一种产嘌呤霉素的白色链霉菌属新菌种及其应用

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种产嘌呤霉素的白色链霉菌属新菌种及其应用。


背景技术：

2.嘌呤霉素是一种可由白色链球菌发酵制得的氨基糖苷类抗生素，是一种蛋白质合成抑制剂，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌、各种动物和昆虫细胞，熔点175.5～177.0℃，旋光度-11(乙醇)，化学式为c
22h29
n7o5，在酸性溶液中分解成为6-二甲胺嘌呤，o-甲基-l-酪氨酸及3-氨基-3-去氧核糖。它的结构与氨基酰trna分子中腺苷相连结的氨基酸末端基因相似，因而它可作氨基酰trna的类似物，从而取代一些氨基酰trna进入核糖体的a位与正在延伸的多肽链结合，当延长中的肽转入此异常a位时，容易脱落，以肽基嘌呤霉素的形式从核糖核蛋白体上早期解离，终止肽链合成，从而抑制了蛋白质的合成。
3.嘌呤霉素的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99％的不表达pac基因的细胞。嘌呤霉素对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用，在细胞稳转株筛选中具有普遍应用，可用于筛选特定携带嘌呤霉素n-乙酰转移酶(pac)基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株，主要用作研究蛋白质合成的生物化学工具。有人试用于肿瘤治疗。
4.嘌呤霉素的传统制备方法包含发酵法以及化学合成法，化学合成法主要用3-叠氮-腺苷作为原料，6步化学催化制备嘌呤霉素，整体路线长，化学制备过程中需要用到多种有毒有害试剂(如：tmscl、吡啶、dcc等)，所以生产过程中安全系数低，环境兼容性低，再加上整体收率并不高，所以最终生产成本高；发酵法是通过白色链霉菌发酵生产，对环境更加友好，环保且条件温和，仍是制备嘌呤霉素的有效途径，但是现有产嘌呤霉素的白色链霉菌，其产率非常低，发酵产物中的嘌呤霉素含量通常都在1000mg/l左右，并且由于副产物多，所以纯化工艺复杂，生产成本高。因此如何实现以更高效安全的方法来生产嘌呤霉素，是目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种产嘌呤霉素的白色链霉菌属新菌种及其应用，该菌株由发明人团队于采集自陕西省岐山县凤鸣镇的山地土壤样品中分离纯化，并经大量筛选获得，保藏编号为cgmcc 25619，分类命名为链霉菌streptomyces sp，产嘌呤霉素的能力高达3000mg/l，并能同时产嘌呤霉素类似物puromycin e。
6.一方面，本发明提供了一种白色链霉菌属新菌种，其保藏编号为cgmcc 25619。
7.本发明所述的白色链霉菌属新菌种(streptomyces sp.hu182)，保藏编号为cgmcc25619，保藏时间为2022年8月31日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.进一步地，所述新菌种的16s rdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.在一些方式中，所述新菌种在不同培养基上有不同的培养特征，如在isp1培养基
中的菌落形态为褶皱不圆整不规则，菌落直径0.8mm，深橙黄色，产孢丰富；在isp2培养基中的菌落形态为凸起圆形有锯齿状白色边缘孢子，菌落直径1mm，深黄绿色，产孢丰富；在isp3培养基中的菌落形态为同心圆圆形边缘叶状较光滑表面干燥，菌落直径4mm，灰黄绿色，产孢丰富；在isp4培养基中的菌落形态为圆形，边缘规整表面不光滑，中间有白色凸起，菌落直径2mm，苍黄色，产孢不丰富；在察氏培养基中的菌落形态为圆形，有黄色色素不规则圆形，有放射状白色外环，内环米白色，菌落直径0.2mm，亮黄色，产孢丰富。
10.在一些方式中，所述新菌种能够利用葡萄糖、棉子糖、木糖、山梨醇、阿拉伯糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、半乳糖、肌醇、鼠李糖等碳源，能利用甘氨酸、天冬氨酸、酪氨酸等无机氮源。
11.在一些方式中，所述新菌种的生理生化特征为：明胶液化为阳性(+)，淀粉水解为阳性(+)，牛奶凝固为阳性(+)，酯酶吐温40为阳性(+)，七叶苷为阳性(+)，硝酸盐还原为阳性(+)，硫化氢产生为阳性(+)，酯酶吐温60为阳性(+)，纤维素利用为阴性(-)，过氧化氢酶为阳性(+)，脲酶为阳性(+)，酯酶吐温80为阳性(+)。
12.进一步地，所述新菌种在产嘌呤霉素的同时还会产嘌呤霉素类似物puromycin e，所述嘌呤霉素和嘌呤霉素类似物puromycin e的结构式分别如式(1)和式(2)所示：
[0013][0014]
本发明提供的新菌种能同时产嘌呤霉素puromycin和嘌呤霉素类似物puromycin e，所述嘌呤霉素类似物puromycin e在控制发酵条件的情况下，能直接转化为嘌呤霉素
puromycin。
[0015]
进一步地，所述新菌种产嘌呤霉素的能力达到3000mg/l。
[0016]
另一方面，本发明提供了一种发酵生产嘌呤霉素的方法，通过采用如上所述的白色链霉菌属新菌种(streptomyces sp.hu182)进行发酵获得。
[0017]
进一步地，所述方法为采用白色链霉菌属新菌种(streptomyces sp.hu182)在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基里，进行有氧发酵获得。
[0018]
进一步地，所述的可同化的碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、玉米淀粉、工业糖蜜、甘油、蔗糖、山梨醇、甘露醇、山梨醇、乳糖、麦芽糖浆、结晶麦芽糖之一或上述物质的组合，优选为葡萄糖、麦芽糊精、可溶性淀粉及它们的组合；其中所述的可同化的氮源选自酵母粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麦芽抽提物、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆干粉、麸质粉、尿素、铵盐之一或上述物质的组合，优选为棉籽饼粉、酵母粉、麦芽抽提物或它们的组合。
[0019]
在一些方式中，所述发酵培养基包括可溶性淀粉、麦芽糊精、棉籽饼粉、酵母抽提物、麦芽抽提物。
[0020]
在一些方式中，所述发酵培养基为可溶性淀粉2％；麦芽糊精2％；棉籽饼粉1％；酵母抽提物0.5％；麦芽抽提物0.5％；mgso4
·
7h2o 0.2％；nacl 0.2％；caco3 0.2％。
[0021]
在一些方式中，所述发酵培养的温度为20～35℃，优选25～30℃，ph为6.0～8.3，优选7.0～7.8，发酵培养时间为100～240小时，优先160～190小时。优选的，所示发酵方式为液体深层发酵。
[0022]
另一方面，本发明提供了如上所述的白色链霉菌属新菌种用于制备嘌呤霉素的用途。
[0023]
进一步地，所述嘌呤霉素的产能达到3000mg/l。
[0024]
再一方面，本发明提供了如上所述的白色链霉菌属新菌种用于制备嘌呤霉素素类似物puromycin e的用途，所述嘌呤霉素类似物puromycin e的结构式如式(2)所示：
[0025][0026]
所述嘌呤霉素类似物puromycin e经提取纯化后，可通过化学合成方法用于生产嘌呤霉素。另外，通过发酵条件的转变，能使白色链霉菌新菌种发酵产物中的嘌呤霉素类似物puromycin e向嘌呤霉素转变，也就是说通过优化发酵培养基、温度、ph、溶氧等等发酵条件，能使白色链霉菌发酵产嘌呤霉素浓度更高。
[0027]
本发明提供的新菌种与已知的嘌呤霉素产生菌完全不同，有其特有的生理生化特征，生产嘌呤霉素的能力大幅提升，副产物少，且能同时产嘌呤霉素类似物，嘌呤霉素生产成本低，能实现真正高效安全地生产嘌呤霉素。
[0028]
本发明提供了的白色链霉菌新菌种，有益效果为：
[0029]
1、首次筛选得到能够高产嘌呤霉素的白色链霉菌新菌种；
[0030]
2、嘌呤霉素的产能达到3000mg/l；
[0031]
3、能同时制得嘌呤霉素和嘌呤霉素类似物puromycin e；
[0032]
4、补充了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。
附图说明
[0033]
图1为实施例2中菌株hu182分别在isp1、isp2、isp3、isp4、isp5、isp6、isp7、察氏培养基、营养琼脂、bennet培养基10种培养基上的菌落图片；
[0034]
图2为实施例5中菌株hu182的发酵液的hplc图谱；
[0035]
图3为实施例6中puro-1经ms分析的结构式、分子式；
[0036]
图4为实施例6中puro-1经核磁共振波谱法分析的氢谱1h-nmr；
[0037]
图5为实施例6中puro-1经核磁共振波谱法分析的氢谱1h-nmr的放大图；
[0038]
图6为实施例6中puro-1经核磁共振波谱法分析的氢谱1h-nmr的局部放大图；
[0039]
图7为实施例6中puro-1经核磁共振波谱法分析的碳谱13c-nmr；
[0040]
图8为实施例6中puro-1经核磁共振波谱法分析的dept135谱；
[0041]
图9为实施例6中puro-1经核磁共振波谱法分析的关联性磁振频谱cosy谱；
[0042]
图10为实施例6中puro-1经核磁共振波谱法分析的异核多量子关系hmqc谱；
[0043]
图11为实施例6中puro-1经核磁共振波谱法分析的多键碳氢关系hmbc谱；
[0044]
图12为实施例6中puro-6经ms分析的结构式、分子式；
[0045]
图13为实施例6中puro-6经核磁共振波谱法分析的氢谱1h-nmr；
[0046]
图14为实施例6中puro-6经核磁共振波谱法分析的氢谱1h-nmr放大图；
[0047]
图15为实施例6中puro-6经核磁共振波谱法分析的碳谱13c-nmr；
[0048]
图16为实施例6中puro-6经核磁共振波谱法分析的dept135谱；
[0049]
图17为实施例6中puro-6经核磁共振波谱法分析的关联性磁振频谱cosy谱；
[0050]
图18为实施例6中puro-6经核磁共振波谱法分析的异核多量子关系hmqc谱；
[0051]
图19为实施例6中puro-6经核磁共振波谱法分析的多键碳氢关系hmbc谱。
具体实施方式
[0052]
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
[0053]
本发明提供的可生产嘌呤霉素化合物的白色链霉菌新菌种，是由发明人团队于采集自陕西省岐山县凤鸣镇的山地土壤样品中分离获得，内部标记为hu182，于2022年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmcc 25619，分类命名为链霉菌streptomyces sp hu182。
[0054]
实施例1菌株分离、筛选
[0055]
在陕西省岐山县凤鸣镇的一处山地划定区域内进行交叉采样，随机选取6个采样点，每个点取湿土样50g，与干燥阴凉处进行自然风干。然后，取风干后的土壤样品取10g于研钵中充分研磨，加入100ml(250ml三角摇瓶，含10颗玻璃珠)的无菌水中，再加入30μl的苯酚，200rpm，28℃振荡1小时得到土壤悬液。土壤悬液依次10倍梯度稀释后，取10-2
、10-3
、10-4
、10-5
浓度的稀释液各150μl，涂布于高氏一号培养基(含有萘啶酮酸25mg/l)，28℃培养箱，4-5天培养后挑选放线菌单菌落。挑选的单菌落于isp2培养基上，用划线法纯化获得纯放线菌单菌落。
[0056]
共获得1500株初筛菌种，然后进行点种操作，并将点种后的平板置于28℃恒温培养7-9天，待孢子成熟后，在无菌条件下用接种铲将上述菌株孢子连带基内菌丝刮下，分别接种于含有25ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于28℃下振荡培养48小时，得到种子液。然后将种子液以10％接种量分别接种至含30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，于28℃，250rpm，振荡培养8天获得发酵液。
[0057]
然后发酵液中加入3倍体积的乙醇，超声30分钟，取样用hplc检测嘌呤霉素含量，用嘌呤霉素标准品溶液做对照，挑选具有嘌呤霉素特征吸收峰的菌株，再用hplc-ms(液相质谱仪)验证特征吸收峰的分子量，与嘌呤霉素分子量吻合即证明该菌株可产生嘌呤霉素。经检测验证，菌株hu182(streptomyces sp.hu182)可高产嘌呤霉素。
[0058]
嘌呤霉素可通过以下条件进行hplc检测：
[0059]
色谱柱为c18柱，5μm，4.6
×
250mm，柱温25℃；
[0060]
流动相a：含5mm的乙酸铵的水；
[0061]
流动相b：100％乙腈；
[0062]
梯度程序：0～30min：5％～100％(v/v)b相；30～33min：100％ b相；33～34min：100％～5％(v/v)b相；34～40min：5％ b相；
[0063]
流速：1ml/min；
[0064]
检测波长：254nm；
[0065]
进样量：10～20μl。
[0066]
实施例2白色链霉菌属新菌种的形态学和培养学特征研究
[0067]
本实施例对实施例1获得的高产嘌呤霉素的菌株hu182(streptomyces sp.hu182)进行形态学和培养学特征研究，参照《常见细菌系统鉴定手册》、《分子克隆实验指南》及《中国药典》等书中的有关内容进行实验。采用划线的方法分别接种至isp1、isp2、isp3、isp4、isp5、isp6、isp7、察氏培养基、营养琼脂、bennett培养基10种培养基，28℃培养7天，观察菌落的形态、颜色等情况，其中菌落在isp1、isp2、isp3、isp4、isp5、isp6、isp7、查氏培养基、营养琼脂、bennett培养基10种培养基上的培养照片如图1所示，包括为菌落正面照片和菌落背面照片；菌落在10种培养基上的培养特征见表1。
[0068]
表1、菌株hu182在10种培养基上的培养特征
[0069][0070]
实施例3白色链霉菌属新菌种的生理生化特征研究
[0071]
本实施例对实施例1获得的高产嘌呤霉素的菌株hu182(streptomyces sp.hu182)进行生理生化特征研究。
[0072]
1、碳源利用试验和无机氮源利用试验：
[0073]
碳源利用试验：配制碳源基础培养基((nh4)2so
4 2.64g,kh2po
4 2.38g,k2hpo
4 5.65g,mgso4·
7h2o 1g，cuso4·
5h2o 0.0064g，feso4·
7h2o 0.0011g，mncl2·
4h2o 0.0079g,znso4·
7h2o 0.0015g，蒸馏水1000ml,ph6.5)后，取11种糖每种各0.5g加入100ml母液和1.8g琼脂放入250ml锥形瓶中，并设置对照培养基(ck)共12种培养基，培养温度为28℃，培养时间为7天，培养结果如表2所示。
[0074]
无机氮源利用试验：配制氮源基础培养基(d-葡萄糖1g，mgso4·
7h2o 0.05g，nacl 0.05g，feso4·
7h2o 0.001g，k2hpo
4 0.01g，蒸馏水100ml ph 7.2)后，取甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺三种氨基酸各0.5g各加入100ml母液和1.8g琼脂放入250ml锥形瓶中，并设置对照培养基(不加任何氮源)共4种培养基，培养温度为28℃，培养时间为7天，培养结果如表2所示。
[0075]
表2、菌株hu182的碳源和氮源的利用情况
[0076]
碳源生长情况无机氮源生长情况葡萄糖4甘氨酸3棉子糖3天冬氨酸2木糖4酪氨酸3山梨醇3ck4阿拉伯糖3
ꢀꢀ
麦芽糖4
ꢀꢀ
果糖4
ꢀꢀ
蔗糖3
ꢀꢀ
半乳糖4
ꢀꢀ
肌醇3
ꢀꢀ
鼠李糖3
ꢀꢀ
ck3
ꢀꢀ
[0077]
*注：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子。
[0078]
由表2可见，菌株hu182能够利用葡萄糖、棉子糖、木糖、山梨醇、阿拉伯糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、半乳糖、肌醇、鼠李糖等碳源，其中优选碳源为葡萄糖、木糖、麦芽糖、果糖、半乳糖；能利用甘氨酸、天冬氨酸、酪氨酸等无机氮源。
[0079]
2、主要生理生化特征研究
[0080]
生理生化特征研究，包括明胶液化实验、淀粉水解实验、牛奶凝固实验、酯酶吐温40实验、七叶苷实验、硝酸盐还原实验、硫化氢产生实验、酯酶吐温60实验、纤维素利用实验、过氧化氢酶实验、脲酶实验、酯酶吐温80实验，采用《常见细菌系统鉴定手册》提供的方法进行。结果如表3所示。
[0081]
表3、菌株hu182主要的生理生化特征
[0082][0083][0084]
*注：+，阳性；-，阴性。
[0085]
由表3可见，新菌种hu182的生理生化特征为：明胶液化为阳性(+)，淀粉水解为阳性(+)，牛奶凝固为阳性(+)，酯酶吐温40为阳性(+)，七叶苷为阳性(+)，硝酸盐还原为阳性(+)，硫化氢产生为阳性(+)，酯酶吐温60为阳性(+)，纤维素利用为阴性(-)，过氧化氢酶为阳性(+)，脲酶为阳性(+)，酯酶吐温80为阳性(+)。
[0086]
3、ph试验
[0087]
采用isp3作为基础培养基，调节培养基ph分别如表4所示，培养温度为28℃，培养时间为7～10天，考察适于菌株hu182生长的ph条件，结果如表4所示。
[0088]
表4、菌株hu182生长的ph试验
[0089]
ph4.05.06.07.08.09.010.011.012.0生长情况001111100
[0090]
*注：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子。
[0091]
由表4可见，菌株hu182适合生长的ph范围为6.0～10.0，在其他ph情况下难以生长。
[0092]
4、温度试验
[0093]
采用isp2培养基作为基础培养基，分别在如表5所示的培养温度进行培养，培养时
间为7～10天，考察菌株hu182在不同温度下的生长情况，结果如表5所示。
[0094]
表5、菌株hu182生长的温度试验
[0095]
温度(℃)418252834生长情况04434
[0096]
*注：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子。
[0097]
由表5可见，菌株hu182适合在18～34℃范围内培养，其中最优选的培养温度为28℃，其原因为：28℃温度下菌株hu182生长良好，有大量孢子，而且在该温度下，发酵液产生的嘌呤霉素浓度最高。
[0098]
5、nacl耐受实验
[0099]
采用isp2培养基作为基础培养基，分别添加如表6所示浓度的nacl，培养温度为28℃，培养时间为8天，考察菌株hu182对不同浓度nacl的耐受性，结果如表6所示。
[0100]
表6、菌株hu182对nacl的耐受性
[0101]
nacl浓度％01234567生长情况11111000
[0102]
*注：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子；+，阳性；-，阴性。
[0103]
由表6可以看出，菌株hu182能够耐受4％浓度以下的nacl。
[0104]
实施例4白色链霉菌属新菌种的16srdna序列分析及菌种鉴定
[0105]
收集待测菌株的新鲜菌体，采用溶液菌酶法改进的pitcher法(letters in applied microbiology，1989,8:151-156)提取总dna模板，采用通用引物(27f和1495r)进行16s rrna基因扩增，pcr产物经检测纯化后，直接进行序列测定，测序由上海生工生物工程技术有限公司进行。所测的16s rdna序列经校对后与genbank数据库中相关种、属的序列进行同源序列blast比较，以确定该菌株的分类地位。
[0106]
菌株hu182(cgmcc 25619)的16s rdna序列与genbank中相关序列进行blast比较，发现其和链霉菌(streptomyces sp)具有很高的同源性，最高的达99％以上，同时对菌株hu182(cgmcc 25619)进行表观特征实验，发现该菌株和链霉菌(streptomyces sp)分类相关参数非常接近，故将菌株hu182(cgmcc 25619)鉴定为链霉菌(streptomyces sp)菌株。
[0107]
实施例5摇瓶发酵制备嘌呤霉素
[0108]
本实施例采用实施例1提供的菌株hu182进行发酵制备嘌呤霉素，
[0109]
(1)斜面培养：采用酵母抽提物4.0g，麦芽抽提物10.0g，葡萄糖4.0g，cocl2·
6h2o0.005g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph值7.0-7.2，于121℃下灭菌20min，接菌后在28℃下培养6-10天。
[0110]
(2)种子培养：种子培养基组成：葡萄糖4.0g，麦芽抽提物10.0g，酵母抽提物4.0g，caco
3 2.0g，蒸馏水1000ml，ph值7.0-7.2，用250ml的三角瓶每瓶分装30ml，然后用10～15ml无菌水将斜面的链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为1
×
106～1
×
109个/ml。每瓶加1ml孢子悬浮液，置于摇床上，转速200-250r/min，28℃培养48h。
[0111]
(3)发酵：发酵培养基组成：可溶性淀粉3％，麦芽糊精3％，酵母粉0.5％,麦芽抽提物3％,nacl 0.3％，caco
3 0.2％,ph值7.0-7.2，蒸馏水配置，于121℃下灭菌20min。按5％
接种量，将种子液接入至1l发酵罐中(250l装量)，28℃条件下培养，转速为150-250r/min，发酵培养8天，用hplc检测，菌株hu182的发酵液的hplc图谱见图2，嘌呤霉素的发酵单位为2696mg/l。
[0112]
实施例6罐发酵制备嘌呤霉素
[0113]
本实施例采用实施例1提供的菌株hu182进行发酵制备嘌呤霉素，
[0114]
(1)斜面培养：采用酵母抽提物4.0g，麦芽抽提物10.0g，葡萄糖4.0g，cocl2·
6h2o0.005g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph值7.0-7.2，于121℃下灭菌20min，接菌后在28℃下培养6-10天。
[0115]
(2)摇瓶种子制备：种子培养基组成：葡萄糖4.0g，麦芽抽提物10.0g，酵母抽提物4.0g，caco
3 2.0g，蒸馏水1000ml，ph值7.0-7.2，用1000ml的三角瓶每瓶分装200ml，然后用10～15ml无菌水将斜面的链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为1
×
106～1
×
109个/ml。每瓶加2～4ml孢子悬浮液，置于摇床上，转速200-250r/min，28℃培养48h。
[0116]
(3)种子罐种子液的制备：种子培养基组成同实施例5，用50l发酵罐装量30l，于121℃下灭菌25min。将种子罐制备的种子液采用压差法接种至50l发酵罐，接种量2～3l，28℃条件下发酵培养，转速为150-350r/min，通气量0.5～1vvm，罐压0.05mpa培养2天，此时种子液ph6.2～7.2，菌丝浓度15～30％。
[0117]
(4)50l罐发酵：发酵培养基组成同实施例5，用15l种子罐装量8l，于121℃下灭菌20min。将400ml种子液接入至种子罐种，28℃条件下培养，转速为150-250r/min，通气量0.5～1vvm，罐压0.05mpa，控制溶氧不低于15％，发酵培养8天，放罐，测得嘌呤霉素的发酵单位为3135mg/l。
[0118]
实施例7发酵产物的分离纯化和结构鉴定
[0119]
本实施例针对实施例6发酵罐7天培养后的发酵产物进行分离纯化和结构鉴定。
[0120]
1、化合物纯化分离过程
[0121]
30l罐发酵液离心，分为菌丝体和上清液，菌丝体用5升乙醇浸泡两次，上清液上hp-20大孔吸附树脂，用95％乙醇洗脱，乙醇浸提液和洗脱液浓缩后的浸膏硅胶拌样，放于通风橱内静置，待硅胶粉干燥之后装柱，样品容积300ml，装柱体积为0.75l，柱子规格采用二氯甲烷/甲醇为洗脱相进行梯度洗脱(100：0，98：2，95：5，90:10，85:15，70:30)，每个梯度1l，用容积为250ml的锥形瓶收集，收集后的部分进行薄层色谱层析，合并浓缩得到4个部分i(2-8)，ⅱ(9-16)，ⅲ(17-25)，ⅳ(26-32)。
[0122]ⅱ(9-16)经过凝胶(lh-20)层析柱采用二氯甲烷/甲醇(1：1，v/v)体系进行洗脱，洗脱体积为400ml，用10ml的试管进行收集，随后根据薄层色谱层析(tlc)的检测结果，得到以下馏分：ii-1(13-23)，ii-2(24-28)，ii-3(29-40)，将ii-2(24-28)进行ods反相柱采用甲醇为洗脱液梯度洗脱(20％甲醇，30％甲醇，40％甲醇，50％甲醇，55％甲醇，70％甲醇，80％甲醇，90％甲醇)，每个梯度70ml,用10ml的试管进行收集，随后根据薄层色谱层析(tlc)的检测结果，得到以下馏分
ⅱ‑
2-1(37-52),
ⅱ‑
2-2(53-60)，
ⅱ‑
2-3(61-最后)，将
ⅱ‑
2-1(37-52)，
ⅱ‑
2-2(53-60)，
ⅱ‑
2-3(61-最后)分别进行大制备(15％-25％乙腈：85％-75％醋酸铵走梯度)，用10ml的试管进行收集，根据薄层色谱层析(tlc)的检测结果，得到
ⅱ‑
2-5-1(20-26)，
ⅱ‑
2-6-1(14-26)，
ⅱ‑
2-7-1(18-22)，将
ⅱ‑
2-5-1(20-26)，
ⅱ‑
2-6-1(14-26)，
ⅱ‑
2-7-1(18-22)合并再过一次大制备(15％-25％乙腈：85％-75％纯水)进
行除盐，用10ml的试管进行收集，根据薄层色谱层析(tlc)的检测结果，得到一个化合物puro-1(11-33，1.2克)。
[0123]ⅰ(2-8)先经过凝胶(lh-20)层析柱采用二氯甲烷/甲醇(1：1，v/v)体系进行洗脱，洗脱体积为400ml，用10ml的试管进行收集，随后根据薄层色谱层析(tlc)的检测结果，得到以下馏分：
ⅰ‑
1(7-36)，进行ods反相柱采用甲醇为洗脱液梯度洗脱(50％甲醇，60％甲醇，70％甲醇，80甲醇，90％甲醇，100％甲醇)，每个梯度200ml，用10ml的试管进行收集，随后根据薄层色谱层析(tlc)的检测结果，得到以下馏分：
ⅰ‑
1-1(5-15)，
ⅰ‑
1-2(17-30)。将
ⅰ‑
1-1(5-15)进行大制备(乙腈：纯水＝12：88)，用10ml的试管进行收集，根据薄层色谱层析(tlc)的检测结果，得到
ⅰ‑
1-1-1(5-10)，再进行大制备(5％-15％乙腈：85％-75％纯水)，用10ml的试管进行收集，根据薄层色谱层析(tlc)的检测结果，得到一个化合物puro-6(36-38，40mg)。
[0124]
2、结构鉴定
[0125]
通过ms质谱分析和核磁共振波谱法分析对化合物puro-1和puro-6进行结构鉴定。
[0126]
经ms分析，确定puro-1的分子量为471.2230，其结构式、分子式如图3所示，经核磁共振波谱法分析，氢谱1h-nmr如图4、5、6所示，碳谱13c-nmr如图7所示，dept135谱如图8所示，关联性磁振频谱cosy谱如图9所示，异核多量子关系hmqc谱如图10所示，多键碳氢关系hmbc谱如图11所示，确定puro-1为嘌呤霉素。
[0127]
经ms分析，确定puro-6的分子量为308.1233，其结构式、分子式如图12所示，经核磁共振波谱法分析，氢谱1h-nmr如图13、14所示，碳谱13c-nmr如图15所示，dept135谱如图16所示，关联性磁振频谱1h-1h cosy谱如图17所示，异核多量子关系hmqc谱如图18所示，多键碳氢关系hmbc谱如图19所示，确定puro-6为嘌呤霉素类似物puromycin e。
[0128]
实施例8白色链霉菌属新菌种产嘌呤霉素能力的鉴定
[0129]
按照实施例5提供的种子培养基和发酵培养基进行发酵，28℃摇床培养8天，考察现有的嘌呤霉素产生菌和本发明提供的新菌株hu182产嘌呤霉素的能力，检测结果如表9所示。
[0130]
表9、不同菌株产嘌呤霉素的能力对比
[0131][0132]
由表9可以看出，本发明提供的新菌株hu182，其产嘌呤霉素的能力远远超过现有菌株的水平，达到现有的嘌呤霉素产生菌的3倍左右，而且还能同时产嘌呤霉素类似物，效价达到现有的嘌呤霉素产生菌的4倍以上，且副产物含量少，成本更低。
[0133]
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
[0134]
序列表
[0135]
seq id no.1
[0136]
streptomyces sp.hu182的16s rdna：
[0137]
gtggcggctctaccatgcaagtcgacgatgaagcccttcggggtggattagtggcgaacgggtga
[0138]
gtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggat
[0139]
aacacctccactctcctgggtggaggttaaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctat
[0140]
cagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgacc
[0141]
ggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcac
[0142]
aatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctct
[0143]
ttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccag
[0144]
cagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggc
[0145]
ggcttgtcacgtcgggtgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggctagct
[0146]
agagtgtggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaac
[0147]
accggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcga
[0148]
acaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggaactaggtgttggcgacattccac
[0149]
gtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaac
[0150]
tcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcga
[0151]
agaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaagcatcagagatggtgccccccttgtggtcggt
[0152]
gtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgag
[0153]
cgcaacccttgttctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacagaagaccgccg
[0154]
gggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcac
[0155]
acgtgctacaatggcaggtacaatgagctgcgataccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagcct
[0156]
gtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcgcagatc
[0157]
agcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggt
[0158]
aacacccgaagccggtggcccaaccccttgtgggagggagcgtcgaaggtgacgtcg

技术特征：
1.一种白色链霉菌属新菌种，其保藏编号为cgmcc 25619。2.如权利要求1所述的白色链霉菌属新菌种，其特征在于，所述新菌种的16s rdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.如权利要求2所述的白色链霉菌属新菌种，其特征在于，所述新菌种在产嘌呤霉素的同时还会产嘌呤霉素类似物puromycin e，所述嘌呤霉素和嘌呤霉素类似物puromycin e的结构式分别如式(1)和式(2)所示：4.如权利要求3所述的白色链霉菌属新菌种，其特征在于，产嘌呤霉素的能力达到3000mg/l。5.一种发酵生产嘌呤霉素的方法，其特征在于，通过采用如权利要求1～4任一项所述的白色链霉菌属新菌种进行发酵获得。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源和/或氮源；所述碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、玉米淀粉、工业糖蜜、甘油、蔗糖、山梨醇、甘露醇、山梨醇、乳糖、麦芽糖浆、结晶麦芽糖中的任意一种或多种；所述氮源选自酵母粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麦芽抽提物、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆干粉、麸质粉、尿素、铵盐中的任意一种或多种。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为20～35℃，ph6.0～8.3，时
间为100～240小时。8.如权利要求1～4任一项所述的白色链霉菌属新菌种用于制备嘌呤霉素的用途。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述嘌呤霉素的产能达到3000mg/l。10.如权利要求1～4任一项所述的白色链霉菌属新菌种用于制备嘌呤霉素素类似物puromycin e的用途，所述嘌呤霉素类似物puromycin e的结构式如式(2)所示：

技术总结
本发明提供了一种产嘌呤霉素的白色链霉菌属新菌种及其应用，保藏编号为CGMCC25619，分类命名为链霉菌Streptomyces sp，嘌呤霉素的产能高达3000mg/L，并能同时产嘌呤霉素类似物Puromycin E，补充了新的宝贵的菌种资源，显示出很高的应用价值。示出很高的应用价值。示出很高的应用价值。


技术研发人员：段文凯 郑玲辉 齐欢 张辉 王继栋 朱海东 童国通 刘雅婷
受保护的技术使用者：杭州职业技术学院
技术研发日：2022.10.26
技术公布日：2023/7/21