记录。2.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，步骤一中所述的配制蛋白质溶液，并通过聚苯乙烯孔板进行吸附，具体包括如下步骤：s1、用天平称取10 mg人血清蛋白，并用1 ml磷酸盐缓冲液配置浓度为10 mg/ml的标准品；s2、用磷酸盐缓冲液将人血清蛋白稀释至浓度分别为1、2、3、4、5 ng/ml的溶液；s3、将四个浓度的标准品加入到酶标板中，每孔加入200 μl样品，每个浓度设置三个平行孔并在37 ℃的环境下孵育5 min，再用浓度为10 mm，ph 7.4的磷酸缓冲液洗涤，每孔加入360 μl，每次1 min，用力甩干，一共洗涤三次。3.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，步骤二中所述的采用溶剂热法合成二氧化钛纳米粒子，具体包括如下步骤：s1、在室温环境下向不断搅拌的10 ml甲醇溶液中加入5 ml钛酸四丁酯，再滴加0.8 ml氢氟酸，继续搅拌0.5 h后将混合溶液转到40 ml聚四氟乙烯高压反应釜中；s2、在恒温干燥箱中180 ℃反应24 h，随后在室温下冷却，将所得到的产物进行离心，并用乙醇溶液洗涤5次，水洗涤2次；s3、将得到的固体白色沉淀，取100 mg分散在20 ml的浓度为0.1 m的氢氧化钠溶液中过夜搅拌；s4、将溶液通过5000 rpm转速离心5 min去除上清液，随后将沉淀分散在20 ml超纯水中，用2 ml离心管分装为10管，通过13000 rpm转速离心15 min去除上清液，取其中一管60 ℃烘干称重，其他样品放置在4℃备用。4.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，步骤二中所述的向孔板中加入二氧化钛，具体包括如下步骤：s1、用浓度为40 mm，ph 5.0的磷酸-吐温缓冲液分散二氧化钛纳米粒子，使其胶体浓度为20 μg/ml，其中吐温的终浓度为1/10000（v/v）；s2、向酶标板的每孔加入s1中配制的溶液，在37 ℃环境下孵育5 min；s3、对孔板进行洗涤，每孔加入360 μl浓度为40 mm，ph 5.0的磷酸-吐温缓冲液，每次1 min，用力甩干，一共洗涤三次。5.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，步骤三中所述的向孔板中加入显色液，并通过紫外光进行照射，具体包括如下步骤：s1、称取1.28 g的tris溶于1 l超纯水中，其浓度为10 mm，用2 m的氯化氢调节ph为6.8，加入1 ml浓度为5 mm的刃天青水溶液；s2、在聚苯乙烯孔板中每孔加入显色液220 μl，在uv-254 nm紫外光下光照5 min。6.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，步骤四中所述的通过酶标仪对蛋白质溶液中的荧光数值进行读取并记录，具体包括如下步骤：
s1、用移液器将反应产物取出200 μl，转移至黑色酶标板中，采用酶标仪的荧光模块读数；s2、检测每个孔的荧光强度f，建立f与白蛋白标准品质量浓度c之间的标准曲线；s3、将尿液实际样品用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，按照上述步骤与标准样品相同操作检测荧光强度f,带入标准曲线计算实际样本中的蛋白含量。

技术总结
本发明适用于蛋白检测领域，提供了一种微量蛋白检测方法，包括：步骤一、配制蛋白质溶液，并通过聚苯乙烯孔板进行吸附，随后进行洗涤；步骤二、采用溶剂热法合成二氧化钛纳米粒子，并向蛋白质溶液中加入二氧化钛，使其与孔板蛋白相结合，并在结合后进行洗涤；步骤三、向孔板中加入显色液，并通过紫外光进行照射，将显色液中的刃天青转化为试卤灵；步骤四、通过酶标仪对孔板的荧光数值进行读取并记录。本研究提出了一种新的微量蛋白检测方法，通过催化反应实现信号放大，具有操作便捷，速度快，成本低特点，并以尿蛋白检测为例，验证来了方法的可行性，灵敏度，稳定性，具有很高的实际应用价值，为临床尿蛋白检测提供了一种新的解决方案。案。案。


技术研发人员：徐力 郭轶 黄斯俊 于立强
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2022.12.23
技术公布日：2023/7/21