一种量子点标记的丙酸睾酮直接竞争荧光免疫检测方法

1.本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种量子点标记的丙酸睾酮直接竞争荧光免疫检测方法。


背景技术：

2.丙酸睾酮是天然雄激素睾酮酯化衍生物，属于蛋白同化激素药物，我国农业部824号公告将丙酸睾酮列为禁用药。蛋白同化激素包括天然性激素睾酮及其衍生的一系列甾体化合物，也称为合成代谢类固醇激素，不仅拥有睾酮的性激素功能，而且可以提高蛋白同化效率。同化激素滥用现象主要体现在运动员的非法摄入以及养殖户的非法添加，过量摄入蛋白同化激素药物会导致动物生理功能紊乱，甚至诱发不可逆的病变。
3.目前，同化激素残留的主要检测方法是lc-ms/ms、gc-ms和sers等理化分析方法。理化分析的优点在于精密度和灵敏度高，可以给出准确的定性定量结果，但是依赖高精尖的仪器设备，成本高昂，且操作复杂，需要在专业环境下才能进行，给检测带来很大局限性。
4.由于免疫学检测经济实惠、操作简单、可以快速诊断的特点，在违禁物检测中占据着重要地位。例如，授权公告号为cn106443021b的中国专利公开了一种检测蛋白同化激素的量子点标记免疫层析试纸条及其制备方法，采用制备抗原、活化酯法的方式检测被检物抗体-量子点标记物，从而实现对5中蛋白同化激素的快速检测。另外，现有技术中还报道了采用免疫学检测方法对睾酮、19-去甲基睾酮、甲基睾酮等结构比较稳定的蛋白同化激素进行检测，但是，对于丙酸睾酮的残留检测，报道较少。
5.因此，急需一种能够实现丙酸睾酮微量检测的方法。


技术实现要素：

6.本发明通过制备单克隆抗体、合成免疫荧光探针，构建一种量子点标记的丙酸睾酮直接竞争荧光免疫检测体系，用于对丙酸睾酮进行检测。
7.本发明还建立可以定量检测丙酸睾酮残留的直接竞争荧光免疫检测方法，同时也为丙酸睾酮的微量检测提供快速可行的检测工具。
8.为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
9.一种抗丙酸睾酮单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示，所述轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示。
10.具体的，所述抗丙酸睾酮tp单克隆抗体由灵敏度和稳定性较好的杂交瘤细胞株3f9分泌。
11.进一步的，本发明还提供了编码所述单克隆抗体的基因，具体的，编码所述单克隆抗体重链可变区基因序列如seq id no.1所示，编码所述单克隆抗体轻链可变区基因序列如seq id no.3所示。
12.基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种量子点标记的免疫荧光探针，所述免疫荧光探针是通过将cdse/zns量子点与所述抗丙酸睾酮单克隆抗体进行偶联制得。
13.具体的，所述免疫荧光探针在制备时量子点与单克隆抗体的质量比为1:(5-10)，进一步优选为1:5或1:10。
14.基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种检测丙酸睾酮的荧光免疫试剂盒，所述试剂盒包括：
15.(a)包被滴定板：包被有丙酸睾酮包被抗原的滴定板；(b)抗丙酸睾酮单克隆抗体-量子点免疫荧光探针；(c)丙酸睾酮标准品；其中，所述丙酸睾酮包被抗原的最佳包被浓度为2μg/ml。
16.基于一个总的发明构思，本发明还提供了所述量子点标记的免疫荧光探针在丙酸睾酮定量检测中的应用。
17.基于一个总的发明构思，本发明还提供了基于所述免疫荧光探针的丙酸睾酮直接竞争荧光免疫检测方法，包括如下步骤：
18.(1)免疫原的合成：分别采用肟化法和碳二亚胺法合成丙酸睾酮(testosterone propionate，tp)免疫抗原tp-bsa和丙酸睾酮包被抗原tp-ova；
19.(2)单克隆抗体的制备：以丙酸睾酮免疫抗原tp-bsa作为免疫原，免疫6-8周龄的小鼠，并用分别采用间接elisa方法和icelisa方法测定免疫小鼠血清效价和免疫小鼠的多抗血清的敏感性；
20.选取敏感性最好的免疫小鼠，进行超强免疫，超强免疫后3-5天，采用免疫小鼠脾细胞进行细胞融合，对细胞融合结果进行筛选，通过亚克隆制备阳性杂交瘤细胞株并制备高纯度抗tp单克隆抗体；
21.(3)免疫荧光探针的合成：选用碳二亚胺法，将cdse/zns量子点与步骤(2)制备的抗tp单克隆抗体进行偶联，得到量子点标记的anti-tp-mab-qds免疫荧光探针；将制备的anti-tp-mab-qds荧光探针进行稀释，得到anti-tp-mab-qds荧光探针稀释液；
22.(4)使用滴定板对丙酸睾酮包被原tp-ova进行包被，得到包被在滴定板中的丙酸睾酮完全抗原；制备不同浓度的tp标准溶液；
23.(5)将anti-tp-mab-qds荧光探针稀释液和不同浓度的tp标准溶液加入到包被有丙酸睾酮包被抗原tp-ova的滴定板中，通过与包被在滴定板中的tp-ova竞争性结合，形成抗原-抗体发光免疫复合物；
24.(6)检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，以tp浓度梯度标准溶液中tp的浓度对数值为横坐标，所获得的荧光强度比值为纵坐标，绘制得到标准曲线；
25.(7)将所述tp浓度梯度标准溶液替换为待测样品溶液，并重复步骤(5)和步骤(6)，获得待测样品溶液的荧光强度值，通过与标准曲线进行对比，得出待测样品中tp的浓度。
26.具体的，步骤(2)中，第一次免疫时，将免疫原与弗氏完全佐剂混合乳化；后续的加强免疫时，将免疫原与弗氏不完全佐剂混合乳化。
27.具体的，步骤(3)中，将制备的anti-tp-mab-qds荧光探针按照1:400比例稀释，得到anti-tp-mab-qds荧光探针稀释液。
28.具体的，步骤(3)中，免疫荧光探针在制备时量子点与单克隆抗体的质量比为1:(5-10)。
29.具体的，步骤(4)中，tp浓度梯度标准溶液的浓度分别为20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml。
30.具体的，步骤(4)中，滴定板包被的丙酸睾酮包被抗原tp-ova，通过如下步骤制得：使用cbs碳酸盐缓冲液将tp-ova稀释至终浓度为2μg/ml，以100μl/孔的添加量加到滴定板中，于37℃包被3h，抗原包被完成后，用含0.5％吐温的磷酸缓冲液洗涤三次。
31.具体的，检测所述抗原-抗体发光复合物荧光强度时，在发射波长450nm，激发波长610nm的条件下进行测定。
32.与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：
33.1、本发明所设计、构建的量子点标记的丙酸睾酮直接竞争荧光免疫检测体系能够实现丙酸睾酮的定量、高灵敏度检测，具有较宽的检测范围和较低的检测限，可应用于丙酸睾酮残留的快速检测。
34.2、本发明所述量子点标记的直接竞争荧光免疫检测丙酸睾酮的方法操作简单，不需添加显色物质就能检测待测样品中丙酸睾酮残留含量，即通过抗原-抗体免疫复合物的荧光强度，直接检测待测样品中丙酸睾酮的浓度值，无论操作还是反应只需一步就可以完成，简单方便，并且具有较好的准确性。
附图说明
35.图1为实施例1中tp完全抗原tp-ova的鉴定图；其中，图1a为紫外扫描光谱鉴定结果；图1b为sds-page鉴定结果；
36.图2为实施例2中小鼠血清效价及敏感性的测定结果；其中，图2a为采用elisa测定多抗血清效价，图2a中nc为空白对照；图2b为采用icelisa测定多抗血清敏感性；
37.图3为实施例2中三次冻融后四株抗丙酸睾酮杂交瘤细胞上清的ic
50
值；
38.图4为实施例2中抗tp单克隆抗体的sds-page鉴定结果；图中，line m为标准分子量marker；line l为纯化前腹水；line 2为纯化后anti-tp-mab；
39.图5为实施例3中免疫荧光探针anti-tp-mab-qds的鉴定结果；其中，图5a为荧光光谱鉴定结果；图5b为琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；图5c为sds-page鉴定结果；图5d为免疫层析鉴定结果；其中line 1为anti-tp-mab-qds；line 2为orange-red qds；
40.图6为本发明荧光免疫分析方法测定tp标准曲线；其中，图6a为间接elisa法绘制的tp标准曲线；图6b为dc-flisa方法绘制的tp标准曲线；
41.图7为实施例5中荧光免疫分析方法的流程示意图。
具体实施方式
42.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
43.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
44.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
45.以下实施例中使用的碳酸盐(cbs)缓冲液为：0.05mol/l，ph 9.6。以下实施例中使用的洗涤缓冲液pbst为：pbs(0.01mol/l，ph 7.4)+0.05％tween-20。
46.以下实施例中elisa测定时，使用tmb试剂进行显色反应，tmb显色试剂包括a液和b液，其中，a液为：将0.5g过氧化脲加入1000ml 0.1mol/l ph5.0醋酸钠/柠檬酸缓冲液(取约150ml 0.1mol的柠檬酸加入到0.1mol 850ml醋酸钠中)中溶解，再加入非那西酊溶液(0.08g预先加热溶于15ml ddw中)混匀，4℃保存；
47.b液为：取tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)1.27g溶于500ml甲醇中加热溶解，再与500ml甘油混合，4℃保存。
48.实施例1完全抗原的合成
49.采用肟化反应改造c-3羰基，引入一个羧基(tp-cmo)，通过形成酰胺键与大分子蛋白交联，采用混合酸酐法合成免疫原，碳二亚胺法合成包被原，所使用的丙酸睾酮(tp)为分析纯级别，纯度为99.8％；具体步骤如下：
50.(1)丙酸睾酮肟化反应：取10mg丙酸睾酮(tp)溶于1ml无水吡啶，加入7.4mg羧甲氧基胺半盐酸盐(cmo)室温下反应24小时，旋干；用1ml去离子水复溶，之后用3ml乙酸乙酯分3次进行萃取，弃去水相，氮气吹干，残留物即为丙酸睾酮-羧甲基肟(tp-cmo)；
51.(2)混合酸酐法合成免疫原(tp-bsa)：用1ml dmf溶解氮吹步骤(1)得到的残留物tp-cmo，向其中滴加7μl三乙胺，冷却至4℃，再滴加30μl氯甲酸异丁酯，于4℃反应三十分钟，得到a液；称取20mg bsa，并用3ml pbs溶液(含有20％dmf)进行溶解，得到b液；将a液逐滴滴加至b液中，并混匀，于4℃过夜反应，用去离子水透析一天，再用1
×
pbs缓冲液透析三天，透析完成后，离心收集上清即得到免疫抗原tp-cmo-ma-bsa(以下简称为tp-bsa)，分装后保存于-20℃；
52.(3)碳二亚胺法合成包被抗原(tp-ova)：用1ml dmf溶解氮吹步骤(1)得到的残留物tp-cmo，再加入6mg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)和8mg n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，室温搅拌，反应四小时，得到c液；称12mg鸡卵白蛋白(ova)用3ml pbs溶液(含20％dmf)进行溶解，得到d液；将c液逐滴滴加至d液中，并混匀，于4℃搅拌过夜，再用1
×
pbs缓冲液透析三天；透析完成后，离心收集上清，得到包被抗原tp-cmo-edc-ova(以下简称为tp-ova)，分装后于-20℃保存。
53.本实施例通过肟化法结合碳二亚胺法合成包被原(tp-ova)，并通过紫外扫描(图1a)及sds-page电泳(图1b)对其进行鉴定，结果显示完全抗原tp-ova偶联成功，鉴定结果显示获得所述丙酸睾酮完全抗原(tp-ova)。
54.实施例2单克隆抗体的制备
55.1、动物免疫
56.(1)选用实施例1合成的免疫抗原(tp-bsa)采用背部多点注射法免疫6-8周龄的balb/c母鼠，本实施例设定1号、2号两只小鼠；第一次免疫(即首免)使用弗氏完全佐剂，每只小鼠免疫100μg tp-bsa，后续的加强免疫佐剂更换为弗氏不完全佐剂，免疫剂量降低至50μg/只；免疫过程中抗原溶液与佐剂等体积(各100μl)混合乳化，并计算吸取抗原体积，剩
余采用1
×
pbs缓冲液进行补充；
57.(2)免疫过程中，间隔2周作为一个周期进行一次加强免疫，操作同首免；三免后2周采用间接elisa方法测定多抗血清效价，同时采用icelisa方法测定免疫小鼠的多抗血清的灵敏度(ic
50
)。
58.间接elisa方法具体操作为：
59.1)包被：用cbs碳酸盐缓冲液将包被原tp-ova的浓度调整为最佳包被浓度(2μg/ml)，加入96孔板中，加入量为100μl/孔，37℃孵育2h，使用洗涤缓冲液pbst洗3次，拍干；
60.2)封闭：在96孔板中加入5％猪血清，最好现配现用，加入量为200μl/孔，4℃过夜，使用pbst洗3次，拍干后4℃保存备用；
61.3)加多抗血清：第一孔直接加入100μl、1：100的多抗血清，第二孔开始用pbs将多抗血清进行倍比稀释；同时设置nc组和bc组，置于37℃孵育1h，使用pbst洗5次，拍干；
62.4)加酶标二抗：用5％猪血清按1:5000的比例将羊抗鼠goat-igg-hrp进行稀释，之后加入96孔板，加入量为100μl/孔，37℃孵育1h，使用pbst洗板5次；
63.5)显色：使用tmb试剂进行显色反应，将tmb显色试剂中的a液与b液等体积混匀后，加入96孔板，加入量为100μl/孔，室温下进行反应5-7min；
64.6)终止：将2mol/l的h2so4加入各待测96孔板上，加入量为100μl/孔；
65.7)读数：用酶标仪测定od
450
nm吸光度值；
66.8)结果判定：待测孔od
450
nm/阴性孔od
450
nm≥2.1则为阳性孔，阳性孔血清的最大稀释度为待测样品的效价。
67.间接竞争elisa(icelisa)方法为：
68.1)包被、封闭同上述间接elisa法相同；
69.2)选取2号小鼠，用od
450
值接近于1.0的多抗血清稀释倍数测其敏感性，具体步骤为：用一定浓度的tp准品溶液作为抑制剂，依次往后做倍比稀释至倒数第三孔停止，吸出100μl，从倒数第二个空白孔依次向标品浓度大的孔加入100μl od
450
nm读值为1.0左右的多抗血清，37℃孵育1h，使用pbst洗5次，拍干；
70.3)加酶标二抗：用5％猪血清按1:5000的比例将羊抗鼠goat-igg-hrp进行稀释，之后加入96孔板，加入量为100μl/孔，37℃孵育1h，使用pbst洗板5次；
71.4)显色：使用tmb试剂进行显色反应，将tmb显色试剂中的a液与b液等体积混匀后，加入96孔板，加入量为100μl/孔，室温下进行反应7min；
72.5)终止：将2mol/l的h2so4加入各待测96孔板上，加入量为100μl/孔；
73.6)读数：用酶标仪测定od450nm吸光度值；
74.7)结果判定：若抑制孔的od
450
值变小，说明有小鼠产生了特异性的抗体；然后以b/b0为纵坐标，以tp质量浓度(ng/ml)的对数值为横坐标，绘制tp对单克隆抗体的抑制曲线，根据绘制的标准曲线推导出回归方程，由此计算tp mab对tp 50％的ic
50
值(其中b0：tp浓度为0时的od
450
nm值；b：tp其他浓度的od
450
nm值)，并以此来衡量tp mab的敏感性，ic
50
越小，说明其敏感性越强。
75.间接elisa及间接竞争elisa(icelisa)结果如图2a所示，可以看出，两只免疫小鼠的血清效价均达到1:2.048
×
105，但1号小鼠更优；选取效价较高的1号小鼠od
450
值接近于1.0的多抗血清稀释倍数测其敏感性，如图2b所示，1号小鼠的多抗血清对tp有抑制作用，对
应的标准抑制曲线的线性回归方程为：y＝-0.2378x+0.762r2＝0.98，计算其ic
50
为12.64ng/ml。
76.2、细胞融合及单克隆抗体制备
77.(1)选择敏感性较好的1号小鼠作为实验对象，以腹腔注射的方式进行超强免疫，免疫剂量为100μg/只，超免后3-5天，无菌分离小鼠脾细胞，与处于对数生长期的骨髓瘤细胞sp2/0按照10:1比例混合，选择1ml 45％peg4000进行细胞融合；(2)在细胞融合后的7-10天采用间接elisa与间接竞争elisa(icelisa)同时检测的方式对96孔板中的杂交瘤细胞培养上清进行筛选，再通过3-5次亚克隆制备丙酸睾酮单克隆杂交瘤细胞株。
78.细胞融合后经过数团、检测等步骤发现，细胞融合率达到80％，阳性率达到15％；3次亚克隆后筛出四株稳定分泌抗丙酸睾酮抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3f9、6d3、7e12和7b2；对各株细胞上清效价和敏感性(ic
50
)进行测定(具体测定方法参照前述间接elisa及间接竞争elisa(icelisa)方法)，结果见表1。表1中结果显示3f9和6d3两株单抗的灵敏度较高，分别为5.918和6.37ng/ml。
79.表1四株抗tp单抗杂交瘤细胞株上清效价和敏感性(ic
50
)
[0080][0081][0082]
通过三次反复冻存及复苏细胞，间接竞争elisa(icelisa)方法测定细胞株稳定性，其中，ic
50
值变化情况如图3所示，3f9和6d3两株细胞的稳定性最好。因此，综合灵敏度和稳定性结果选择3f9细胞株制备单克隆抗体，并对单抗的各方面性能进行评价。
[0083]
(3)将丙酸睾酮单克隆杂交瘤细胞株3f9进行复苏和扩大培养，通过体内诱生腹水和辛酸硫酸铵法纯化腹水，获得抗tp单克隆抗体，并通过sds-page电泳进行鉴定和纯化，获得纯度较高的抗丙酸睾酮(tp)单克隆抗体，结果如图4所示。
[0084]
本发明还对3f9细胞株单克隆抗体进行了测序，其结果如下：
[0085]
重链可变区vh基因序列如seq id no.1所示，具体为：
[0086]
gggaagggatcatcaactctctgtgttgcctctggattcactttcagtaactcctggatgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtggattgctgaaattagattgaactctaataattatgcaacacattatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatttcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaatttaagagttgaagacactggcatttattactgtaagggctgggacgtttactatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaaaa
[0087]
重链可变区vh氨基酸序列如seq id no.2所示，具体为：
[0088]
gkgsstlcvasgftfsnswmnwvrqspekglewiaeirlnsnnyathyaesvkgrftisrddskssvylqmnnlrvedtgiyyckgwdvyyamdywgqgttvtvssk
[0089]
具体的，vh可变区各位点氨基酸序列如下表2所示
[0090]
表2
[0091]
名称序列fr-h1tlcvasgftfscdr-h1nswmnfr-h2wvrqspekglewiacdr-h2eirlnsnnyathyaesvkgfr-h3rftisrddskssvylqmnnlrvedtgiyyckgcdr-h3wdvyyamdyfr-h4wgqgttvtvss
[0092]
轻链可变区v
l
基因序列如seq id no.3所示，具体为：
[0093]
ttgacctggctcctgaggttccaggttcctctgagtgacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaattaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtaagcttgggaaaa
[0094]
轻链可变区v
l
氨基酸序列如seq id no.4所示，具体为：
[0095]
ltwllrfqvplsdivltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswklnglmlhqlypsshhpvslgk
[0096]
具体的，v
l
可变区各位点氨基酸序列如下表3所示
[0097]
表3
[0098]
名称序列fr-l1divltqspaslavslgqratisycdr-l1rasksvstsgysymhfr-l2wnqqkpgqpprlliycdr-l2lvsnlesfr-l3gvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyyccdr-l3qhir
[0099]
实施例3免疫荧光探针的合成
[0100]
1、选用edc法，用橙色cdse/zns(核/壳)量子点合成量子点(qds)标记的免疫荧光探针，本实施例以3f9细胞株单克隆抗体为例合成免疫荧光探针，本领域技术人员可知，6d3、7e12或7b2细胞株单克隆抗体同样能够合成具有较高特异性和灵敏度的免疫荧光探针，在此不再赘述。免疫荧光探针的合成方法，具体步骤如下：
[0101]
(1)将5μl橙色qds(8μm)与15.3μl的edc溶液(1mg/ml)混匀，使橙色qds：edc＝1:2000，于25℃温度、220r/min转速条件下避光反应30min；
[0102]
(2)按照量子点(qds)：单克隆抗体(mab)＝1:10的比例(质量比)加入抗tp单克隆抗体，并用pb缓冲液补充至反应总体积为100μl，于25℃温度、220r/min转速条件下避光反应3h；
[0103]
(3)加入bsa作为封闭液，并使其浓度为3mg/ml，于25℃温度、220r/min转速条件下避光反应30min，合成anti-tp-mab-qds免疫荧光探针，置于4℃避光保存。
[0104]
通过荧光光谱、琼脂糖凝胶电泳、sds-page电泳和免疫层析等方法对结果进行鉴定，鉴定结果如图5所示，从图5中结果，可以看出所合成的免疫荧光探针仍持有原来的生物活性，即证实采用此方法成功获得了anti-tp-mab-qds免疫荧光探针。
[0105]
2、采用同样的方法合成二抗探针(羊抗鼠igg-qds荧光探针)，不同的是结合比例为qds:mab＝1:5。
[0106]
实施例4间接竞争ic-elisa方法的建立
[0107]
1、最佳包被浓度和荧光探针稀释倍数的确定
[0108]
采用双功能棋盘法探索荧光探针和包被抗原最佳工作浓度，与传统棋盘法不同的是，在测定效价的同时添加一定的量的tp标准品，选择抑制最好的孔作为荧光探针和包被抗原的最佳工作浓度。具体步骤如下：
[0109]
(1)包被：设置包被浓度梯度为4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml，使用cbs碳酸盐缓冲液将tp-ova稀释至相应浓度后，以100μl/孔的添加量加入到黑色酶标板内，于4℃过夜包被后，弃掉tp-ova，并使用pbst洗涤液洗板三次，拍干；
[0110]
(2)封闭：将封闭液(5％猪血清)以200μl/孔的添加量加入到黑色酶标板中，置于烘箱在37℃温度下封闭两小时，然后弃去猪血清，并使用pbst洗涤液洗板三次，拍干；
[0111]
(3)一抗：首先将tp标准品先配制成1mg/ml的母液，使用时将其稀释到合适的浓度(具体为10ng/ml)；然后将实施例3制备的anti-tp-mab-qds荧光探针用荧光抗体稀释液(购自北京索莱宝科技有限公司，货号a1840)以1:50、1:100、1:200、1:400的倍比稀释成不同梯度，并按照表4所示布局方式加入一抗，置于37℃恒温烘箱内反应1h，反应结束后甩去板孔里的液体，洗板三次后拍干；
[0112]
表4双功能棋盘法探索荧光探针和包被抗原最佳工作浓度
[0113][0114]
(4)结果测定：使用多功能酶标仪进行读数，设置两个空白包被的孔作为对照，空
白对照中以100μl/孔的加入量添加1
×
pbs缓冲液，设置酶标仪激发波长为450nm，发射波长为610nm，检测荧光探针和包被抗原的最佳工作浓度。测定结果如表5所示。
[0115]
表5荧光探针和包被抗原最佳工作浓度结果
[0116][0117]
表5中结果显示包被浓度为1μg/ml，荧光探针以1:400的稀释倍比作为最佳的工作浓度。
[0118]
2、特异性、灵敏度的测定
[0119]
用量子点标记的二抗探针(羊抗鼠igg-qds)代替羊抗鼠igg-hrp，读取荧光强度值，建立标准曲线即可实现定量检测，具体步骤如下：
[0120]
(1)包被：使用cbs碳酸盐缓冲液将tp-ova稀释至2μg/ml，以100μl/孔的添加量加到黑色酶标板内，于4℃过夜包被后，弃掉tp-ova，洗板三次并拍干；
[0121]
(2)封闭：将封闭液(5％猪血清)以200μl/孔的添加量加到黑色酶标板中，置于37℃烘箱内封闭反应2h，弃去猪血清，洗板三次并拍干；
[0122]
(3)一抗：首孔加入200μl稀释好的tp标准溶液，然后依次倍比稀释并从第一列至第十一列相应添加，第十二列不加tp标准溶液作为空白对照孔(编号b0)，然后每孔加入100μl、1:6400稀释的阳性多抗血清，于37℃孵育1h后，弃去一抗，洗板五次并拍干；
[0123]
(4)二抗：用封闭液(5％猪血清)按适当比例稀释酶标二抗(羊抗鼠igg-qds)(1:400)，以100μl/孔的添加量加到黑色酶标板中，于37℃孵育1h，弃去二抗，pbst洗涤液洗板五次并拍干；
[0124]
(5)显色：使用tmb试剂进行显色反应，将tmb显色试剂中的a液和b液等体积混匀，以100μl/孔的添加量加到黑色酶标板中，避光显色5-10min；
[0125]
(6)终止：显色结束后加入与显色液等量的终止液(2mol/l h2so4)，终止后立即在酶标仪下读取酶标板各孔的od
450nm
值。
[0126]
测定结果如图6a所示，图6a为间接ic-elisa法绘制的tp标准曲线，从图6a中可以得出，ic-elisa方法检测tp含量的灵敏度(ic
50
)为5.83ng/ml。
[0127]
进一步的，本发明还使用tp的其他结构类似物并配制与tp标准溶液相同浓度的溶液，替代步骤(3)中的tp标准溶液，检测tp单抗与其它结构类似物的交叉反应，从而评价该单抗的特异性。表6结果显示，该单抗与其他五种结构类似物的交叉反应率均低于0.01％，获得高灵敏度的特异性丙酸睾酮单克隆抗体。
[0128]
表6 tp单抗与其它结构类似物的交叉反应
[0129][0130]
实施例5直接竞争荧光免疫吸附检测方法(dc-flisa)的建立
[0131]
具体步骤如下：
[0132]
(1)使用cbs碳酸盐缓冲液将tp-ova稀释至终浓度为2μg/ml，以100μl/孔的添加量加到黑色微量滴定板中，于37℃包被3h，抗原包被完成后，用含0.5％吐温的磷酸缓冲液洗涤三次；
[0133]
(2)将实施例3制备的anti-tp-mab-qds荧光探针用荧光抗体稀释液按照1:400比例稀释，得到anti-tp mab-qds荧光探针稀释液；
[0134]
(3)将制备不同浓度的tp标准溶液，具体为20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml、0ng/ml，获得tp浓度梯度标准溶液；
[0135]
(4)将anti-tp-mab-qds荧光探针稀释液和tp浓度梯度标准溶液加入到所述黑色微量滴定板中，于37℃下反应1h，与包被在黑色微量滴定板中的tp-ova竞争性结合，竞争性结合结束后，用含0.5％吐温的磷酸缓冲液洗涤三次，得到抗原-抗体发光免疫复合物；
[0136]
(5)采用多功能酶标仪检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，检测时发射波长为450nm，激发波长为610nm；并以tp浓度梯度标准溶液中tp的浓度对数值为横坐标，以所获得的荧光强度比值为纵坐标，绘制得到标准曲线(图6b)。
[0137]
测定结果如图6b所示，可以看出采用dc-flisa方法检测tp含量的灵敏度(ic
50
)值为0.58ng/ml，检出限为0.062ng/ml，检测范围为0.062-5.455ng/ml。与传统的ic-elisa方法(图6a)相比，在使用相同的抗体条件下，采用基于量子点标记的anti-tp-mab-qds荧光探针建立的dc-flisa方法的灵敏度提高了10倍，检测限有很大程度的降低。实施例5中建立的直接竞争荧光免疫吸附检测方法(dc-flisa)流程图如图7所示。
[0138]
具体的，ic-elisa与dc-flisa标准曲线的结果分析对比如表7所示。
[0139]
表7比较ic-elisa和dc-flisa的分析结果
[0140][0141]
实施例6回收验证实验
[0142]
采用间接竞争ic-elisa方法和本发明建立的直接竞争荧光免疫吸附检测方法(dc-flisa)对饲料中tp进行检测，具体试验步骤如下：
[0143]
(1)样品预处理
[0144]
所测定的饲料样品为小麦、大麦、玉米、大豆、黄豆、高粱、花生米、燕麦等粮食作物、成品饲料或者豆粕等饲料原料等，将待检样品研碎成粉末，称取1.00
±
0.05g均质后的样品于10ml离心管中；用3ml乙酸乙酯超声提取20min，然后于3500r/min转速离心10min，重复提取一次；合并2次提取液于45℃旋转蒸干，用含5％甲醇的磷酸缓冲液将其复溶，过滤后将滤液稀释20倍，待测；同时设置阴性空白饲料样品对照组。
[0145]
(2)加标回收实验
[0146]
向阴性空白饲料样品基质液(同预处理)中添加tp标准品，使tp终浓度为1、5、10、20ng/ml，再使用磷酸缓冲液各稀释20倍，获得加标待测样品稀释液。分别使用ic-elisa、dc-flisa两种免疫方法进行检测，设置六个重复，按以下公式计算样品回收率和变异系数。
[0147]
回收率(recovery)＝(检测浓度/加标量)
×
100％；
[0148]
变异系数(cv)＝(标准差sd/平均值mean)
×
100％。
[0149]
(3)实验结果
[0150]
在加标回收实验中，阴性空白饲料样品稀释液分别加入1、5、10、20ng/ml的tp标准品，每个加标浓度设置6个重复，通过这样的方式，测定了饲料中人工添加的tp的含量，对建立的dc-flisa方法进行验证。结果如表8所示。
[0151]
表8 dc-flisa/ic-elisa检测饲料中tp的加标回收结果
[0152][0153]
表8中tp的回收率为87.06-113.02％，变异系数均低于10％。结果表明，本发明建立的荧光免疫检测方法具有较高的准确度和精密度。
[0154]
上述实施例为本发明实施方式的举例说明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种抗丙酸睾酮单克隆抗体，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示，所述轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示。2.编码权利要求1所述单克隆抗体的基因，其特征在于，编码所述单克隆抗体重链可变区基因序列如seq id no.1所示，编码所述单克隆抗体轻链可变区基因序列如seq id no.3所示。3.一种量子点标记的免疫荧光探针，其特征在于，所述免疫荧光探针是通过将cdse/zns量子点与权利要求1所述抗丙酸睾酮单克隆抗体进行偶联制得。4.如权利要求3所述的免疫荧光探针，其特征在于，制备时量子点与单克隆抗体的质量比为1:（5-10）。5.一种检测丙酸睾酮的荧光免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：（a）包被有丙酸睾酮包被抗原的滴定板；（b）抗丙酸睾酮单克隆抗体-量子点免疫荧光探针；（c）丙酸睾酮标准品。6.权利要求3所述量子点标记的免疫荧光探针在丙酸睾酮定量检测中的应用。7.基于权利要求3所述免疫荧光探针的丙酸睾酮直接竞争荧光免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）免疫原的合成：分别采用肟化法和碳二亚胺法合成丙酸睾酮tp免疫抗原tp-bsa和丙酸睾酮包被抗原tp-ova；（2）单克隆抗体的制备：以丙酸睾酮免疫抗原tp-bsa作为免疫原，免疫6-8周龄的小鼠，并用分别采用间接elisa方法和icelisa方法测定免疫小鼠血清效价和免疫小鼠的多抗血清的敏感性；选取敏感性最好的免疫小鼠，进行超强免疫，超强免疫后3-5天，采用免疫小鼠脾细胞进行细胞融合，对细胞融合结果进行筛选，通过亚克隆制备阳性杂交瘤细胞株并制备高纯度抗tp单克隆抗体；（3）免疫荧光探针的合成：选用碳二亚胺法，将cdse/zns量子点与步骤（2）制备的抗tp单克隆抗体进行偶联，得到量子点标记的anti-tp-mab-qds免疫荧光探针；将制备的anti-tp-mab-qds荧光探针进行稀释，得到anti-tp-mab-qds荧光探针稀释液；（4）使用滴定板对丙酸睾酮包被原tp-ova进行包被，得到包被在滴定板中的丙酸睾酮完全抗原；制备不同浓度的tp标准溶液；（5）将anti-tp-mab-qds荧光探针稀释液和不同浓度的tp标准溶液加入到包被有丙酸睾酮包被抗原tp-ova的滴定板中，通过与包被在滴定板中的tp-ova竞争性结合，形成抗原-抗体发光免疫复合物；（6）检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，以tp浓度梯度标准溶液中tp的浓度对数值为横坐标，所获得的荧光强度比值为纵坐标，绘制得到标准曲线；（7）将所述tp浓度梯度标准溶液替换为待测样品溶液，并重复步骤（5）和步骤（6），获得待测样品溶液的荧光强度值，通过与标准曲线进行对比，得出待测样品中tp的浓度。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，将制备的anti-tp-mab-qds荧光探针按照1:400比例稀释，得到anti-tp-mab-qds荧光探针稀释液。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，免疫荧光探针在制备时量子点与
单克隆抗体的质量比为1:（5-10）。10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，tp浓度梯度标准溶液的浓度分别为20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.25 ng/ml、0.625 ng/ml、0.3125 ng/ml。

技术总结
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种量子点标记的丙酸睾酮直接竞争荧光免疫检测方法。本发明通过制备单克隆抗体，并将CdSe/ZnS（核/壳）量子点与制备的抗TP单克隆抗体进行偶联，合成量子点（QDs）标记的anti-TP-mAb-QDs免疫荧光探针，构建一种量子点标记的丙酸睾酮直接竞争荧光免疫检测体系，用于对丙酸睾酮进行检测。本发明所述量子点标记的直接竞争荧光免疫检测丙酸睾酮的方法操作简单，不需添加显色物质就能检测待测样品中丙酸睾酮残留含量，无论操作还是反应只需一步就可以完成。本发明方法操作简便、高效、灵敏且检测成本低，可应用于饲料中TP残留的快速检测，具有较好的准确性。准确性。


技术研发人员：张改平 陈玉梅 王爱萍 邬成业 孙方娜 周景明 刘江华 朱习芳 刘红亮 丁培阳 梁超 祁艳华
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2022.08.24
技术公布日：2023/7/21