一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.目前受气候等环境因素影响，全球范围内的干旱事件日益严重。利用植物与有益微生物的互作提高植物抗逆性，具有环保、经济、可持续等优点，是除培育耐旱作物之外的改善干旱条件对植物影响的重要手段。因此，开发具有提高植物抗旱性功能的微生物菌株对于抵抗干旱条件对植物造成的不利影响至关重要。
3.水稻是全球的主要粮食作物之一，也是单子叶植物和农作物研究的主要模拟物种，对非生物胁迫极为敏感，水稻栽培和生产过程中对水分的需求较大，干旱条件会极大地影响水稻的生长，因此开发能够提升水稻抗旱性的微生物菌株具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
5.具体地，本发明提供以下技术方案：本发明提供贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015，该菌株于2023年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，保藏编号为cgmcc no. 26764。
6.贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015能够显著提高植物的抗旱能力，促进植物在干旱条件下的正常生长和产量提升。
7.基于贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015，本发明提供一种微生物制剂，所述微生物制剂包含选自所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015的菌体、菌粉、菌悬液、发酵液、发酵液提取物中的一种或多种。
8.上述微生物制剂可为固体制剂或液体制剂。
9.在本发明的一些实施方式中，所述微生物制剂包含贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015的菌体。
10.在本发明的一些实施方式中，所述微生物制剂包含贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015的菌悬液。
11.上述微生物制剂还可包含微生物制剂领域允许的载体或辅料，包括但不限于冻干保护剂、稻壳粉、草炭土、碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、硅藻土等。
12.本发明还提供以上所述的微生物制剂的制备方法，所述方法包括培养所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015的步骤。
13.优选地，所述培养为在30-37℃、ph 6.5-7.5条件下进行。
14.所述培养可采用常用的贝莱斯芽孢杆菌培养基，包括但不限于lb培养基等。
15.基于贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015的特性和功能，本发明提供
所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或所述微生物制剂在提高植物抗旱性中的应用。
16.上述抗旱性为植物对干旱条件的耐受、抵抗能力。
17.本发明提供所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或所述微生物制剂在提高植物在干旱环境的生长能力中的应用。
18.上述生长能力的提高可表现在选自株高、根长、地上鲜重、地上干重、根鲜重、根干重、地下鲜重、地下干重中的一种或多种指标显著增加。
19.本发明提供所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或所述微生物制剂在干旱环境下延缓植物枯萎中的应用。
20.本发明提供所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或所述微生物制剂在提高植物在干旱环境的产量中的应用。
21.优选地，本发明所述的植物为水稻。
22.本发明提供所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或所述微生物制剂在制备农用制剂中的应用。
23.优选地，所述农用制剂具有提高植物的抗旱性的功能。
24.上述农用制剂的制备可采用选自贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015的菌体、菌粉、菌悬液、发酵液、发酵液提取物中的一种或多种。
25.本发明还提供所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或所述微生物制剂在选育具有提高植物抗旱性功能的贝莱斯芽孢杆菌中的应用。
26.本发明提供一种提高水稻抗旱性的方法，所述方法包括：将所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或所述微生物制剂施用于水稻。
27.上述施用可采用喷洒、浇灌、滴灌、喷雾、包被、注射或其他农业领域常用的施用方式，可进行一次性施用、重复施用或连续施用。
28.本发明的有益效果在于：本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015在施用于植物时能够显著提升植物的抗旱性，促进植物在干旱环境下的生长，延缓植物枯萎，可在农业生产实践中用于缓解植物干旱胁迫，对于提高作物的产量和品质具有重要的应用价值。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明实施例2中wrn015菌株对水稻生长的影响，其中，a为无干旱胁迫且不加菌；b为无干旱胁迫且加wrn015菌株；c为10% peg6000胁迫处理且不加菌；d为10% peg6000胁迫处理且加wrn015菌株。
31.图2为本发明实施例2中wrn015菌株缓解水稻干旱胁迫（10% peg6000）下生长指标的测定，其中，a为水稻株高；b为水稻地上部分鲜重；c为水稻地上部分干重；d为水稻根长；e为水稻根鲜重；f为水稻根干重。每瓶包含5株水稻苗，每个处理重复4瓶。“*”表示在p≤0.05
水平上差异显著，“**”表示在p≤0.01水平上差异显著。深色柱为0% peg6000处理，浅色柱为10% peg6000处理。
32.图3为本发明实施例2中wrn015菌株对黄瓜地上部分生长的影响，其中，a为5% peg6000胁迫且不加菌；b为5% peg6000且加wrn015菌株；c为10% peg6000胁迫处理且不加菌；d为10% peg6000胁迫处理且加wrn015菌株。
33.图4为本发明实施例2中wrn015菌株对黄瓜植株生长的影响，其中，a为5% peg6000胁迫且不加菌；b为5% peg6000且加wrn015菌株；c为10% peg6000胁迫处理且不加菌；d为10% peg6000胁迫处理且加wrn015菌株。
34.图5本发明实施例2中wrn015菌株缓解黄瓜干旱胁迫下生长指标的测定，其中，a为水稻株高；b为水稻地上部分鲜重；c为水稻地上部分干重；d为水稻根长；e为水稻根鲜重；f为水稻根干重。每瓶包含1株黄瓜苗，每个处理重复8瓶。深色柱为5% peg6000处理，浅色柱为10% peg6000处理。
35.图6为本发明实施例3中wrn015菌株对水稻植株生长的影响，其中，a为无盐胁迫且不加菌；b为无盐胁迫且加wrn015菌株；c为100 mm nacl胁迫处理且不加菌；d为100 mm nacl胁迫处理且加wrn015菌株。
36.图7为本发明实施例3中wrn015菌株缓解水稻盐胁迫下生长指标的测定，其中，a为水稻株高；b为水稻地上部分鲜重；c为水稻地上部分干重；d为水稻根长；e为水稻根鲜重；f为水稻根干重。每瓶包含5株水稻苗，每个处理重复8瓶。“*”表示在p≤0.05水平上差异显著。深色柱为0 mm nacl处理，浅色柱为100 mm nacl处理。
37.图8为本发明实施例3中wrn015菌株对黄瓜地上部分生长的影响，其中，a为无盐胁迫且不加菌；b为无盐胁迫且加wrn015菌株；c为100 mm nacl胁迫处理且不加菌；d为100 mm nacl胁迫处理且加wrn015菌株。
38.图9为本发明实施例3中wrn015菌株对黄瓜生长的影响，其中，a为无盐胁迫且不加菌；b为无盐胁迫且加wrn015菌株；c为100 mm nacl胁迫处理且不加菌；d为100 mm nacl胁迫处理且加wrn015菌株。
39.图10为本发明实施例3中wrn015菌株缓解黄瓜盐胁迫下生长指标的测定，其中，a为水稻株高；b为水稻地上部分鲜重；c为水稻地上部分干重；d为水稻根长；e为水稻根鲜重；f为水稻根干重。每瓶包含1株黄瓜苗，每个处理重复8瓶。“**”表示在p≤0.01水平上差异显著。深色柱为0 mm nacl处理，浅色柱为100 mm nacl处理。
具体实施方式
40.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1 贝莱斯芽孢杆菌wrn015的分离和鉴定
42.贝莱斯芽孢杆菌wrn015从天津滨海新区盐碱地土壤中经培养分离、纯化后获得，经鉴定，该菌株目前的分类地位为贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）。
43.贝莱斯芽孢杆菌wrn015已于2023年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员
会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，保藏编号为cgmcc no. 26764。
44.实施例2 wrn015菌株提高植物抗旱性分析
45.一、实验材料1、植物与菌株供试植物：
‘
9311’水稻；
‘
津春4号’黄瓜。
46.供试菌株：贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015。
47.2、培养基及试剂（1）1/2 ms固体培养基：将2.2 g murashige skoog培养基（含维生素）干粉与8.0 g植物凝胶溶于1 l无菌去离子水中，调整ph至5.8，121 ℃高压灭菌15 min。于超净台中分装至13 cm方形培养皿中。
48.（2）kimura b营养液：将254 mg木村b水稻营养液干粉及0.2 ml配套5,000
×
钙浓缩液溶解至1 l无菌去离子水中，调整ph至5.8，121 ℃高压灭菌15 min。
49.（3）1/4 ms培养液：将1.1 g murashige skoog培养基（含维生素）干粉与8.0 g植物凝胶溶于1 l无菌去离子水中，调整ph至5.8，121 ℃高压灭菌15 min。
50.（4）lb培养液：tryptone 5.0 g/l；yeast 3.0 g/l；cacl20.87g/l；琼脂粉15.0 g/l；蒸馏水定容至1 l。121 ℃、20 min高压蒸汽灭菌。固体培养基则添加15.0 g/l的琼脂粉。
51.（5）peg6000和nacl购买于国药集团化学试剂有限公司。
52.二、实验方法1、wrn015菌悬液制备（1）使用lb固体培养基活化wrn015菌株：使用无菌枪头从甘油管中吸取100-200 μl转移至lb固体培养基上，使用连续划线法涂布，于30 ℃恒温培养1-2天。
53.（2）使用lb液体培养基扩繁wrn015菌株：从平板上挑取单菌落，转移至lb液体培养基中。将培养基置于恒温摇床内，37 ℃、180 rmp条件下过夜培养，直至菌液浑浊。
54.（3）wrn015菌悬液制备：将浑浊菌液（od
600
≈1.0）于5000 rmp转速下4 ℃离心10 min，弃去上清。加入一定体积的1/4 kimura b培养液重悬菌液，将菌液稀释od
600
=1.0（现用现培养）。
55.2、水稻幼苗培养（1）挑选饱满的水稻种子，去除水稻种子颖壳，弃去干瘪的种子，不要损伤胚，置于无菌三角瓶内。
56.（2）加入75 %酒精，液面没过种子，消毒30 s，期间不停晃动瓶身，保证每粒种子都能与酒精充分接触，弃去酒精。
57.（3）加入2.5 %有效氯浓度的次氯酸钠溶液，液面没过种子，消毒15 min，期间不停晃动瓶身，弃去次氯酸钠。此步重复3次。
58.（4）加入无菌去离子水，液面没过种子，清洗10 min，期间不停晃动瓶身，弃去无菌水。此步重复3次。
59.（5）使用无菌镊子将种子整齐均匀的平铺于1/2 ms固体培养基表面，每皿可容纳10粒种子，将种子横向均匀排列于平板底部向上约5 cm 处，种子胚向上竖直放置，使用
parafilm封口膜封口。
60.（6）将培养皿竖直放置，于 25 ℃，16 小时(h)光照，21%湿度的培养间内培养7-9天。
61.（7）将培养皿上无菌且长势一致的水稻苗拔出，用无菌水洗去根上残留的培养基，移栽至无菌kimura b营养液中，长至水稻苗两叶期。
62.3、wrn015菌株缓解水稻干旱胁迫实验（1）以质量分数为10% peg6000为干旱胁迫的浓度，分为以下4组：a) 第一组：将2叶期水稻苗移至无菌kimura b营养液中；b) 第二组：将2叶期水稻苗移至无菌含10% peg6000的kimura b营养液中；c) 第三组：将2叶期水稻苗移至含wrn015菌株的kimura b营养液中（按wrn015菌悬液：kimura b营养液=1：9体积比稀释）；d) 第四组：将2叶期水稻苗移至既含wrn015菌株又含10% peg6000的kimura b营养液中（按wrn015菌悬液：含10% peg6000的kimura b营养液=1：9体积比稀释）。
63.（2）每瓶包含5株水稻苗，每个处理重复4瓶，水稻苗置于光照培养箱内培养，期间每三天左右补加对应的营养液，收集处理后第15 d的数据。
64.4、黄瓜幼苗培养（1）挑选饱满的黄瓜种子，弃去干瘪的种子，置于无菌三角瓶内。
65.（2）将黄瓜种子用无菌水浸泡6 h-8 h。
66.（3）加入75 %酒精，液面没过种子，消毒30 s，期间不停晃动瓶身，保证每粒种子都能与酒精充分接触，弃去酒精。
67.（4）加入2.0 %有效氯浓度的次氯酸钠溶液，液面没过种子，消毒15 min，期间不停晃动瓶身，弃去次氯酸钠。
68.（5）加入无菌去离子水，液面没过种子，清洗10 min，期间不停晃动瓶身，弃去无菌水。此步重复3次。
69.（6）使用无菌镊子将黄瓜种子置于滤纸上，黑暗条件下30℃催芽。
70.（7）黄瓜种子露白后播种于含蛭石的组培瓶中。
71.（8）组培瓶于 25 ℃，16 小时(h)光照，21%湿度的培养间内培养。
72.（9）黄瓜的子叶完全展开后，将组培瓶中的黄瓜移至无菌的1/4 ms营养液中进行水培，直至长至二叶一心期。
73.5、wrn015菌株缓解黄瓜干旱胁迫实验（1）以质量分数为5%和10%的peg6000为实验浓度，分为以下4组：a) 第一组：将二叶一心期的黄瓜苗移至无菌含5% peg6000的1/4 ms营养液中；b) 第二组：将二叶一心期的黄瓜苗移至既含wrn015菌株又含5% peg6000的1/4 ms营养液中（按wrn015菌悬液：含5% peg6000的kimura b营养液=1：9体积比稀释）；c) 第三组：将二叶一心期的黄瓜苗移至无菌含10% peg6000的1/4 ms营养液中；d) 第四组：将二叶一心期的黄瓜苗移至既含wrn015菌株又含10% peg6000的1/4 ms营养液中（按wrn015菌悬液：含10% peg6000的kimura b营养液=1：9体积比稀释）。
74.（2）每瓶包含1株黄瓜苗，每个处理重复8瓶，黄瓜苗置于光照培养箱内培养，期间每三天左右补加对应的营养液，收集处理后第15 d的数据。
75.三、实验结果1、wrn015菌株缓解水稻干旱胁迫无干旱胁迫的环境下，接种wrn015菌株15 d后，水稻的生长指标无显著差异（图1和图2）。在10% peg6000胁迫处理15 d后，对照组植株矮小，而wrn015菌株能够显著缓解干旱胁迫对水稻生长的影响（图1和图2），株高、地上部分鲜重、地上干重、根鲜重和根干重分别增加31.27%、22.98%、27.79%、23.94%和43.45%。
76.2、wrn015菌株缓解黄瓜干旱胁迫在5% peg6000胁迫和10% peg6000胁迫下，接种wrn015菌株对黄瓜幼苗的生长指标无显著影响（图3、图4和图5）。
77.实施例3 wrn015菌株对植物耐盐性的影响分析
78.一、实验材料本实施例使用的植物、菌株、培养基及试剂与实施例2的实验材料部分相同。
79.二、实验方法1、wrn015菌悬液制备wrn015菌悬液制备同实施例2。
80.2、水稻幼苗培养水稻幼苗培养同实施例2。
81.3、wrn015菌株缓解水稻盐胁迫实验（1）以100 mm nacl为盐胁迫的浓度，分为以下4组：a) 第一组：将2叶期水稻苗移至无菌kimura b营养液中；b) 第二组：将2叶期水稻苗移至无菌含100 mm nacl的kimura b营养液中；c) 第三组：将2叶期水稻苗移至含wrn015菌株的kimura b营养液中（按wrn015菌悬液：kimura b营养液=1：9体积比稀释）；d) 第四组：将2叶期水稻苗移至既含wrn015菌株又含100 mm nacl的kimura b营养液中（按wrn015菌悬液：含100 mm nacl的kimura b营养液=1：9体积比稀释）。
82.（2）每瓶包含5株水稻幼苗，每个处理重复8瓶，水稻苗置于光照培养箱内培养，期间每三天左右补加对应的营养液，收集处理后第12 d的数据。
83.4、黄瓜幼苗培养黄瓜幼苗培养同实施例2。
84.5、wrn015缓解黄瓜盐胁迫实验（1）以100 mm nacl为盐胁迫的浓度，分为以下4组：a) 第一组：将二叶一心期的黄瓜苗移至无菌1/4 ms营养液中；b) 第二组：将二叶一心期的黄瓜苗移至含wrn015菌体的1/4 ms营养液中（按wrn015菌悬液：kimura b营养液=1：9体积比稀释）；c) 第三组：将二叶一心期的黄瓜苗移至含100 mm nacl的1/4 ms营养液中；d) 第四组：将二叶一心期的黄瓜苗移至既含wrn015菌体又含100 mm nacl的1/4 ms营养液中（按wrn015菌悬液：含100 mm nacl的kimura b营养液=1：9体积比稀释）。
85.（2）每瓶含一株黄瓜苗，每个处理重复8瓶，黄瓜苗置于光照培养箱内培养，期间每三天左右补加对应的营养液，收集处理后第8 d的数据。
86.三、实验结果1、wrn015菌株缓解水稻盐胁迫无盐胁迫时，接种wrn015菌株12 d后对水稻的生长无明显影响（图6和图7）。在100 mm nacl胁迫下，除处理组的水稻地上鲜重显著高于对照外（p《0.05），其他生长指标并无显著差异（图6和图7）。由此可知，wrn015菌株并不是用于缓解水稻盐胁迫的理想菌株。
87.2、wrn015菌株缓解黄瓜盐胁迫无论在盐胁迫环境还是非盐环境下，接种wrn015菌株8 d后对黄瓜的生长指标都无明显影响（图8、图9和图10）。由此可知，wrn015菌株不能缓解黄瓜盐胁迫。
88.综上所述，在peg6000模拟干旱胁迫下，接种wrn015菌株的水稻，其株高、地上部分鲜重、地上干重、根鲜重和根干重分别增加31.27%、22.98%、27.79%、23.94%和43.45%；而wrn015菌株对在干旱胁迫下生长的黄瓜无显著作用。在100 mm nacl胁迫下，wrn015菌株对水稻和黄瓜的生长指标无显著作用。上述结果表明wrn015菌株可缓解水稻干旱胁迫。
89.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 26764。2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包含选自权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015的菌体、菌粉、菌悬液、发酵液、发酵液提取物中的一种或多种。3.权利要求2所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括培养所述贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015的步骤。4.根据权利要求3所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述培养为在30-37℃、ph 6.5-7.5条件下进行。5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或权利要求2所述的微生物制剂在提高植物抗旱性中的应用。6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或权利要求2所述的微生物制剂在提高植物在干旱环境的生长能力中的应用。7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或权利要求2所述的微生物制剂在提高植物在干旱环境的产量中的应用。8.根据权利要求5~7任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。9.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或权利要求2所述的微生物制剂在制备农用制剂中的应用。10.一种提高水稻抗旱性的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）wrn015或权利要求2所述的微生物制剂施用于水稻。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）WRN015保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26764。该菌株在施用于植物时能够显著提升植物的抗旱性，促进植物在干旱环境下的生长，延缓植物枯萎，可在农业生产实践中用于缓解植物干旱胁迫，对于提高作物的产量和品质具有重要的应用价值。物的产量和品质具有重要的应用价值。


技术研发人员：张桂山 龚旗 汪博 张晓霞 马春红 易可可 赵璞 李玉义
受保护的技术使用者：安徽博泽生物科技有限公司 河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/7/21