一种人ALK重排非小细胞肺癌细胞株HC4773及其应用

一种人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773及其应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤生物学领域，尤其涉及一种人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773，同时涉及该非小细胞肺癌细胞株hc4773的应用。


背景技术：

2.肺癌是严重危害人类生命和健康的常见恶性肿瘤。肺癌分为小细胞肺癌(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)，其中80％～85％为非小细胞肺癌，约2/3非小细胞肺癌存在基因改变，约1/2患者可获得靶向治疗机会。对治疗有显著反应的nsclc基因型包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)突变、alk重排、ros原癌基因重排等。为了促进和满足对人非小细胞肺癌的研究，需要越来越多的各种人体来源的存在基因改变的肺癌细胞株。为此我们建立了一种人的非小细胞肺癌细胞株hc4773，该细胞株有eml4-alk基因重排，重排型号为eml4-alk variant 3(e6；a20)。该细胞株alk蛋白表达阳性。这种非小细胞肺癌细胞株的建立，可成为研究alk基因重排的非小细胞肺癌的癌症生物学机制、开发和评价alk基因重排肺癌的抗癌药物以及耐药机制、耐药性逆转的重要工具。


技术实现要素：

3.本发明的首要目的是提供一种人alk重排非小细胞肺癌细胞株，该细胞株可用于构建人的有alk重排非小细胞肺癌体内、外肿瘤的动物和细胞模型。
4.所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773，保藏编号为cctcc no：c202370。
5.进一步地，该细胞株有eml4-alk基因重排，重排型号为eml4-alk variant3(e6；a20)。
6.更进一步地，该细胞株alk蛋白、角蛋白pan-keratin及epcam蛋白表达阳性。
7.本发明的第二个目的是提供所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773在制备筛选和评估抗肿瘤药物的制剂中的应用。
8.进一步地，所述的肿瘤为肺癌。
9.本发明的第三个目的是提供所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773在制备研究肿瘤耐药机制的制剂中的应用。
10.本发明的第四个目的是提供所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773在在构建人非小细胞肺癌体内、外肿瘤模型中的应用。
11.本发明的人alk重排非小细胞肺癌细胞株，命名为人源非小细胞肺癌细胞株hc4773，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年3月24日，保藏编号为cctcc no：c202370。
12.本发明的细胞株取自一个61岁的男性黄种人的低分化肺鳞状细胞癌的肺部手术肿瘤标本，用ii型胶原酶消化，采用改良的acl4无血清培养基培养2个月后改用含10％fbs rpmi1640培养基扩增培养。该细胞株角蛋白pan-keratin、epcam蛋白及alk蛋白表达阳性。
13.本发明研发过程包括以下步骤：
14.(1)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773在acl4无血清培养基中的培养。
15.(2)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773在含10％fbs rpmi1640培养基中培养、消化及传代。
16.(3)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773角蛋白pan-keratin、epcam蛋白及alk蛋白的表达。
17.(4)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773在免疫缺陷小鼠体内的致瘤能力。
18.(5)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773 alk重排亚型。
19.(6)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773 alk对靶向药物crizotinb的敏感性。
20.(7)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773 str的鉴定。
21.本发明的人源非小细胞肺癌细胞株hc4773可以用于研究人的alk重排非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、筛选和评估抗肿瘤药物及作用机制、研究肿瘤耐药机制、开发肿瘤耐药逆转药物及研究更有效的肿瘤治疗方法等，并可用于alk重排非小细胞肺癌致瘤机制及其相关信号通路的研究。具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
附图说明
22.图1为本发明的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773在倒置相差显微镜下拍摄的照片；
23.a为100倍，b为200倍。
24.图2为本发明人alk重排非小细胞肺癌细胞株pan-keratin、epcam及alk蛋白的表达；
25.a和b为hc4773细胞免疫荧光pan-keratin(a)及epcam(b)的表达(绿色荧光为pan-keratin及epcam，蓝色荧光为细胞核)；c为本发明人alk重排非小细胞肺癌细胞株免疫印迹epcam及alk蛋白的表达，其中h3122为alk表达阳性细胞株作阳性对照，a549为alk表达阴性细胞株作阴性对照。
26.图3为人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773细胞生长曲线及倍增时间；
27.图4为人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773在免疫缺陷小鼠scid beige皮下所成的瘤体；
28.红色箭头所指处即为皮下所成的瘤体。
29.图5为人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773 alk重排亚型sanger法测序图；
30.hc4773 alk重排亚型为eml4-alk variant 3(e6；a20)，箭头处为alk 20号外显子的起始处，也是eml4与alk的连接处。
31.图6为人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773对靶向药物crizotinb的敏感性测定结果。
32.图7为人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773str的鉴定结果。
具体实施方式
33.为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以详细说明，但不会形成对本发明保护范围的限制。
34.本发明中涉及的现有实验方法、测试方法及溶液配制方法可以参考《细胞实验指南》，标准书号：7-03-007598-6/q.891原著：[美]d.l.斯佩克特r.d.戈德曼&l.a.莱因万德。
[0035]
实施例中提及的rpmi1640培养液、试剂、抗体及试剂盒均为市购产品。
[0036]
实施例1：人源非小细胞肺癌细胞株hc4773的制备
[0037]
包括以下步骤：
[0038]
(1)取一个61岁的男性黄种人的中-低分化肺鳞癌的肺部手术肿瘤标本，置于冷的rpmi1640培养液中，在生物安全柜内无菌清理坏死组织，剪碎，用400u/mlii型胶原酶消化，采用改良的acl4无血清培养基培养2个月后改用含10％fbs rpmi1640培养基扩增培养。
[0039]
(2)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773的形态学观察：取人源非小细胞肺癌细胞株hc4773接种于25cm2培养瓶中，待生长至对数期，置倒置相差显微镜下观察活细胞形态并拍照，如图1所示，可见本发明细胞株hc4773呈上皮样细胞形态贴壁生长。
[0040]
(3)本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773的消化：取人源非小细胞肺癌细胞株hc4773接种于25cm2培养瓶中，待生长汇合至80％时，吸走培养基，加入5ml不含钙镁的磷酸盐缓冲液(d-pbs缓冲液)清洗，加0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸液(0.25％trypsin-edta)1ml室温消化，镜下观察，待细胞变圆，成流沙样，加入5ml含10％fbs rpmi1640培养基中和，稍吹打，吸入15ml离心管中，800转/分离心5分钟，弃上清，加入含10％fbs rpmi1640培养基，稍吹打混匀，1:4-6传代培养。
[0041]
(4)本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773的冻存：将步骤(3)消化获得的细胞置入冻存管的冻存液中，再将冻存管置于液氮中保存。冻存液由95％含10％fbs rpmi1640培养基和5％二甲基亚砜(dmso)组成。冻存过程采取将冻存管置于nalgene程序降温盒，-80℃过夜后放入液氮的步骤。
[0042]
(5)本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773的复苏：从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即直立放入37-40℃水浴中轻轻摇动，保证冻存管盖在水面上，使冻存物在1-2分钟内解冻，用酒精擦拭冻存管外壁后拿入超净台。将解冻后的细胞悬液置于15ml无菌离心管中，加入d-pbs缓冲液5ml，800转/分离心5分钟，弃上清，加入5ml含10％fbs rpmi1640培养基，稍吹打混匀成混合液，吸混合液置入一个25cm2的细胞培养瓶中，拧松瓶盖放入二氧化碳培养箱，在37℃、5％co2、饱和湿度的条件下培养，2-3天更换培养基一次，细胞密度达到80-90％时消化传代。
[0043]
实施例2：本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773角蛋白pan-keratin、epcam及alk蛋白的表达
[0044]
(1)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773免疫荧光pan-keratin及epcam蛋白的表达：取12孔板培养的汇合至40-50％本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773，吸去原培养基，冷d-pbs缓冲液漂洗一遍，按常规免疫荧光染色，结果见图2a和2b,hc4773表达pan-keratin和epcam蛋白。
[0045]
(2)人源非小细胞肺癌细胞株hc4773免疫印迹alk和epcam蛋白的表达：取6孔板培养的汇合至80-90％本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773，吸去原培养基，冷d-pbs缓冲液漂洗一遍，加入含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰上立即用细胞刮刮取细胞，转刮取的细胞抽提液置ep管，超声10-15s，冰上冷却，4℃12000转/分离心10分钟，取上清,用bca试剂盒测蛋白浓度，取总蛋白25ug加上样缓冲液上样，按蛋白免疫印迹方法常
规电泳、转膜、孵育抗体，机器曝光。结果见图2c，蛋白免疫印迹的结果显示hc4773表达alk和epcam蛋白。
[0046]
实施例3：人源非小细胞肺癌细胞株hc4773的细胞生长曲线和倍增时间测定
[0047]
取本发明的人源非小细胞肺癌细胞株hc4773，用0.25％trypsin-edta消化制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔细胞2.3
×
103个，于24、48、72、96、120、144、168小时用cck8试剂盒测定细胞活力，每次测定10孔，取平均值绘制细胞生长曲线(图3)，并计算倍增时间(td)。按patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间td(h)＝tlg2/lg(n/no)，其中t表示细胞对数增值的时间，n为对数增殖期结束时的细胞数，no为对数增殖期开始时的细胞数，算得hc4773群体倍增时间为平均25.35小时。
[0048]
实施例4：本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773免疫缺陷小鼠scid beige皮下成瘤性测定
[0049]
用0.25％trypsin-edta分别消化处于对数生长期的本发明的人源非小细胞肺癌细胞株hc4773，预冷pbs洗两遍，去除细胞中残余的血清，预冷无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，加4度基质胶与无血清培养基的比例1:1，hc4773 2-3
×
106个细胞/只接种至3-4周scid beige皮下，接种体积为0.1ml，每周两次观察成瘤情况直至瘤体形成。图4为人源非小细胞肺癌细胞株hc4773在免疫缺项小鼠scid beige皮下所形成的瘤体。
[0050]
实施例5:人源非小细胞肺癌细胞株hc4773的alk重排亚型测定
[0051]
取t25培养瓶培养的汇合至80-90％本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773，吸去原培养基，加入细胞裂解液，按试剂盒的方法抽提rna，逆转录成cdna，使用如下引物扩增：eml4-72f5
′‑
gtcagctcttgagtcacgagtt-3
′
alk-3078rr5
′‑
atccagttcgtcctgttcagagc-3
′
,分别见seq id no.1-2，送公司测序，分析测序结果，hc4773alk重排亚型为eml4-alk variant 3(e6；a20)，见图5。
[0052]
实施例6:人源非小细胞肺癌细胞株hc4773对靶向药物crizotinb的敏感性测定
[0053]
取汇合至70％左右的一瓶t25细胞，消化中和离心，加培养基混匀计数，取混匀液100ul(约3100个细胞)接种至96孔板，接种24小时后加入不同浓度crizotinb(0nmol/l、33nmol/l、66nmol/l、100nmol/l、333nmol/l、666nmol/l、1μmol/l、3.33μmol/l、6.66μmol/l、10μmol/l)100ul，每个浓度重复6孔。72小时后用cck8试剂盒检测，检测结果显示hc4773对crizotinb敏感，ic50＝435.1nmol/l。见图6。
[0054]
实施例7:本发明人源非小细胞肺癌细胞株hc4773str鉴定
[0055]
取本发明的人源非小细胞肺癌细胞株hc4773汇合至80-90％25cm2培养瓶细胞一瓶，吸去培养液，0.25％trypsin-edta消化，离心，弃去培养基，加入5ml磷酸盐缓冲液，漂洗一遍，离心，弃去磷酸盐缓冲液，将细胞沉淀送至公司进行人源细胞str鉴定。结果见图7。与atcc、dsmz等细胞库的数据库进行比对，未发现相同str检测结果，由此证明其是唯一的，且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染。
[0056]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773，保藏编号为cctcc no：c202370。2.根据权利要求1所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773，其特征在于，该细胞株有eml4-alk基因重排，重排型号为eml4-alk variant 3(e6；a20)。3.根据权利要求1所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773，其特征在于，该细胞株alk蛋白表达阳性。4.根据权利要求1所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773，其特征在于，该细胞株角蛋白pan-keratin及epcam蛋白表达阳性。5.权利要求1-4任一项所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773在制备筛选和评估抗肿瘤药物的制剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌。7.权利要求1-4任一项所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773在制备研究肿瘤耐药机制的制剂中的应用。8.权利要求1-4任一项所述的人alk重排非小细胞肺癌细胞株hc4773在构建人非小细胞肺癌体内、外肿瘤的动物和细胞模型中的应用。

技术总结
本发明公开了一种人ALK重排非小细胞肺癌细胞株HC4773及其应用，保藏编号为CCTCC NO：C202370。该细胞株有EML4-ALK基因重排，重排型号为EML4-ALK variant 3(E6；A20)，为人非小细胞肺癌鳞癌细胞株，ALK、角蛋白Pan-Keratin及Epcam蛋白表达阳性。本细胞株HC4773可以用于研究人ALK重排非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、分析ALK靶向药物敏感性及筛选和评估靶向抗肿瘤药物、以及研究耐药机制、耐药性逆转的重要工具，从而为人类寻求更有效的肿瘤治疗方法等，具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。经济和社会效益。经济和社会效益。


技术研发人员：胡野荣 周杨钊 谭凌
受保护的技术使用者：中南大学湘雅二医院
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/7/22