副干酪乳杆菌SMN-LBK在制备提高免疫力产品中的应用的制作方法

副干酪乳杆菌smn-lbk在制备提高免疫力产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种副干酪乳杆菌smn-lbk在制备提高免疫力产品中的应用。


背景技术：

2.肠道是重要的微生态系统，肠道微生物量占人体总微生物量的78％，集结了人体约60％-70％的免疫细胞，是成功维护人体健康的天然屏障。肠黏膜表面与外界抗原(比如：食物、共生菌、有害病原体等)直接接触，在抵抗感染方面起着极其重要的作用。肠道菌群的变化不仅会影响局部细胞功能和免疫反应，而且在呼吸系统疾病中也起着重要作用，如：肠道菌群与流感病毒感染的免疫反应有着密切的关系。
3.人体免疫力，主要是指免疫系统抵抗外部微生物感染以及修复内部组织的能力。比如抵抗细菌及各种病毒的侵袭、修复损伤细胞、清除坏死细胞、阻止恶性肿瘤细胞生长等。免疫系统是一个完整且强大的系统，包括胸腺、脾脏、淋巴等特有的免疫器官。按其功能可分为体液免疫系统、细胞免疫系统、吞噬系统以及补体系统。免疫屏障是人体重要的保护屏障，然而随着生活节奏的加快以及生态环境的变化，大多数人的免疫屏障受损，免疫力低下，容易因病原菌的侵入而生病，容易产生过敏反应。
4.目前，市面上有不少用于提高免疫力的产品，这些产品大多从宏观上调节免疫力，即通过靶向药物在一定时间内提升机体免疫力。虽然能在短期内起到一定效果，但效果容易反弹，且长期服用这类型产品容易导致人体内环境失衡，没有从根本上强化机体免疫屏障。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供副干酪乳杆菌smn-lbk在制备提高免疫力产品中的应用。
6.本发明的目的之二在于提供一种提高免疫力的益生菌组合物。
7.本发明的目的之三在于提供一种提高免疫力的产品。
8.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
9.益生菌在制备提高免疫力的产品中的应用，所述益生菌包括保藏编号为cctcc no：m 2017429的副干酪乳杆菌smn-lbk。
10.作为本发明的一个优选方案，所述提高免疫力的产品的活性成分包括副干酪乳杆菌smn-lbk的活菌体和/或灭活型菌体。
11.作为本发明的一个优选方案，所述提高免疫力的产品包括食品、保健品、药品和营养补充剂。
12.作为本发明的一个优选方案，所述提高免疫力的产品为口服制剂，所述口服制剂的剂型包括口服液、滴剂、片剂、粉剂、胶囊剂或颗粒剂。
13.作为本发明的一个优选方案，在所述提高免疫力的产品中，所述副干酪乳杆菌k9
的含量为1.0
×
109～1.0
×
10
11
cfu/g。1.0
×
109～1.0
×
10
11
cfu/g为益生菌的活菌数。
14.作为本发明的一个优选方案，在所述提高免疫力的产品中，所述益生菌还包括保藏编号为cgmcc no.15026动物双歧杆菌乳亚种y6。
15.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
16.本发明还提供了一种提高免疫力的益生菌组合物，包括保藏编号为cctcc no：m 2017429的副干酪乳杆菌smn-lbk，以及，保藏编号为cgmcc no.15026动物双歧杆菌乳亚种y6。
17.作为本发明的一个优选方案，所述副干酪乳杆菌smn-lbk与所述动物双歧杆菌乳亚种y6的重量比为(1～3):1，优选地为1：1。
18.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
19.一种提高免疫力的产品，包括保藏编号为cctcc no：m 2017429的副干酪乳杆菌smn-lbk。
20.一种提高免疫力的产品，包括保藏编号为cctcc no：m 2017429的副干酪乳杆菌smn-lbk，以及，保藏编号为cgmcc no.15026动物双歧杆菌乳亚种y6。
21.作为本发明的一个优选方案，所述提高免疫力的产品包括益生菌冻干粉、益生菌晶球和益生菌发酵物等。
22.作为本发明的一个优选方案，所述提高免疫力的产品为大豆发酵制品，所述副干酪乳杆菌smn-lbk和所述动物双歧杆菌乳亚种y6可以提高大豆发酵制品中的辅酶a含量。
23.作为本发明的一个优选方案，所述大豆发酵制品为益生菌发酵腐乳，所述益生菌发酵腐乳的制备过程包括以下步骤：
24.1、大豆浸泡：用软水浸泡大豆，水温8-15℃，加入na2co3，调节溶液ph为9～11，浸泡10～14h。
25.2、磨浆：将泡发的大豆用4～8倍水研磨至颗粒粒度为10～20μm，得基料a。
26.3、滤浆：调节离心机转速为1200～2000r/min，使用80～150目尼龙绢丝布作为滤布。将基料a用离心机离心分离得头浆，在头浆滤渣中加入适量水进行第二次洗涤分离得二浆，在二浆滤渣中加入适量水进行第三次洗涤分离得三浆，在三浆滤渣中加入适量水进行第四次洗涤分离得四浆，之后套用。即四浆套三浆，三浆套二浆，二浆与头浆合并为豆浆。
27.4、煮浆：将豆浆快速煮沸到100℃，加热温度控制在96-100℃保持3～8min，得基料b。
28.5、点浆与蹲脑：将基料b用0.5～2％naoh调节ph至6～7.5，控制温度为70～90℃，用适量18～25波美度的盐卤搅匀得基料c。将基料c于10-15min蹲脑静置，得基料d。
29.6、压榨：在厢内盛足豆腐脑，将厢外多余的包布向内折叠，将四周包住，上厢完毕，其上放榨板一块，并缓慢加压，榨出适量黄泔水后，陆续加大压榨力度，直到厢内黄泔水基本不往外流淌为止。
30.7、划坯：压榨结束，揭开包布，暴露豆腐坯，按品种规格划块后，得基料e，送入培菌间。
31.8、菌株制备：
32.(1)纯种的斜面培养：培养基为麦芽糖用水稀释到7～9波美度共100ml，加入蛋白胨1～1.5g，琼脂1～2g，调ph至6～7，以0.1～0.2mpa灭菌25～35min，接种副干酪乳杆菌
smn-lbk和/或动物双歧杆菌乳亚种y6，于25～30℃培养68～75h，备用。
33.(2)扩大的种子培养：种子培养基为小麦麸皮20～30g，水30～40ml，搅匀后，装入800～1000ml的克氏瓶，于0.1～0.2mpa灭菌35～45min，冷却后，接种副干酪乳杆菌smn-lbk和/或动物双歧杆菌乳亚种y6，于25～30℃培养68～75h，得种子瓶。
34.(3)菌悬液制备：将培养好的种子瓶加入适量的灭菌冷水，做成菌液，通过灭菌滤布即成菌种悬浮液。
35.9、接种：将摆好的豆腐坯，采用喷洒接种，使豆腐坯的五个面均匀喷洒到菌悬液，得基料f。
36.10、培养：将基料f于25～30℃培养20～25h后进行第一次翻格，继续培养3～4h后进行第二次翻格，继续培养10～14h后，得基料g。
37.11、凉花：将基料g转移至15～20℃的环境中，冷却得基料h；
38.12、腌坯：将基料h放入已有圆形木板垫底的缸中，逐层加入白砂糖，腌制1.5～3d后，过滤得基料i；
39.13、装坛：将基料i装入发酵坛中，加入无菌水，再以荷叶盖面层，荷叶上加食盐100～200g后，封口保存4个月，得益生菌发酵腐乳。
40.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
41.(1)本发明所提供的副干酪乳杆菌smn-lbk，具有提高机体免疫力的效果，且效果优于其余副干酪乳杆菌菌株。
42.(2)本发明所提供的副干酪乳杆菌smn-lbk，能够定殖于肠道，调节肠道菌群平衡，抑制致病菌生长繁殖，修复受损免疫屏障，调节免疫应答，促进辅酶a的生物合成，进而增强机体免疫力。
43.(3)本发明所提供的益生菌组合物，包括副干酪乳杆菌smn-lbk和动物双歧杆菌乳亚种y6，两者相互协同，共同促进机体免疫力的提升。
44.生物材料保藏信息：
45.副干酪乳杆菌smn-lbk，保藏编号为cctcc no：m 2017429，分类命名为：lactobacillus paracasei smn-lbk，已于2017年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮政编码：430072)，保藏单位的缩写为cctcc。
46.副干酪乳杆菌k9，保藏编号为cgmcc no.15025，分类命名为：副干酪乳杆菌lactobacillus paracasei，已于2017年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为cgmcc。
47.动物双歧杆菌乳亚种y6，保藏编号为cgmcc no.15026，分类命名为：动物双歧杆菌乳亚种bifidobacterium animalis subsp.lactis，已于2017年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为cgmcc。
48.发酵乳杆菌fm-12，保藏编号为gdmcc no.62045，分类命名为：lactobacillus fermentum，已于2021年11月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所，邮政编码：510070)，保藏单位的缩写为gdmcc。
附图说明
49.图1为本发明实施例1空白组小鼠的组织病理学检测结果图；
50.图2为本发明实施例1模型组小鼠的组织病理学检测结果图；
51.图3为本发明实施例1实验a组小鼠的组织病理学检测结果图；
52.图4为本发明实施例1实验b组小鼠的组织病理学检测结果图。
具体实施方式
53.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
54.副干酪乳杆菌l9，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏时间为2014年10月22日，保藏号为cgmccno.9800(详见专利cn201410752780.5)。
55.长双歧杆菌w68，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏时间为于2017年12月7日，保藏编号为cgmcc no.15028(详见专利cn2019106644081)。
56.实施例1
57.本发明实施例1发现副干酪乳杆菌smn-lbk能够提高机体免疫力，其对机体免疫力的提高效果要优于副干酪乳杆菌k9和副干酪乳杆菌l9。实施例1采用环磷酰胺作用于小鼠制造免疫力低下小鼠模型，并以此进行菌株的筛选，具体操作如下。
58.小鼠模型实验
59.1、实验动物：64只spf级nih小鼠，雌性。
60.2、实验菌株：副干酪乳杆菌smn-lbk、副干酪乳杆菌k9、副干酪乳杆菌l9。
61.3、剂量设计与分组：将小鼠适应性饲养2d后，随机分为空白对照组，模型对照组，实验a、b、c、d、e、f组，各组8只，具体见表1。
62.表1剂量设计与分组情况表
[0063][0064]
4、供试品配制方法
[0065]
(1)菌种活化及活菌悬液制备：
[0066]
第一天，在无菌环境下，用75％酒精棉球消毒外包装，用灭菌的接种环取部分冻干粉末溶解于mrs肉汤培养基内(剩余冻干粉盖上封口膜封口留样保存)，置37℃培养24～36h，出现明显混浊即可。
[0067]
第二天，用接种环取混匀后的mrs肉汤新鲜培养物，平板分区梯度划线(四区或者五区划线)于mrs琼脂平板上，置37℃培养36h～48h，以检验菌种之纯度及活化情形。
[0068]
第四天，用接种环挑取mrs平板的菌落，接种到mrs肉汤培养基内，置37℃培养24h。
[0069]
第五天，取新鲜的mrs肉汤培养物，接种mrs琼脂斜面上(需形成单个小菌落，因此划线使用接种针)，置37℃培养24～36h，即为lp菌种斜面，2～8℃保存备用，有效期5天。试验前一天，取菌种斜面菌落，接种到mrs肉汤培养基中，置37℃培养18h(16～24h)，离心(3500g，4℃，5min)，小心倒掉上清液，用等体积生理盐水重悬后制成每l ml含菌数约3
×
108cfu/ml(菌落形成单位)的菌悬液。
[0070]
(2)灭活菌悬液制备：试验前，将上述活菌菌悬液置恒温水浴锅中，68℃水浴30min。
[0071]
(3)造模方法：除空白对照组外，其他各组动物按10ml/kg体重的体积腹腔注射10mg/ml的环磷酰胺溶液(相当于100mg/kg体重的剂量)，每天1次，连续3天，空白对照组动物使用相同给药方式给予等体积无菌生理盐水。
[0072]
(4)给药方法：动物分组后，实验a、b、c、d、e、f组组每天下午分别灌胃给予对应的受试样品，1次/天，10ml/kg体重，空白对照组和模型对照组以同样的方式给予生理盐水，连续14天。
[0073]
5、检测指标
[0074]
(1)一般临床观察：每天观察动物的一般临床情况一次，至试验结束。
[0075]
(2)体重：试验过程中，每天称量并记录动物体重一次。
[0076]
(3)收集粪便：试验过程中，每天收集各动物粪便1～2粒，每只动物的粪便使用一根灭菌塑料管独立保存，并标记对应动物编号，-80℃冻存备用。
[0077]
(4)摄食量：于d1，d4，d7，d10，d13，d17测量并记录摄食量。
[0078]
(5)脏器指数：末次给药结束后的次日，取肾、肝、胸腺、脾脏、下颌下淋巴结、卵巢进行称重，计算其脏器指数。
[0079]
(6)脏器冻存：末次给药结束后的次日，取称完重量的肾、肝、胸腺、下颌下淋巴结、卵巢进行-80℃冻存备用。每只动物每种脏器使用单独一支塑料冻存管存放，并做好标记。
[0080]
(7)血常规检测：末次给药结束后，各组动物禁食不禁水12h，戊巴比妥钠麻醉后(腹腔注射3％溶液，0.15ml/100g体重)，眼眶静脉丛采血于抗凝采血管中，用全血细胞分析仪完成白细胞(wbc)、红细胞(rbc)和血小板(plt)计数。
[0081]
(8)淋巴细胞阳性率检测；眼眶静脉丛采血1～2滴于玻片上，推片，血片在4℃甲醛-丙酮固定液中固定30s，自来水漂洗晾干，移入α-醋酸萘酯酶(anae)染色液中，37℃浸染2h，自来水漂洗晾干，2％甲基绿复染30min后镜检。淋巴细胞核染为深绿色，t淋巴细胞呈现棕红色或深棕色，显微镜下计数100个淋巴细胞，记录t淋巴细胞数量。
[0082]
(9)t淋巴细胞cd4+/cd8+比例的测定：小鼠眼眶采血0.5ml，加入抗凝剂肝素钠5μl，外送检测cd4+细胞和cd8+细胞百分比。
[0083]
(10)nk细胞活性：采集血液后，各组动物经颈椎脱臼法处死，无菌取脾，称重，将200目筛网置于盛有适量无菌hank’s液的小平皿中，除取0.4cm作病理检查外，将脾放于筛网中，用1ml注射器芯轻轻研磨脾脏，经过滤制成单细胞悬液，1000rpm，离心10min，弃上清，按1:1(v:v)加入红细胞裂解液，吹散混匀，4℃冰箱放置10min，重复裂解操作一次。裂解红细胞后，4℃1000rpm，离心10min，弃上清，重复裂解步骤至红细胞裂解完全，再加入5ml hank’s液，1000rpm，离心10min，弃上清，用2ml rpmi 1640完全培养液重悬后，用台盼兰染色计算活细胞数(应在95％以上)，最后用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为2
×
107个/ml。取靶细胞yac-1和效应细胞各100μl(效靶比50：1)，加入u型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl；靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％triton各100μl；上述各项均设三个平行孔，于37℃，5％o2培养箱中培养4h，然后将u型96孔培养板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入ldh基质液100μl，反应6min，每孔加入1mol/l的hcl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(od)。按照以下公式计算nk细胞活性：nk细胞活性(％)＝(反应孔od-自然释放孔od)/(最大释放孔od-自然释放孔od)。
[0084]
(11)骨髓有核细胞计数：动物采脾脏后，小鼠经颈椎脱臼法处死，取右侧完全股骨，除净软组织，用3％醋酸液5ml冲出全部骨髓，过4号针头使成单细胞悬液，显微镜下进行骨髓有核细胞计数。
[0085]
(12)组织病理学检测：留取的脾脏4％中性甲醛固定，石蜡包埋，he染色，病理检测。
[0086]
6、结果与分析
[0087]
在试验过程中，无动物死亡。结果详见表2-5。
[0088]
表2受试品对环磷酰胺致免疫力低下小鼠模型体重的影响(g，n＝8)
[0089]
组别d1d4d7d10d13d17空白对照组25.4
±
2.226.4
±
1.927.3
±
1.827.8
±
1.328.3
±
1.529.5
±
1.8模型对照组25.1
±
1.624.0
±
2.022.8
±
2.321.7
±
1.720.4
±
2.219.3
±
1.2实验a组25.2
±
1.024.5
±
1.625.2
±
1.326.8
±
1.127.9
±
1.428.3
±
1.3实验b组25.0
±
1.426.2
±
2.027.7
±
2.428.2
±
2.129.0
±
2.030.2
±
1.9实验c组25.3
±
0.423.1
±
1.223.5
±
0.324.2
±
1.025.7
±
1.526.1
±
0.8实验d组25.5
±
1.124.7
±
0.425.0
±
2.825.7
±
2.126.8
±
1.228.1
±
0.5实验e组24.8
±
0.723.7
±
1.322.2
±
2.421.5
±
0.220.0
±
0.519.1
±
1.7实验f组24.9
±
2.424.1
±
0.122.5
±
0.421.0
±
1.520.5
±
2.119.7
±
1.3
[0090]
从表2可得，环磷酰胺溶液使模型小鼠免疫系统被破坏，小鼠体重降低。实验a组和实验b组显示，副干酪乳杆菌smn-lbk的干预可以促进小鼠体重增长，特别是实验b组采用副干酪乳杆菌smn-lbk的活菌悬液进行干预，小鼠的体重恢复较快，随着干预天数的增多，小鼠体重赶超空白对照组。实验c组和实验d组的结果显示，副干酪乳杆菌k9的活菌悬液和灭火菌悬液均能从一定程度上促进小鼠体重增长(活菌悬液的效果较优)，但是副干酪乳杆菌k9的效果整体差于副干酪乳杆菌smn-lbk。而从实验e组和实验f组可得，在实验周期内，副干酪乳杆菌l9对小鼠体重的恢复效果较差，小鼠体重与模型组的体重较接近。
[0091]
表3受试品对环磷酰胺致免疫力低下小鼠模型脏器重量的影响(g，n＝8)
[0092][0093]
表4受试品对环磷酰胺致免疫力低下小鼠模型脏器指数的影响(n＝8)
[0094][0095][0096]
从表3-4可得，模型小鼠免疫系统被破坏后，脏器受到损伤，导致脏器重量受到影响。采用副干酪乳杆菌对环磷酰胺致免疫力低下小鼠进行益生菌干预后，小鼠的免疫力得到不同程度的提升。其中，副干酪乳酪杆菌smn-lbk的效果最为显著，通过副干酪乳杆菌smn-lbk的干预，可以提高脏器的免疫力，修复损伤细胞，脏器重量恢复到正常水平，小鼠的各脏器指标趋于正常小鼠。副干酪乳酪杆菌k9和副干酪乳酪杆菌l9的效果不如副干酪乳酪杆菌smn-lbk。
[0097]
表5受试品对环磷酰胺致免疫力低下小鼠模型血液相关指标的影响(n＝8)
[0098]
[0099][0100]
血液相关指标，包括：白细胞，红细胞，血小板计数、骨髓有核细胞，t淋巴细胞计数、nk细胞活性、cd4+/cd8+比例。具体分析如下。
[0101]
从表5可得，对于血常规，与空白对照组比较，模型对照组动物外周血血小板计数增高，有显著性差异。用益生菌对模型小鼠进行干预，副干酪乳酪杆菌smn-lbk效果最为显著，小鼠的白细胞计数及红细胞指标趋于正常小鼠。
[0102]
对于t淋巴细胞计数，与空白对照组比较，模型对照组动物t淋巴细胞计数增加，具有显著性差异。用益生菌对模型小鼠进行干预，副干酪乳酪杆菌smn-lbk效果最为显著，小鼠的t淋巴细胞指标趋于正常小鼠。
[0103]
对于t淋巴细胞cd4+/cd8+比例，用益生菌对模型小鼠进行干预，副干酪乳酪杆菌smn-lbk效果最为显著，小鼠的cd4+/cd8+指标趋于正常水平。cd4代表t淋巴细胞分类中t辅助细胞，cd8代表t抑制细胞和t杀伤细胞，cd4/cd8比值是评判免疫力的一项指标，正常值介于1.4到2.0之间，假如比值大于2.0或者小于1.4，说明细胞的免疫功能发生了紊乱。
[0104]
对于nk细胞活性，用益生菌对模型小鼠进行干预，副干酪乳酪杆菌smn-lbk效果最为显著，小鼠的nk细胞活性指标趋于正常小鼠。nk细胞偏低提示人体免疫力降低，常见于病毒的感染。
[0105]
对于骨髓有核细胞计数，用益生菌对模型小鼠进行干预，副干酪乳酪杆菌smn-lbk效果最为显著，小鼠的骨髓有核细胞指标趋于正常小鼠。免疫力低下，可导致贫血，如：骨髓有核细胞降低。
[0106]
此外，组织病理学检测结果见图1-4。图1显示，空白组小鼠的脾脏组织结构未见异常变化。图2显示，模型组小鼠的脾脏白髓淋巴细胞减少，红髓巨核细胞增多。模型对照组脾脏较空白对照组可见一定的组织学变化，主要表现为脾脏白髓淋巴细胞减少、红髓髓外造血增加或巨核细胞增多。图3-4分别为实验a组和实验b组的脾脏结构检测图，图中可得，实验a组、实验b组脾脏白髓淋巴细胞减少程度较模型对照组有所改善，脾脏红髓髓外造血有所增强。
[0107]
实施例2
[0108]
本发明实施例2提供了副干酪乳杆菌smn-lbk在提高机体免疫力的应用场景，利用副干酪乳杆菌k9、副干酪乳杆菌smn-lbk、副干酪乳杆菌l9、动物双歧杆菌乳亚种y6、长双歧杆菌w68、发酵乳杆菌fm-12或者它们的组合发酵大豆制成益生菌发酵腐乳，所得的腐乳富含辅酶a。辅酶a具有提高免疫力的作用，例如，辅酶a支持机体免疫系统对有害物质的解毒、激活白细胞、促进血红蛋白的合成、参与抗体的合成，可以通过提前激活先天免疫应答抵抗流感。
[0109]
一种益生菌发酵腐乳，按照以下方法制备而成：
[0110]
1、大豆浸泡：用软水浸泡大豆，水温10℃，加入na2co3，调节溶液ph为10，浸泡12h。
[0111]
2、磨浆：将泡发的大豆用6倍水研磨至颗粒粒度为15μm，得基料a。
[0112]
3、滤浆：调节离心机转速为1450r/min，使用100目尼龙绢丝布作为滤布。将基料a用离心机离心分离得头浆，在头浆滤渣中加入适量水进行第二次洗涤分离得二浆，在二浆滤渣中加入适量水进行第三次洗涤分离得三浆，在三浆滤渣中加入适量水进行第四次洗涤分离得四浆，之后套用。即四浆套三浆，三浆套二浆，二浆与头浆合并为豆浆。
[0113]
4、煮浆：将豆浆快速煮沸到100℃，加热温度控制在96-100℃保持5min，得基料b。
[0114]
5、点浆与蹲脑：将基料b用1％naoh调节ph至6.8，控制温度为80℃，用适量24波美度的盐卤搅匀得基料c。将基料c于10-15min蹲脑静置，得基料d。
[0115]
6、压榨：在厢内盛足豆腐脑，将厢外多余的包布向内折叠，将四周包住，上厢完毕，其上放榨板一块，并缓慢加压，榨出适量黄泔水后，陆续加大压榨力度，直到厢内黄泔水基本不往外流淌为止。
[0116]
7、划坯：压榨结束，揭开包布，暴露豆腐坯，按品种规格划块后，得基料e，送入培菌间。
[0117]
8、菌株制备：
[0118]
(1)纯种的斜面培养：培养基为麦芽糖用水稀释到8波美度共100ml蛋白胨1.5g，琼脂2g，调ph至6.8，以0.1mpa灭菌30min，按照表6的组别接种相应的益生菌于30℃培养72h，备用。
[0119]
(2)扩大的种子培养：种子培养基为小麦麸皮25g，水35ml，搅匀后，装入800ml的克氏瓶，于0.1mpa灭菌45min，冷却后，接种益生菌于30℃培养72h，得种子瓶。
[0120]
(3)菌悬液制备：将培养好的种子瓶加入适量的灭菌冷水，做成菌液，通过灭菌滤布即成菌种悬浮液。
[0121]
9、接种：将摆好的豆腐坯，采用喷洒接种，分别按照表6的组别，以6％的接种量(豆腐坯重量的6％)使豆腐坯的五个面均匀喷洒到菌悬液，得基料f。
[0122]
10、培养：将基料f于30℃培养22h后进行第一次翻格，继续培养4h后进行第二次翻格，继续培养12h后，得基料g。
[0123]
11、凉花：将基料g转移至18℃的环境中，冷却得基料h；
[0124]
12、腌坯：将基料h放入已有圆形木板垫底的缸中，逐层加入白砂糖，腌制2d后，过滤得基料i；
[0125]
13、装坛：将基料i装入发酵坛中，加入无菌水，再以荷叶盖面层，荷叶上加食盐150g后封口保存4个月，得益生菌发酵腐乳。
[0126]
表6实施例2中各组别的益生菌接种情况及结果记录
[0127][0128][0129]
其中，组别7-11为两种益生菌共同接种的组别，菌株1和菌株2的重量比均为1：1。例如，接种步骤中益生菌的接种量为豆腐坯的重量百分比计的6％时，则菌株1和菌株2的接种量均为3％。各组别的实验进行3次重复，结果取平均值。
[0130]
益生菌发酵腐乳中辅酶a的含量用辅酶a的检测试剂盒来测量，其提取方法依据说明书进行，结果见表6。从表6可得，对于3株副干酪乳杆菌，采用副干酪smn-lbk制备腐乳时，副干酪乳杆菌smn-lbk组别中辅酶a含量最高，初步选定其为最佳的副干酪乳杆菌菌株。组别7-9的结果展示，副干酪乳杆菌smn-lbk分别与动物双歧杆菌乳亚种y6、长双歧杆菌亚种w68、发酵乳杆菌fm12复配时，副干酪乳杆菌smn-lbk和与动物双歧杆菌乳亚种y6具有协同作用。组别10-11展示，另外两株副干酪乳杆菌(副干酪乳杆菌k9、副干酪乳杆菌l9)与动物双歧杆菌乳亚种y6并没有出现协同效果，仅是简单叠加。因此，选定副干酪乳杆菌smn-lbk和与动物双歧杆菌乳亚种y6为本发明实施例的益生菌组合。
[0131]
实施例3
[0132]
采用实施例2的工艺方法，接种步骤中益生菌的总接种量为6％。筛选副干酪乳杆菌smn-lbk和与动物双歧杆菌乳亚种y6的合适重量比，具体如下表7所示。各组别的实验进行3次重复，结果取平均值。
[0133]
表7副干酪乳杆菌smn-lbk和与动物双歧杆菌乳亚种y6重量比
[0134][0135]
根据表6-7的结果可得，当副干酪乳杆菌smn-lbk和与动物双歧杆菌乳亚种y6重量比为(1～3)：1时，两者起到协同作用，能够大大增加发酵腐乳中辅酶a的含量，当两者的比例为1：1时，效果最佳。而当副干酪乳杆菌smn-lbk和与动物双歧杆菌乳亚种y6重量比超出(1～3)：1的范围时，例如两者比例为0.5：1，0.8：1，3.5：1和4.5：1时，副干酪乳杆菌smn-lbk和与动物双歧杆菌乳亚种y6之间的协同作用大大减弱。
[0136]
实施例4
[0137]
采用实施例2的工艺方法，接种步骤中，益生菌为重量比为1：1的副干酪乳杆菌smn-lbk和与动物双歧杆菌乳亚种y6。总接种量和结果具体如下表8所示。各组别的实验进行3次重复，结果取平均值。
[0138]
表8益生菌发酵制品辅酶a含量/mg
[0139] 组合20组合21组合22组合23组合24组合25接种量/％0.002.004.006.008.0010.00辅酶a含量/mg098226353287254
[0140]
从表8的结果可得，当接种量为6％时，发酵效果最好，辅酶a的含量最高。
[0141]
实施例5
[0142]
人群招募：招募30名志愿者，这些志愿者均同时具备乏力、免疫力低下等体征(至少有以下表现中的两种：睡眠不好、易疲劳；经常感冒且不易好转；食欲不振；肠胃不适；皮肤发痒；伤口难愈合)，年龄在22-60岁之间，随机分成6组，每组5人。
[0143]
试用样品1：安慰剂组，由50份低聚果糖混匀，即得。
[0144]
试用样品2：将10份副干酪乳酪杆菌smn-lbk和和40份低聚果糖混匀，即得。
[0145]
试用样品3：将10份动物双歧杆菌乳亚种y6和40份低聚果糖混匀，即得。
[0146]
试用样品4：将5份副干酪乳酪杆菌smn-lbk和5份动物双歧杆菌乳亚种y6混合均匀，再添加40份低聚果糖，混匀，即得。
[0147]
试用样品5：将5份副干酪乳酪杆菌smn-lbk和5份长双歧杆菌w68混合均匀，再添加40份低聚果糖，混匀，即得。
[0148]
试用样品6：将5份副干酪乳酪杆菌smn-lbk和5份发酵乳杆菌fm12混合均匀，再添
加40份低聚果糖，混匀，即得。
[0149]
试验方法：将上述制成的试用样品发放给各个组的志愿者，每个小组对应一个样品，服用频率为1份/次、2次/天，服用周期为1个月。试验周期中，志愿者日常观察记录身体改善情况，结果如表10所示，每个结果均为改组5个志愿者的平均分。
[0150]
表9各指标评估表/分
[0151]
明显降低有降低无明显变化有改善明显改善1-23-45-67-89-10
[0152]
表10各指标人群情况反馈表/分
[0153]
组合样品1样品2样品3样品4样品5样品6乏力565867免疫力低下475966
[0154]
由表10可得，志愿者在坚持服用含有副干酪乳杆菌smn-lbk的益生菌粉1个月后，均反馈乏力感有所减退，免疫力得到提升，如不容易感冒、过敏症状得到缓解等。其中，样品4为副干酪乳酪杆菌smn-lbk和动物双歧杆菌乳亚种y6的复合组，评分最高，志愿者反馈效果最好。
[0155]
本发明利用副干酪乳杆菌smn-lbk制成粉剂、片剂以及其他剂型均可。
[0156]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

技术特征：
1.一种益生菌在制备提高免疫力的产品中的应用，其特征在于，所述益生菌为保藏编号为cctcc no：m 2017429的副干酪乳杆菌smn-lbk。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高免疫力的产品的活性成分包括副干酪乳杆菌smn-lbk的活菌体和/或灭活型菌体。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高免疫力的产品包括食品、保健品、药品和营养补充剂。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高免疫力的产品为口服制剂，所述口服制剂的剂型包括口服液、滴剂、片剂、粉剂、胶囊剂或颗粒剂。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在所述提高免疫力的产品中，所述副干酪乳杆菌smn-lbk的含量为1.0
×
109～1.0
×
10
11
cfu/g。6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高免疫力的产品还包括保藏编号为cgmcc no.15026动物双歧杆菌乳亚种y6。7.一种提高免疫力的益生菌组合物，其特征在于，包括保藏编号为cctcc no：m 2017429的副干酪乳杆菌smn-lbk，以及，保藏编号为cgmcc no.15026动物双歧杆菌乳亚种y6。8.如权利要求7所述的提高免疫力的益生菌组合物，其特征在于，所述副干酪乳杆菌smn-lbk与所述动物双歧杆菌乳亚种y6的重量比为(1～3):1。9.一种提高免疫力的产品，其特征在于，包括保藏编号为cctcc no：m 2017429的副干酪乳杆菌smn-lbk；或者，包括保藏编号为cctcc no：m 2017429的副干酪乳杆菌smn-lbk，以及，保藏编号为cgmcc no.15026动物双歧杆菌乳亚种y6。10.如权利要求9所述的提高免疫力的产品，其特征在于，所述产品为大豆发酵制品，所述副干酪乳杆菌smn-lbk和所述动物双歧杆菌乳亚种y6可以提高大豆发酵制品中的辅酶a含量。

技术总结
本发明公开了副干酪乳杆菌SMN-LBK在制备提高免疫力产品中的应用。本发明所提供的副干酪乳杆菌SMN-LBK能够定殖于肠道，调节肠道菌群平衡，抑制致病菌生长繁殖，修复受损免疫屏障，调节免疫应答，促进辅酶A的生物合成，进而增强机体免疫力。本发明还提供了一种提高免疫力的益生菌组合物和产品，包括副干酪乳杆菌SMN-LBK和动物双歧杆菌乳亚种Y6，两者相互协同，共同促进机体免疫力的提升。共同促进机体免疫力的提升。共同促进机体免疫力的提升。


技术研发人员：李宝坤 陶纯长 金庭飞 樊哲新 黎旭 朱泽娜
受保护的技术使用者：广东益可维生物技术有限公司
技术研发日：2022.10.31
技术公布日：2023/7/21