一种硫普罗宁的荧光检测方法

1.本发明属于分析检测技术领域，涉及药片中主药的定量检测分析方法，尤其涉及一种硫普罗宁的荧光检测方法。


背景技术：

2.硫普罗宁是一种含有活性巯基的甘氨酸衍生物，其化学名为n-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸，是一种新型含巯基甘氨酸类药物,能抗各种类型肝损伤,可保护肝线粒体结构,改善肝功能,促进肝细胞再生。在临床广泛用于治疗病毒性急慢性肝炎，早期肝硬化等，具有防治各种类型肝损伤的作用，并且副作用少，用药安全，现已成为多种肝炎的基础用药。
3.目前，硫普罗宁的标准测定方法为滴定法，但是该方法容易受到其它条件的干扰，如易受到制剂中的辅料的干扰等。除此之外，还报道了不少关于硫普罗宁药物的检测方法。如液相色谱-串联质谱法、流动注射法、高效液相色谱法、化学发光法及浮选法等。然而，这些方法或多或少受到一定的限制，有的需要用到十分昂贵的仪器，且需要富有经验的专业研究员操作，有的方法十分复杂，成本较高，严重阻碍了其在实际样品中的应用。因此，需要开发更加高效、廉价、选择性好且适用于实际药片检测的方法。
4.近年来，有机荧光分子探针法逐渐受到人们的关注，相比传统方法，它具有灵敏度高，选择性好、操作简便和成本较低等优点。目前，已报道的检测硫普罗宁的有机荧光探针法较为少见，尤其是缺乏能够应用于实际样品中的荧光检测法，因此，本内容围绕有机荧光探针法定量检测硫普罗宁展开研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种硫普罗宁的荧光检测方法，以解决现有常规硫普罗宁测定方法存在的问题，实现高效、简单、高选择性、高灵敏性地检测硫普罗宁的含量。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供一种硫普罗宁的荧光检测方法，包括如下步骤：
8.(1)将n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺(nds)的甲醇溶液加入到pbs缓冲液中，配制成一定浓度的探针溶液，并采用荧光法测定探针溶液的荧光强度；
9.(2)向探针溶液中加入一系列浓度的硫普罗宁标准溶液进行反应，待反应结束后采用荧光法测定反应液的荧光强度，并绘图得到硫普罗宁的标准曲线；
10.(3)取硫普罗宁样品溶液的与探针溶液进行反应，待反应结束后采用荧光法测定反应液的荧光强度，并根据得到的标准曲线定量分析硫普罗宁。
11.优选地，步骤(1)中所述n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺(nds)的甲醇溶液的浓度为100-300μm。
12.较为优选地，步骤(1)中所述n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺(nds)的甲醇溶液的浓度为200μm。
13.优选地，步骤(1)中所述pbs缓冲液的ph值为5-11，浓度为5-15mm。
14.较为优选地，步骤(1)中所述pbs缓冲液的ph值为9，浓度为10mm。
15.优选地，步骤(1)中所配制的探针溶液的浓度为10-30μm。
16.较为优选地，步骤(1)中所配制的探针溶液的浓度为20μm。
17.优选地，步骤(1)中所述硫普罗宁标准溶液的浓度为0-50μm。
18.较为优选地，步骤(1)中所述硫普罗宁标准溶液的浓度为30-50μm。
19.优选地，步骤(2)中所述孵化反应的温度为4-55℃，孵化时间为0-90min。
20.较为优选地，步骤(2)中所述孵化反应的温度为37℃，孵化时间为70min。
21.优选地，步骤(2)中得到的所述得到硫普罗宁的标准曲线为：
22.f＝0.0813+0.0195x，其中，f为相对荧光强度，x为硫普罗宁浓度，线性相关系数0.9887。
23.优选地，步骤(2)中所述硫普罗宁样品溶液的配制方法为：
24.称取硫普罗宁药片，研碎，准确加水30ml，摇匀至充分溶解，离心，取上层清液，定容至50ml，进一步稀释至浓度为0-50μm，待用。
25.优选地，步骤(2)和(3)中所述硫普罗宁标准溶液或所述硫普罗宁样品溶液与所述探针溶液的体积比为1:100-1:1000。
26.较为优选地，步骤(2)和(3)中所述硫普罗宁标准溶液或所述硫普罗宁样品溶液与所述探针溶液的体积比为1:100。
27.优选地，步骤(2)和(3)中所述荧光法测定时的激发波长为353nm、发射波长为450nm。
28.优选地，还包括抗干扰实验，抗干扰实验试剂为氯化铁，氯化锌，氯化钙，氯化汞，硫酸钠，硝酸钾，氯化镁，组氨酸，氨基乙酸，丙氨酸，谷氨酸，精氨酸，多巴胺，抗坏血酸，尿酸，脯氨酸等。
29.本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
30.(1)本发明有机荧光分子探针检测硫普罗宁的方法简单易操作、成本较低、灵敏度高，能够实现对硫普罗宁的定量检测。
31.(2)本发明的荧光检测方法选择性好、抗干扰能力强，能够排除辅料的干扰，应用于实际药片的检测，且回收率高。
附图说明
32.图1为实施例1荧光探针对硫普罗宁的检测孵化反应原理图；
33.图2为实施例1荧光探针对硫普罗宁的检测孵化波长范围适用性图；
34.图3为实施例2荧光探针对硫普罗宁的检测孵化ph值范围适用性图；
35.图4为实施例3荧光探针对硫普罗宁的检测孵化温度范围适用性图；
36.图5为实施例4荧光探针对硫普罗宁的检测孵化时间范围适用性图；
37.图6为实施例5探针检测不同浓度的硫普罗宁的荧光光谱图；
38.图7为实施例5探针检测不同浓度的硫普罗宁的线性关系图；
39.图8为实施例6荧光探针对不同干扰物的响应图。
具体实施方式
40.本发明的主要技术方案是将自主合成的荧光探针(n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺)溶解在10mm ph＝9的磷酸缓冲液，配成浓度为20μm的探针，利用荧光分光光度计测定其荧光信号，由于2,4-二硝基苯磺酰基的强吸电子作用，探针发生分子内电子转移，使探针荧光猝灭，结果显示荧光猝灭。
41.如图1所示，当加入硫普罗宁时，由于硫普罗宁含有巯基，硫醇离解成为硫负离子，硫负离子作为一种强亲核试剂进攻2,4-二硝基苯基，使强吸电子基团从荧光基团上脱落，使荧光基团游离，从而使荧光显著增强。因此，可以根据荧光强度的变化来定量检测硫普罗宁。
42.下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
43.实施例1
44.取50μl甲醇溶解的探针n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺(nds)加入450μl，10mm，ph＝9的磷酸缓冲液，配成浓度为20μm的探针，采用荧光法测定探针荧光强度。
45.然后分别向里面加入浓度为30μm硫普罗宁溶液，在37℃下反应70分钟，在353nm激发波长下采用荧光法检测反应后的探针的荧光。
46.最后在发射波长为450nm处来定量分析硫普罗宁。
47.结果表明探针的可行性强，可用于定量分析硫普罗宁，结果见图2所示。
48.实施例2
49.取50μl甲醇溶解的探针n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺(nds)分别加入450μl，10mm不同ph的磷酸缓冲液(ph范围为5-11)，配成浓度为20μm的探针，测定探针荧光强度。
50.然后分别向里面加入浓度为20μm硫普罗宁溶液，在25℃下反应60分钟。在353nm激发波长下检测反应后的探针的荧光。
51.最后在发射波长为450nm处来定量分析硫普罗宁。
52.检测结果如图3所示，结果表明探针的荧光强度随着ph值的增大而增强，直到ph＝9的时候趋向于稳定。因此，10mm ph值5-11的pbs缓冲液均在可使用范围内。
53.实施例3
54.取50μl甲醇溶解的探针n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺(nds)分别加入450μl，10mm ph＝9的磷酸缓冲液，配成浓度为20μm的探针，测定探针荧光强度。
55.然后分别向里面加入浓度为20μm硫普罗宁溶液，分别在4-55℃下反应60分钟。在353nm激发波长下检测反应后的探针的荧光。
56.在发射波长为450nm处来定量分析硫普罗宁。
57.检测结果如图4所示，结果显示荧光强度随着温度升高而增强，直到达到最大值。因此，孵化4-55℃均可作为使用范围。
58.实施例4
59.取50μl甲醇溶解的探针n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯
磺酰胺(nds)分别加入450μl，10mm ph＝9的磷酸缓冲液，配成浓度为20μm的探针，测定探针荧光强度。
60.然后分别向里面加入浓度为20μm硫普罗宁溶液，在37℃下，分别反应0-90分钟，在353nm激发波长下检测反应后的探针的荧光。
61.最后在发射波长为450nm处来定量分析硫普罗宁。
62.检测结果如图5所示，结果表明随着反应时间延长，探针荧光强度呈明显的增强趋势，在70分钟后逐渐趋向稳定。因此，0-90分钟作为本实验的响应时间范围。
63.实施例5
64.实验操作同实施例1，区别的是硫普罗宁浓度从0-50μm。检测结果如图6所示，结果表明反应体系的荧光强度随着硫普罗宁的浓度的增加而增大。
65.如图7所示，其线性方程为：f＝0.0813+0.0195x，f为相对荧光强度，x为硫普罗宁浓度，线性相关系数0.9887，表明本研究提出的检测硫普罗宁的方法具有较高的灵敏度。
66.实施例6
67.实验操作同实施例1，区别是干扰性实验分别将硫普罗宁替换成氯化锌，氯化钙，氯化汞，硫酸钠，硝酸钾，氯化镁，组氨酸，氨基乙酸，丙氨酸，谷氨酸，精氨酸，多巴胺，抗坏血酸，尿酸，脯氨酸等。
68.检测结果如图8所示，结果表明药片添加物和其他物质均不能引起明显的荧光增强，只有硫普罗宁能够引起探针的荧光强度明显增强，表明探针具有很好的选择性，该方法可以高选择性地检测硫普罗宁。
69.实施例7
70.称取硫普罗宁药片(约相当于硫普罗宁100mg)，研碎，至50ml pu管中，准确加水30ml，摇匀至充分溶解，离心，取上层清液，定容至50ml，进一步稀释成不同浓度待用。
71.取4个2ml的pu管，然后向里面加入50μl的探针，450μl的10％的正常人尿样，配成20μm的探针，其中一个不加检测物作为空白对照，其余三个分别加入5μl不同浓度的硫普罗宁药物测物。混匀后，在37℃中反应70分钟，然后在353nm的激发下，测定其荧光变化。
72.检测结果如下表1所示，结果表明，该方法测定的硫普罗宁的含量与药片表明的基本一致，说明本研究合成的探针能够用于实际样品的检测分析。
73.表1在尿样中检测硫普罗宁的结果
[0074][0075]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

技术特征：
1.一种硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺(nds)的甲醇溶液加入到pbs缓冲液中，配制成一定浓度的探针溶液，并采用荧光法测定探针溶液的荧光强度；(2)向探针溶液中加入一系列浓度的硫普罗宁标准溶液进行反应，待反应结束后采用荧光法测定反应液的荧光强度，并绘图得到硫普罗宁的标准曲线；(3)取硫普罗宁样品溶液的与探针溶液进行反应，待反应结束后采用荧光法测定反应液的荧光强度，并根据得到的标准曲线定量分析硫普罗宁。2.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述n-(4-甲基-2-氧代-2-氢-苯并吡喃-7-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺(nds)的甲醇溶液的浓度为100-300μm。3.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述pbs缓冲液的ph值为5-11，浓度为5-15mm。4.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(1)中所配制的探针溶液的浓度为10-30μm。5.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述硫普罗宁标准溶液的浓度为0-50μm。6.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述孵化反应的温度为4-55℃，孵化时间为0-90min。7.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(2)中得到的所述得到硫普罗宁的标准曲线为：f＝0.0813+0.0195x，其中，f为相对荧光强度，x为硫普罗宁浓度，线性相关系数0.9887。8.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述硫普罗宁样品溶液的配制方法为：称取硫普罗宁药片，研碎，准确加水30ml，摇匀至充分溶解，离心，取上层清液，定容至50ml，进一步稀释至浓度为0-50μm，待用。9.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中所述硫普罗宁标准溶液或所述硫普罗宁样品溶液与所述探针溶液的体积比为1:100-1:1000。10.根据权利要求1所述的硫普罗宁的荧光检测方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中所述荧光法测定时的激发波长为353nm、发射波长为450nm。

技术总结
本发明属于分析检测技术领域，公开了一种硫普罗宁的荧光检测方法，包括步骤：(1)将NDS的甲醇溶液加入到PBS缓冲液中，配制成探针溶液，并测定探针溶液的荧光强度；(2)向探针溶液中加入一系列浓度的硫普罗宁标准溶液进行反应，待反应结束后测定反应液的荧光强度，并绘图得到硫普罗宁的标准曲线；(3)取硫普罗宁样品溶液的与探针溶液进行反应，待反应结束后测定反应液的荧光强度，并根据得到的标准曲线定量分析硫普罗宁。本发明根据荧光分子探针的荧光变化实现对硫普罗宁的高选择性、高灵敏性地检测，方法简单，灵敏度高，选择性好，更重要的是该方法能够排除药片中辅料的干扰用于实际样品中检测，有潜力应用于药物检测及疾病诊断中。中。中。


技术研发人员：魏明杰 欧莹宝
受保护的技术使用者：湖北科技学院
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/7/22