一种抗血管性血友病因子抗体及其应用

1.本发明涉及一种抗血管性血友病因子抗体及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.血栓性血小板减少性紫癜(ttp)是一种血液疾病。患者血液中的金属蛋白酶adamts13受遗传因素或者免疫因素而降低甚至失去活性，从而导致adamts13的酶底物血管性血友病因子(vwf)无法被正常降解。
3.vwf是内皮细胞分泌的一种多聚体糖蛋白，在原发性止血过程中介导血小板粘附于内皮下膜来发挥关键作用。在一般情况下，血液中循环的vwf处于非活化状态，其a1结构域被其他相邻结构域包裹，不与血小板结合。
4.当vwf分子结构被剪切力拉伸时，vwf在血流剪切力作用下，通过其a1结构域和血小板gpib受体结合，激活血小板的凝血功能。在同一时刻，adamts13对vwf的a2结构域的1605y和1606m之间的c-n化学键进行特异性的酶切，从而降低vwf多聚体的分子量。
5.vwf多聚体的凝血活性与其分子量负相关，既adamts13的酶切作用会降低vwf多聚体的凝血活性。在病理条件下，adamts13的活性缺失后，vwf多聚体由于不能被酶切成小片段多聚体，所以形成的超大型vwf分子。这些超大型vwf分子由于其巨大的体积，更容易感受血流剪切力的变化，从而在较小的剪切力时就能随机结合血小板，导致血小板在血液循环中被活化，进而引起血小板的减少和微血栓的随机出现。
6.ttp是一种致命的血液病，如果得不到及时治疗的话，临床致死率可达90％。除了ttp，在2b型vwd中，突变导致的vwfa1结构域活性增强，也能促使vwf在正常血流环境中随机结合血小板，从而导致血小板的减少，病人有较高的黏膜出血风险。其他由vwf参与的血栓性疾病，例如深静脉血栓，脑卒中，肺栓塞等等，其背后均有类似的分子机制。
7.目前世界上临床治疗ttp的方式主要有两种，第一种是血浆置换，第二种是药物治疗包括抗vwf靶向抗体caplacizumab以及正在临床实验阶段的重组radamts13等。我国治疗ttp的方式主要是血浆置换。血浆置换中，病人往往伴随感染和排异反应等并发症，且容易复发。
8.caplacizumab是2019年美国fda批准上市的药物，治疗范围主要用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜。数据表明，接受caplacizumab治疗的病人血小板数量恢复速度更快，且病人的复发率和死亡率均有明显改善。但是，caplacizumab并不完美，使用caplacizumab会急剧减少病人血浆vwf和fviii的含量。
9.caplacizumab结合在a1结构域的n-端短肽区域，它无法区分活化和非活化的vwf，即caplacizumab同时结合活化和非活化vwf，从而导致血浆vwf水平下降，且为了弥补结合vwf后消耗掉的药物浓度，caplacizumab需要高剂量注射才能发挥作用。
10.数据表明caplacizumab会造成病人鼻、牙龈等出血风险增加。而且由于其短暂的半衰期带来的高昂的治疗费用也限制了caplacizumab的使用范围。
11.公开号为cn110624105a的中国专利公开了一种血管性血友病因子的结构敏感多
肽抗原的序列，并基于该抗原对小鼠进行免疫制备了单克隆抗体，通过对该抗体的结合研究发现，随着抗体浓度的增大，活性血管性血友病因子在450nm波长处的紫外吸收增强，而非活性血管性血友病因子在450nm波长处的紫外吸收基本不变，因此提供了一种能够特异性识别活性血管性血友病因子的抗体，并进一步指出，该抗体因可仅识别少数活性蛋白，所以不会导致整体蛋白水平下降，出血风险较低，且不会引起大量蛋白的消耗，持久性强，用量少。但此抗体属于概念性展示来证明多肽抗原的敏感性，其功能未经过优化，对活化状态的vwf的结合常数(kd＝0.18μm)未达到理想状态，在抗体开发中处于初级阶段，并不具备进一步人源化和进入临床试验的潜力，因此也没有获取序列信息的价值。


技术实现要素：

12.为解决上述问题，本发明通过对同一血管性血友病因子的结构敏感多肽抗原制备的抗体进行筛选，提供了一种抗血管性血友病因子抗体，能够特异性结合活化后的vwf分子，注射至体内后不会引起体内血浆vwf含量下降、不影响血浆fviii活性、且能降低出血风险，同时可以缓解ttp小鼠血小板减少和红细胞破碎症状。且对活化的vwf分子具有较高的敏感性(kd＝0.02μm)，具备进一步人源化和进入临床试验的潜力。
13.本发明的第一个目的是提供一种抗血管性血友病因子抗体，所述抗血管性血友病因子抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示。
14.具体地，其可变区序列如下：
15.重链：
16.mnrltssllllivpayvlsqitlkesgpgivqpsqtlsltcsfsgfsltts gmgvswirqpsgkglewlahiywdddkrynpslksrltiskdtssnqvfl kitsvdtadtatyycarrlayssygesydyvldywgqgtsvtvss；
17.轻链：
18.mdfqvqifsfllisasviisrgqivltqspaimsaspgekvtmtcsasss vsymhwyqqksgtspkrwiydtsklasgvparfsgsgsgtsysltisame aedtatyycqqwssdpytfgggtkleik。
19.进一步地，上述抗血管性血友病因子抗体由以下步骤制备得到：
20.s1、将多肽抗原制备成完全抗原，采用所述完全抗原进行动物免疫；
21.s2、对免疫动物采血后进行筛选；
22.s3、将步骤s2筛选出的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合培养，得到分泌抗血管性血友病因子单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
23.s4、对步骤s3得到的杂交瘤细胞株分泌的抗体进行亲和力筛选以及特异性筛选；
24.其中，所述多肽抗原的氨基酸序列如seq id no.3所示。
25.进一步地，在步骤s1中，所述动物免疫过程包括首次免疫、加强免疫和冲刺免疫。
26.进一步地，所述动物为小鼠。
27.进一步地，在步骤s1中，所述完全抗原由上述多肽抗原与载体蛋白偶联得到。
28.进一步地，所述载体蛋白包括牛血清蛋白bsa、卵清蛋白ova、钥孔血蓝蛋白klh等。
29.进一步地，上述多肽抗原抗原通过碳二亚胺法与载体蛋白偶联，具体制备方法包括以下步骤：
30.(1)将上述多肽抗原活化，得到活化液；
31.(2)将步骤(1)得到的活化液加入载体蛋白溶液中，反应得到完全抗原。
32.进一步地，在步骤(1)中，所述的活化为，将多肽抗原溶解，加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺进行反应。
33.进一步地，采用n,n-二甲基甲酰胺溶解多肽抗原。
34.进一步地，在步骤(2)中，对反应后的溶液进行透析、分离，得到完全抗原。
35.进一步地，在步骤(2)中，所述载体蛋白溶液是通过将载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲溶液中得到。
36.进一步地，所述碳酸盐缓冲溶液为0.01-0.5mol/l(优选为0.05mol/l)，ph为8.0-10.0(优选为9.6)。
37.进一步地，在步骤s2中，通过间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)检测血清免疫效价和免疫抑制能力，实现免疫动物的筛选。
38.本发明的第二个目的是提供上述抗血管性血友病因子抗体在制备抗体药物中的应用。
39.进一步地，所述的抗体药物为治疗或预防血栓性疾病的药物。
40.进一步地，所述血栓性疾病包括但不限于血栓性血小板减少性紫癜、中风、脑卒中、冠状动脉硬化、溶血尿毒综合征、血栓性微血管病等。
41.进一步地，所述抗体药物特异性结合活化的vwf分子且不结合非活化的vwf分子。
42.进一步地，所述抗体药物能抑制vwf介导的血栓。
43.本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物中包括上述抗血管性血友病因子抗体。
44.进一步地，上述药物组合物中还包括药学上可接受的辅料和/或载体。
45.本发明的抗体药物注射至体内后，不同于caplacizumab，不会引起体内血浆vwf含量下降、不影响血浆fviii活性、且能降低出血风险，同时可以缓解ttp小鼠血小板减少和红细胞破碎症状，在治疗血栓性血小板减少性紫癜等血栓性疾病中具有潜在应用。
46.本发明的第四个目的是提供一种诊断试剂，该诊断试剂中包括上述抗血管性血友病因子抗体，测定待测样本中是否存在氨基酸序列如seq id no.3所示的多肽抗原。
47.本发明的有益效果：
48.本发明提供的一种新型抗血管性血友病因子抗体，具有只结合活化以后的vwf分子，而不结合非活化的vwf分子，以及能抑制vwf介导的血栓等特点，从而避免caplacizumab的缺陷，能够对多种血管性血友病因子相关疾病进行诊断和治疗，作为血栓性疾病治疗药物的有力备选，具有很好的应用前景。
附图说明
49.图1为第二轮筛选中抗体10c9、13f6和11a5针对天然vwf蛋白的结合情况；
50.图2为抗体10c9、13f6和11a5对尿素处理过的vwf的识别情况；
51.图3为caplacizumab和抗体11a5与天然vwf分子的结合情况；
52.图4为抗体11a5与活化和非活化的vwfa1结构域的结合情况；
53.图5为对小鼠分别注射pbs、抗体11a5或caplacizumab对血浆vwf含量的影响；
54.图6为对小鼠分别注射pbs、抗体11a5或caplacizumab对血浆fviii活性的影响；
55.图7为对小鼠分别注射pbs、caplacizumab或不同浓度的抗体11a5对尾出血时间的影响；
56.图8为对小鼠注射抗体11a5对ttp模型小鼠血小板水平和红细胞破碎的影响。
具体实施方式
57.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
58.本发明用vwfa1结构域上结构敏感的多肽序列：glkdrkrpse(aa：1330-1339)作为抗原。将对应合成的多肽与偶联的载体蛋白一起对小鼠进行免疫。再用杂交瘤细胞对小鼠的脾脏细胞进行融合。将融合好的单克隆细胞进行两轮筛选。第一轮针对上述的多肽抗原，结果筛选出结合最强的三株细胞，分别是10c9，13f6和11a5。第二轮的筛选是针对从健康成年人的血液中提取出的全长天然非活化状态的vwf蛋白。通过对比最终选择11a5作为最优抗体。
59.实施例1抗原的获取
60.血管性血友病因子有2050个氨基酸，14个结构域组成。其中，a1结构域是与之凝血功能相关的结构域，a1结构域有205个氨基酸，这些氨基酸在蛋白质的结构中的位置是已知的。从人源的血管性血友病因子a1结构域上与a1结构域两翼的端肽互动的区域选取了一段10个氨基酸长度的vwf结构域上结构敏感的多肽序列作为抗原，具体地，氨基酸序列为glkdrkrpse(seq id no.3，aa：1330-1339)。
61.实施例2完全抗原的制备
62.多肽(seq id no.3)通过化学合成方法制备。多肽c-末端增加一个半胱氨酸用来与载体蛋白进行偶联。载体蛋白选择鸡卵白蛋白ova。多肽与载体蛋白以20:1摩尔比通过进行偶联。首先将ova与偶联试剂nhs-peg-maleimide以1:20摩尔比在ph＝7.4的pbs缓冲溶液中进行室温反应一小时。再将溶解的多肽样品按照相同比例加入，再在室温反应一小时。随后将混合物用分子筛进行分离后得到纯的完全抗原。
63.实施例3小鼠的免疫
64.小鼠分8次进行免疫，免疫途径为小鼠皮下注射，部位分为小鼠颈背部皮下、前后腿跟部皮下。首次免疫剂量为400ug，8天后400ug再注射一次；第3次进入加强免疫阶段，每次加强免疫剂量为100ug，间隔时间5天，持续6次。最后一次冲刺免疫间隔时间10天，注射剂量为400ug。血清分离及免疫血清效价鉴定：小鼠下腔静脉取血后30℃放置30分钟使其凝固，通过离心后收集上清获得含抗原血清。利用酶联免疫吸附试验测定抗体效价。
65.实施例4细胞融合与筛选
66.(1)在冲刺免疫三天后，按照常规peg 4000(聚乙二醇)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
67.a、收集sp2/0瘤细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10％ fbs(胎牛血清)rpmi-1640培养基在5％ co2培养箱中培养。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1-4*107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
68.b、脱颈法处死小鼠后，立即放入75％酒精中灭菌，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液。收集到50ml无菌离心管后1200r/min离心8min，用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞，挑出较打的组织杂质，重复操作三次。最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
69.c、融合过程7min：第1min，将1ml的peg 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置并双手紧握离心管。第3min和第4min，在1min内滴加1ml rpmi-1640培养基；第5min和第6min，每30s内滴加1ml rpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃下温浴5min。800r/min离心10min，弃上清，轻轻敲散离心管内的细胞，并向其中加入含20％胎牛血清，2％50
×
hat的rpmi-1640选择性培养基(hat培养基)，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％ co2培养箱中培养。
70.(2)细胞筛选与细胞株建立：
71.将融合的杂交瘤细胞置于96孔板中进行培养繁殖。待培养基变黄后，取100μl培养基，加入提前包被多肽抗原的96孔板进行elisa鉴定。选出结合最强的前20个细胞株进入第一轮放大培养。
72.这20株细胞培养基成熟变黄后，取100μl培养基，加入提前包被活性vwf-a1结构域蛋白rvwfa1
1261-1472
抗原的96孔板进行elisa鉴定。筛选出结合最强的前三株细胞(10c9,13f6,11a5)进行第二轮筛选。第二轮筛选中，进行elisa分析的96孔板用人血浆来源的非活性vwf蛋白进行包被。筛选结合最弱的细胞株做为目标。
73.第二轮筛选结果见图1-2。如图1所示：在第二轮筛选中，10c9与vwf的结合在检测范围内(10-8
到10-5
摩尔浓度)呈线性关系，不符合我们的需要。13f6和11a5在这个区间都与vwf没有显著结合。如图2所示：当我们比较这些单克隆抗体结合天然vwf以及通过尿素变性后的vwf(目的是通过尿素使蛋白的抗原暴露出来)时发现，13f6无法结合变性后的vwf，意味着13f6无法正确识别在蛋白序列中的多肽抗原(原因可能是受到空间构象的影响)。10c9对天然vwf以及通过尿素变性后的vwf都有较强的结合，也无法满足要求。只有11a5能区分天然vwf和通过尿素变性后的vwf：对天然vwf分子，11a5几乎不结合，而当加入尿素后，11a5的结合有明显提高。这些结果说明：三个抗体中，只有11a5满足设计要求。为了对11a45进行进一步验证，以及和caplacizumab进行对比，我们首先通过酶联免疫反应(elisa)验证了caplacizumab与11a5对非活化vwf分子的结合情况。
74.实施例5与caplacizumab的效果对比
75.我们用人血浆来源的vwf(6ug/ml)或者代表活化vwf的重组a1结构域蛋白rvwfa1
1261-1472
(2ug/ml)包被96孔板，再将caplacizumab-his或11a5通过梯度稀释的方式加入同一块96孔板。室温震荡孵育1小时后，用1xpbs洗涤该96孔板，然后加入对应的2抗(anti-his或兔抗鼠-igg)进行识别。最后将加过2抗的96孔板洗涤后，加入显色剂，用读板机获得450nm的吸收信号来定量结合的分子。
76.结果见图3-7。如图3所示，caplacizumab结合非活化的vwf分子，而在同一浓度范围内，11a5不结合。我们接着又过elisa验证了11a5与活化和非活化vwf的结合情况。如图4所示：11a5能以高亲和力结合代表活化vwf的重组a1结构域蛋白rvwfa1
1261-1472
，而不与非活化的vwf蛋白结合。
77.我们通过c57bl/6j小鼠来验证11a5与caplacizumab在清除血浆vwf方面的差异。
如图5所示，与注射8ug每毫升的11a5相比，注射2ug每毫升的caplacizumab导致明显小鼠血浆vwf水平下降。对血液fviii活性的鉴定结果显示，如图6所示，caplacizumab引起fviii水平的剧烈下降，而11a5对fviii的水平几乎没有影响。尾出血实验进一步表明，如图7所示，caplacizumab引起小鼠的尾出血时间大大延长，而11a5虽然也有一定的延长，但是与caplacizumab相比要短很多。而且5倍剂量的11a5依然保持了类似的尾出血时间。这些结果表明11a5比caplacizumab更安全，其背后的分子机制也十分清晰，就是不与血浆中非活化的vwf结合，从而降低了消耗，也维持了vwf以及fviii的浓度。
78.实施例6adamts13敲除小鼠模型验证11a5对ttp的预防作用
79.adamts13敲除小鼠是研究ttp的经典动物模型。我们通过crisper/cas9技术敲除了c57bl/6j小鼠adamts13基因1-6号外显子。所得子代含有杂合子的小鼠再进行交配，最终得到了纯合子adamts13基因敲除小鼠。该基因型用pcr和western blot进行了验证。
80.结果表明，如图8所示，当用ddavp诱发ttp症状时，用预先注射过11a5的小鼠有明显的抵制血小板下降和红细胞破碎的能力。
81.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种抗血管性血友病因子抗体，其特征在于：所述抗血管性血友病因子抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的抗血管性血友病因子抗体，其特征在于：所述抗血管性血友病因子抗体由多肽抗原制备的完全抗原对动物进行免疫得到；所述多肽抗原的氨基酸序列如seq id no.3所示。3.根据权利要求2所述的抗血管性血友病因子抗体，其特征在于：所述完全抗原由所述多肽抗原与载体蛋白偶联得到。4.权利要求1-3任一项所述的抗血管性血友病因子抗体在制备抗体药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗体药物为治疗或预防血栓性疾病的药物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述血栓性疾病为血栓性血小板减少性紫癜、中风、脑卒中、冠状动脉硬化、溶血尿毒综合征或血栓性微血管病。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗体药物特异性结合活化的血管性血友病因子。8.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物中包括权利要求1-3任一项所述的抗血管性血友病因子抗体。9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物中还包括药学上可接受的辅料和/或载体。10.一种诊断试剂，其特征在于：所述诊断试剂中包括权利要求1-3任一项所述的抗血管性血友病因子抗体。

技术总结
本发明公开了一种抗血管性血友病因子抗体及其应用，属于生物技术领域。本发明抗血管性血友病因子抗体的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，由氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的多肽抗原免疫动物得到，该抗体能够特异性结合活化后的VWF分子，注射至体内后不会引起体内血浆VWF含量下降、不影响血浆FVIII活性、且能降低出血风险，同时可以缓解TTP小鼠血小板减少和红细胞破碎症状，可作为血栓性疾病治疗药物的有力备选。疗药物的有力备选。疗药物的有力备选。


技术研发人员：邓巍
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2022.11.21
技术公布日：2023/7/21