重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法及其感染性克隆和应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆及其构建方法和应用。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)引起的一种高度传染性疾病。pedv可以感染各个年龄段的猪，并导致新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率。pedv是单股正链有囊膜的rna病毒，属于α冠状病毒属。pedv基因组约为28kb，包括两个末端非翻译区(5
′‑
utr和3
′‑
utr)以及至少7个开放阅读框(open reading frame，orf)。orf1a和orf1b分别编码pp1a(polyprotein 1a)和pp1ab两个多聚蛋白，在病毒蛋白酶的作用下，两个多聚蛋白可以进一步加工成16个成熟的非结构蛋白，分别为nsp1～nsp16。orf2～orf6分别编码刺突蛋白(spike protein)、辅助蛋白orf3、包膜蛋白(envelope protein)、膜蛋白(matrix protein)以及核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)。
3.猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)是养猪业中最常见的肠道致病性病毒之一，可以感染母猪和仔猪，死亡率较高。pdcov是养猪业中最常见的肠道致病性病毒之一，可以感染母猪和仔猪，主要临床症状表现为水样腹泻和呕吐。研究表明，pdcov有人畜共患的可能性。pdcov是单股正链有囊膜的rna病毒，属于δ冠状病毒属，其基因组长度约为25.4kb，其基因排列如下：5
′‑
utr，orfla、orf1b(编码ppla(polyprotein 1a)和pplab两个多聚蛋白)，刺突蛋白(spike protein)、包膜蛋白(envelope protein)、膜蛋白(matrix protein)、非结构蛋白6(non-structural protein 6，ns6)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)、ns7、ns7a和3
′‑
utr。
4.细菌人工染色体(bac)是基于大肠杆菌f因子的单拷贝质粒载体，具有容量大的特点，插入外源基因后可以在大肠杆菌中稳定复制。冠状病毒基因组巨大，不能在高拷贝质粒载体中稳定复制，因此，细菌人工染色体(bac)是构建冠状病毒感染性克隆的理想载体。反向遗传操作系统是病毒学研究中最重要的工具之一，其在冠状病毒研究中的应用，加深了我们对病毒的分子生物学特性，复制机制及致病机理的了解。因此，建立pedv和pdcov的反向遗传操作系统对于pedv和pdcov的研究显得尤为重要。
5.对于病毒感染性克隆的改造，传统的技术是通过寻找合适的酶切位点，利用限制性内切酶和dna连接酶等工具，甚至需要引入中间载体来完成，过程复杂繁琐。以bac为骨架的冠状病毒感染性克隆质粒，由于病毒基因组庞大，并且质粒的浓度低，如果在体外对其进行编辑，难度较大，因此传统的方法不适合。而red重组技术可以解决这一难题。red重组技术起源于噬菌体，通过同源重组的方法插入线性双链dna分子。red重组技术中所需要的同源臂仅为50bp，因此可以通过pcr将同源臂直接添加在打靶片段的两侧。通过升温诱导e.coli gs1783菌株中的温敏启动子控制的red/et酶系统表达，实现第一轮red重组，再利
用l-阿拉伯糖诱导反筛选诱导内切酶i-scei的表达，进行第二次重组。该策略不依赖于病毒基因组的大小和载体种类，实现对病毒基因组的无痕编辑。目前，对于red重组的效率鲜有报道，而且已有报道显示red重组的重组率较低，提高red重组的效率有益冠状病毒基因组的编辑。
6.pedv和pdcov是全球养猪业和农业经济的巨大威胁，疫苗免疫是pedv和pdcov防控的有效措施。自2010年pedv出现变异株以来，针对g1型与g2型毒株的疫苗之间的交叉保护较弱；另外，目前暂无商品化的疫苗和特效药对pdcov进行预防和治疗。因此，研究新型的pedv和pdcov基因工程疫苗迫在眉睫，而反向遗传学系统就是很有力的工具。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种高效的重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法。
8.本发明还要解决的技术问题是提供了多个pedv感染性克隆。
9.本发明还要解决的技术问题是提供了pedv感染性克隆在制备预防或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用以及在制备pedv疫苗中的应用。
10.本发明还要解决的技术问题是提供了一种高效的重组猪δ冠状病毒感染性克隆的构建方法。
11.本发明还要解决的技术问题是提供了多个重组猪δ冠状病毒的感染性克隆。
12.本发明还要解决的技术问题是提供了重组猪δ冠状病毒的感染性克隆在制备预防或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用以及在制备重组猪δ冠状病毒的疫苗中的应用。
13.技术方案：为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：
14.1)扩增打靶片段：所述打靶片段的结构依次包含pedv-s基因下游的同源臂、目的基因1、酶切位点、抗性基因和pedv-orf3基因下游的同源臂；
15.或所述打靶片段的结构依次包含pedv-s基因下游的同源臂、目的基因2、酶切位点、抗性基因和pedv-orf3基因上游的同源臂；
16.2)电转化打靶片段进行第一轮基因重组得到阳性克隆；
17.3)将步骤2)得到的阳性克隆通过第二轮重组去掉酶切位点和抗性基因得到重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆。
18.其中，所述目的基因1包括nluc基因或rfp基因；所述目的基因2包括gfp-p2a基因。以上目的基因1或目的基因2可以根据实验目的，如果需要其他报告基因，也可以扩增其他的基因。
19.其中，步骤1)具体包括以下步骤：
20.1.1)pcr扩增含有酶切位点和抗性筛选基因的基因片段1；
21.1.2)以含有目的基因1或目的基因2的质粒为模板，pcr扩增得到目的基因1或目的基因2的前半段；pcr扩增得到目的基因1或目的基因2的后半段；
22.1.3)以目的基因1的前半段与基因片段1为模板，通过overlap pcr扩增得到基因片段2；再以基因片段2和目的基因1的后半段为模板，通过overlap pcr方法扩增同时包含pedv-s基因下游的同源臂和pedv-orf3基因下游的同源臂的打靶片段；或以目的基因2的前
半段与基因片段1为模板，通过overlap pcr扩增得到基因片段3；再以基因片段3和目的基因2的后半段为模板，通过overlap pcr方法扩增同时包含pedv-s基因下游的同源臂和pedv-orf3基因上游的同源臂的打靶片段。
23.其中，所述pedv-s基因下游的同源臂和pedv-orf3基因下游的同源臂或pedv-orf3基因上游的同源臂的序列如seq id no：1或seq id no：2或seq id no：3所示。
24.进一步，同源臂与外源基因要插入病毒基因组的位置有关，同源臂的长度需要50bp。
25.i-sec i是一种由内含子编码的归位内切酶，在大肠杆菌中利用l-阿拉伯糖诱导其表达，对核酸内切酶来说，这是一种罕见的切割，并且自然出现的概率极低(1/4^18)。因此，我们选择所述酶切位点为i-scei，其他能够有该功能的内切酶也可以用于本发明。
26.其中，所述抗性基因包括kan，也可以更换为其他的抗性(比如，氨苄等)，但是必须与要编辑的感染性克隆质粒抗性不同。
27.其中，步骤3)具体包括以下步骤：
28.3.1)挑取步骤2)的阳性克隆的单菌落接种于含氯霉素的lb液体培养基中，培养至浑浊；
29.3.2)向其中加入含有2％浓度的l-阿拉伯糖和氯霉素的lb液体培养基，30℃-32℃培养1h。
30.3.3)将步骤3.2)中的菌液放于42℃摇床培养30min-60min；
31.3.4)将步骤3.3)中的菌液置于30℃-32℃摇床继续培养3-4h后，取菌液做稀释，取稀释好的菌液涂布到含有1％浓度的l-阿拉伯糖和氯霉素抗性的lb平板，待菌液充分吸收后，于30℃-32℃细菌培养箱中倒置培养约24h；
32.3.5)挑取步骤3.4)中所得的单菌落分别点涂于含氯霉素抗性和卡那霉素抗性的lb平板中，在卡那霉素抗性lb固体培养基不生长，且在氯霉素lb固体培养基中生长的菌落为重组成功的菌落，即得阳性克隆。
33.本发明内容还包括所述的构建方法获得的重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法。
34.本发明内容还包括所述表达目的基因的pedv感染性克隆在制备预防或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
35.本发明内容还包括所述表达目的基因的pedv感染性克隆在制备pedv疫苗中的应用。
36.另一方面，本发明提供了一种重组pdcov感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：
37.1)扩增打靶片段：所述打靶片段的结构依次包含pdcov-m基因下游的同源臂、目的基因3、酶切位点、抗性基因和pdcov-ns6基因下游的同源臂；
38.或所述打靶片段的结构依次包含pdcov-ns6基因下游的同源臂、目的基因4、酶切位点、抗性基因和pdcov-n基因上游的同源臂；
39.2)电转化打靶片段进行第一轮基因重组得到阳性克隆；
40.3)将步骤2)得到的阳性克隆通过第二轮重组去掉酶切位点和抗性基因得到重组pdcov感染性克隆。
41.其中，所述目的基因3包括nluc基因；所述目的基因4包括p2a-gfp基因。以上目的
基因3或目的基因4可以根据实验目的，如果需要其他报告基因，也可以扩增其他的基因。
42.其中，步骤1)具体包括以下步骤：
43.1.1)pcr扩增含有酶切位点和抗性筛选基因的基因片段3，
44.1.2)以含有目的基因3或目的基因4的质粒为模板，pcr扩增得到目的基因3或目的基因4的前半段；pcr扩增得到目的基因3或目的基因4的后半段；
45.1.3)以目的基因3的前半段与基因片段3为模板，通过overlap pcr扩增得到基因片段4；再以基因片段4和目的基因3的后半段为模板，通过overlap pcr方法扩增同时包含pdcov-m基因下游的同源臂和pdcov-ns6基因下游的同源臂的打靶片段；或以目的基因4的前半段与基因片段3为模板，通过overlap pcr扩增得到基因片段5；再以基因片段5和目的基因3的后半段为模板，通过overlap pcr方法扩增同时包含pdcov-ns6基因下游的同源臂和pdcov-n基因上游的同源臂的打靶片段。
46.其中，所述pdcov-m基因下游的同源臂和pdcov-ns6基因下游的同源臂或pdcov-ns6基因下游的同源臂和pdcov-n基因上游的同源臂的序列如seq id no：4或seq id no：5或seq id no：6或seq id no：7所示。
47.进一步，同源臂与外源基因要插入病毒基因组的位置有关，同源臂的长度需要50bp。
48.i-sec i是一种由内含子编码的归位内切酶，在大肠杆菌中利用l-阿拉伯糖诱导其表达，对核酸内切酶来说，这是一种罕见的切割，并且自然出现的概率极低(1/4^18)。因此，我们选择所述酶切位点为i-scei，其他能够有该功能的内切酶也可以用于本发明。
49.其中，所述抗性基因包括kan，也可以更换为其他的抗性(比如，氨苄等)，但是必须与要编辑的感染性克隆质粒抗性不同。
50.其中，步骤3)具体包括以下步骤：
51.3.1)挑取步骤2)的阳性克隆的单菌落接种于含氯霉素的lb液体培养基中，培养至浑浊；
52.3.2)向其中加入含有2％浓度的l-阿拉伯糖和氯霉素的lb液体培养基，30℃-32℃培养1h。
53.3.3)将步骤3.2)中的菌液放于42℃摇床培养30min-60min；
54.3.4)将步骤3.3)中的菌液置于30℃-32℃摇床继续培养3-4h后，取菌液做稀释，取稀释好的菌液涂布到含有1％浓度的l-阿拉伯糖和氯霉素抗性的lb平板，待菌液充分吸收后，于30℃-32℃细菌培养箱中倒置培养约24h；
55.3.5)挑取步骤3.4)中所得的单菌落分别点涂于含氯霉素抗性和卡那霉素抗性的lb平板中，在卡那霉素抗性lb固体培养基不生长，且在氯霉素lb固体培养基中生长的菌落为重组成功的菌落，即得阳性克隆。
56.本发明内容还包括所述的构建方法获得的重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法。
57.本发明内容还包括所述表达目的基因的pdcov感染性克隆在制备预防或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
58.本发明内容还包括所述表达目的基因的pdcov感染性克隆在制备pdcov疫苗中的应用。
59.本发明的机理：一方面，为了构建pedv gx4/2021株感染性克隆，本发明通过pcr扩增pedv全基因组序列，用酶切连接的方法依次将片段插入pbac-pedv-smf中，得到pedv感染性克隆质粒pbac-pedv。进一步地，利用red重组技术构建3个pedv报告病毒质粒，分别是：将orf3基因替换为nluc或rfp基因的pedv报告病毒质粒pbac-pedv-nluc/orf3、pbac-pedv-rfp/orf3；以及在保留pedv完整基因组的基础上，通过ptv-1 2a基因的自剪切功能，于orf3基因上游插入外源基因gfp的pedv报告病毒质粒pbac-pedv-gfp-orf3。最后，成功拯救3个pedv报告病毒。另一方面，为了构建pdcov gx2021-1株感染性克隆，本发明通过pcr扩增pdcov全基因组序列，用酶切连接的方法依次将片段插入pbelobac11中，得到pdcov感染性克隆质粒pbac-pdcov。进一步地，利用red重组技术构建2个pdcov重组病毒质粒，分别是：将ns6基因替换为nluc基因的pdcov报告病毒质粒pbac-pdcov-nluc/ns6；在保留pdcov完整基因组的基础上，通过ptv-1 2a基因的自剪切功能，于ns6基因下游插入外源基因gfp的pdcov报告病毒质粒pbac-pdcov-ns6-gfp，并成功拯救病毒。
60.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：本发明建立了基于细菌人工染色体的pedv和pdcov反向遗传学系统，通过red同源重组技术，在体外快速高效地编辑pedv基因组和pdcov基因组，为研究病毒的分子生物学特性、致病机理以及开发基因工程疫苗提供有力的技术平台，该方法高效便捷、特异性强，为体外编辑pedv和pdcov基因组及其它冠状病毒基因组的提供了新的方法。
附图说明
61.图1、pedv感染性克隆的构建；
62.图2、pedv拯救病毒的鉴定；
63.图3、pedv报告病毒的构建；
64.图4、pedv报告病毒的鉴定；
65.图5、pdcov感染性克隆的构建；
66.图6、pdcov拯救病毒的鉴定；
67.图7、pdcov报告病毒的构建；
68.图8、pdcov报告病毒的鉴定。
具体实施方式
69.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解：本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解：本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
70.实施例1重组pedv感染性克隆的构建及其应用
71.1、细胞、毒株和菌株
72.pedv-gx4/2021株(genbank登录号：op382083、vero细胞、pbelobac11、pegfp c3、
pet30a、lenticrisprv2、pcaggs、puc57-nluc1、puc57-rfp1、pcaggs-t7-opt2、pmd19-t-gfp-p2a、e.coli gs17833菌株均由本实验室保存。jm109感受态细胞购买自上海唯地生物技术有限公司，并由本实验室保存。
73.参考文献：
74.[1]王敏敏.a型塞内卡病毒的分离鉴定及其感染性克隆的构建[d].扬州大学，2020.doi：10.27441/d.cnki.gyzdu.2020.000376.
[0075]
[2]成赛鹏.猪源piv5毒株的鉴定、单克隆抗体制备与病毒感染性克隆的构建[d].扬州大学，2021.doi：10.27441/d.cnki.gyzdu.2021.002318.
[0076]
[3]tischer bk，smith ga，osterrieder n.en passant mutagenesis：a two step markerless red recombination system.methods mol biol.2010；634：421-430.doi：10.1007/978-1-60761-652-8_30.
[0077]
2、引物设计
[0078]
根据pedv gx4/2021毒株的基因组序列，将pedv全长基因序列分为7个片段(a1(genbank登录号：op382083，位置：1-3514)、a2(genbank登录号：op382083，位置：3486-7521)、b(genbank登录号：op382083，位置：7506-13028)、c1(genbank登录号：op382083，位置：12999-16903)、c2(genbank登录号：op382083，位置：16875-20723)、c3(genbank登录号：op382083，位置：20697-24387)、c4(genbank登录号：op382083，位置：24359-28036))，分别设计上、下游引物(表1)，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
[0079]
表1 pedv全基因组扩增引物
[0080]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)pedv-a1fcgaaacggagtctagactccgtcacttaaagagattttctatctatggpedv-a1rgtcaaaagcaaaaggatccttagtaactgtggapedv-a2fcagtagtgcggccgccagttactaaggatccttttgcttttgactttgcpedv-a2raacgtacgcctcagcaacagcagcattaaaggpedv-bfctgctgttgctgaggctcatcgttacgpedv-brcaagcgcctaccttaattaaaatgctcpedv-c1ftaagagcattttaattaaggtaggcgcttgpedv-c1rcagcctttgaccacctaggatttttagccpedv-c2fggctaaaaatcctaggtggtcaaaggctgpedv-c2ragtgttagctgagcacctggtgacatcpedv-c3fgatgtcaccaggtgctcagctaacactpedv-c3rgtgttttgttaacatcgatgtaatccgggpedv-c4fcccggattacatcgatgttaacaaaacacpedv-c4raggtcggaccgcgaggaggtggag
[0081]
3、pbac-stuf的构建
[0082]
为了引入合适的酶切位点，使用引物对pe-stuf-f和pe-stuf-r，通过无模板pcr扩增得到stuffer片段(seq id no：15)，并利用限制性酶切位点not i和rsr ii将其插入到线性化的pbelobac11中，得到pbac-pedv-stuf，最终引入限制性内切酶位点bamhi，bbvci，paci，avrii，blpi，和clai，用于pedv感染性克隆的构建。其中引物序列为：
[0083]
pe-stuf-f：
[0084]
gctcatcgcggccgctgctgttgctgaggcgtacgttaattaaaccagtccctaggaccaggtgctcagcggat
[0085]
pe-stuf-r：
[0086]
acagcttacggaccgcgaggaggccgcggttctagaatcgatgtaatccgctgagcacctggtcctagggactg
[0087]
4、pedv全基因组序列的扩增
[0088]
提取pedv-gx4/2021的病毒rna，并按iii 1st strand cdna synthesis supermix试剂盒(上海翌圣生物有限公司)的说明书反转录得到cdna。以cdna为模板，使用表1中的引物，将pedv全长基因分为7个片段进行pcr扩增。pcr反应结束后，取2μl产物，利用1％琼脂糖凝胶电泳分析，经凝胶成像系统观察。其余产物于-20℃保存。
[0089]
5、全长感染性克隆的构建
[0090]
将pcr扩增的pedv-gx4/2021株基因组全长片段，通过酶切后，依次连接进入线性化的pbac-pedv-stuf中，并在5’端加入t7和cmv启动子，在3’端添加含有35个a碱基的poly(a)尾，最终得到pedv全长感染性克隆质粒，经dna测序、酶切以及pcr鉴定，结果显示成功构建pedv全长感染性克隆质粒，并命名为pbac-pedv(图1 b，c)。具体的构建过程如图1a所示，首先，片段a1与片段cmv+t7 promoter通过overlappcr扩增出a1-promoter片段，通过not i和bamhi插入到pbac-pedv-stuf,得到pbac-pedv-a1；其次，利用bamh i和bbvc i将片段a2插入到pbac-pedv-a1，得到pbac-pedv-a；再者，利用bbvc i和pac i将片段b插入到pbac-pedv-a中，得到pbac-pedv-ab。利用pac i和avrii将片段c1插入到pbac-pedv-stuf，得到pbac-pedv-c1；利用avrii和blpi将片段c2插入到pbac-pedv-c1，得到pbac-pedv-c12；利用blpi和cla i将片段c3插入到pbac-pedv-c12，得到pbac-pedv-c123；利用cla i和rsrii将片段c4插入到pbac-pedv-c123，得到pbac-pedv-c。最后，利用pac i和rsrii将大片段c从pbac-pedv-c中酶切下来，再插入到用pac i和rsril双酶切线性化的pbac-pedv-ab中，得到pedv感染性克隆质粒pbac-pedv。
[0091]
6、辅助质粒的构建
[0092]
以步骤4得到的pedv的cdna为模板，以pedv基因组序列为模板设计引物，使用引物pedv-n f和pedv-n r扩增的到pedv-n基因片段，通过kpni和xhoi连接至pcaggs中，得到重组质粒pcaggs-pedv-n。其中引物序列为：
[0093]
pedv-n f：caagggtaccatggcttctgtcagttttcagg
[0094]
pedv-n r：caacgagatcttcgacacaggaaattaataactcgaggaac
[0095]
7、pedv报告病毒的构建
[0096]
根据pedv病毒的构建策略(图3a)，外源基因nluc和rfp分别替换orf3基因；另外，在保留pedv完整基因组的基础上，我们利用ptv-1 2a短肽(图3a)的自剪切作用，将gfp插入到orf3基因的5’端。利用red同源重组系统(图3b)，构建pedv报告病毒质粒。本实施例通过第一轮red重组得到的菌落在含有卡那霉素抗性的lb平板上划线，得到纯的中间质粒。再经l-阿拉伯糖诱导发生第二轮重组，并将第二轮重组后的质粒经sanger测序验证即得。
[0097]
具体步骤如下：
[0098]
7.1制备e.coli gs1783电转化感受态细胞，电转化pbac-pedv
[0099]
(1)用无菌的接种环蘸取少量e.coli gs1783甘油菌，在不含抗生素的lb平板上划线，32℃倒置培养过夜。
[0100]
(2)挑取e.coli gs1783单菌落接种于5ml lb液体培养基中，32℃培养过夜，获得复苏菌液。
[0101]
(3)将5ml复苏后的菌液加入50ml lb液体培养基中，于32℃摇床培养至od600值为0.5。
[0102]
(4)将步骤(3)所得菌液置于冰水混合物中冷却20分钟。
[0103]
(5)将步骤(4)中的全部菌液，4℃，3000rpm，离心15分钟，并弃去上清。
[0104]
(6)加入冰上预冷的10％甘油，清洗菌体，4℃，3000rpm，离心15分钟，并弃去上清。重复该步骤3次。
[0105]
(7)向步骤(6)所得菌体中加入预冷的10％甘油定容至500μl，每管50μl分装至预冷的ep管中，获得e.coli gs1783电转化感受态细胞。
[0106]
(8)取一支e.coli gs1783电转化感受态细胞置于冰上，加入100ng感染性克隆质粒pbac-pedv，混匀后加入到冰上预冷的电转杯(1mm
×
1mm)中，轻敲电转杯，使菌体充分沉入电转杯底部，在15kv/cm条件下进行电击。
[0107]
(9)向电转杯中加入900μl无抗性的lb液体培养基中，吸吹数次，并全部转移至无菌的1.5ml离心管中，32℃，160rpm恒温摇床震荡培养2h。
[0108]
(10)取出反应管，5000rpm离心3min。在超净工作台中，吸弃800μl上清，用剩余的培养基重悬菌体，涂布于含有氯霉素抗性的固体lb平板中，倒置于32℃生化培养箱中过夜培养。
[0109]
7.2制备gs1783-pbac-pedv电转感受态细胞
[0110]
(1)挑取gs1783-pbac-pedv单菌落接种于5ml含氯霉素的lb液体培养基中，32℃培养过夜，获得种子菌液。
[0111]
(2)将5ml复苏后的菌液加入50ml含氯霉素的lb液体培养基中，于32℃摇床培养至od600值为0.5。
[0112]
(3)将步骤(2)中所得菌液于42℃摇床培养15min，立即置于冰水混合物中冷却20分钟。
[0113]
(4)将步骤(3)中的全部菌液于4℃，3000rpm，离心15分钟，弃去上清。
[0114]
(5)加入冰上预冷的10％甘油，反复清洗菌体，4℃，3000rpm，离心15分钟，并弃去上清。重复该步骤3次。
[0115]
(6)向步骤(5)所得菌体中加入预冷的10％甘油，定容至500μl，每管50μl分装至预冷的ep管中，获得gs11783-pbac-pedv电转感受态细胞，并放置于-80℃保存。
[0116]
7.3表达nluc基因的pedv全长感染性克隆的构建
[0117]
7.3.1扩增b-nluc-i-scei-kan-c打靶片段
[0118]
(1)构建pmd19-t-i-scei-kan。以pbelobac11为模板，使用引物对i-scei-catpro f和i-scei-catpro r，扩增i-scei-catpro片段；以pet30a为模板，使用引物对kan f和kan r，扩增kana片段；以i-scei-catpro片段和kana片段为模板，使用引物对i-scei-catpro f和kan r，通过overlap pcr扩增得到片段i-scei-kan，再将片段连接进入t载体，最后得到pmd19-t-i-scei-kan。
[0119]
(2)以pmd19-t-i-scei-kan为模板，使用引物i-scei-catpro f和kan r扩增含有i-scei酶切位点和抗性筛选基因的i-scei-kan片段，并切胶纯化。
[0120]
pcr扩增体系为：ddh2o22μl、primestar max premix(2x)25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；pcr扩增条件为：98℃预变性3min、98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃总延伸5min。
[0121]
(3)以puc57-nluc为模板，使用引物pedv-s-nluc f和pe-nluc-a-iscei r扩增得到nluc基因的前半段nluc-1；使用引物pe-nluc-a f和nluc r扩增得到nluc基因的后半段nluc-2。
[0122]
(4)以nluc-1片段与i_scei-kan片段为模板，以pedv-s-gfp f2和kan r作为引物，overlappcr扩增得到nluc-1-i-scei-kan片段；再以nluc-1-i-scei-kan片段和nluc-2片段为模板，以pedv-s-gfp f2和pedv-nluc-orf3 r2作为引物，通过overlap pcr方法扩增同时包含pedv-s基因下游的50bp同源臂以及pedv-orf3基因下游的50bp同源臂的打靶片段b-nluc-i-scei-kan-c，并进行切胶纯化。
[0123]
7.3.2电转化打靶片段b-nluc-i-scei-kan-c进行打靶
[0124]
(1)从-80℃冰箱取出一支gs1783-pbac-pedv电转感受态细胞，放在冰上融化，向50gl电转化感受态细胞中加入100ng打靶片段b-nluc-i-scei-kan-c，混匀后加入到冰上预冷的电转杯(1mm
×
1mm)中，轻敲电转杯，使菌体充分沉入电转杯底部，在15kv/cm条件下进行电击。
[0125]
(2)向电转杯中加入900μl无抗性的lb液体培养基中，吸吹数次，并全部转移至无菌的1.5ml离心管中，32℃，160rpm恒温摇床震荡培养2h。
[0126]
(3)取出离心管，5000rpm离心3min，并在超净工作台中，吸弃800μl上清，用剩余的液体重悬菌体，涂布于含有卡那霉素和氯霉素双抗生素抗性的固体lb平板中，倒置于32℃生化培养箱中培养24h。
[0127]
(4)以步骤(3)所获得的单菌落为模板，以pedv-s-gfp f2和pedv-nluc-orf3 r2作为引物，菌落pcr扩增包括打靶片段b-nluc-i-scei-kan-c在内的目的片段，鉴定第一轮重组率并确定阳性菌落。进一步地，将阳性菌落在含有卡那霉素的lb平板中划线纯化，获得阳性克隆子pbac-pedv-nluc/orf3-kan。
[0128]
7.3.3第二轮重组去掉i-scei-kan基因
[0129]
(1)挑取pbac-pedv-nluc/orf3-kan单菌落接种于2ml含氯霉素的lb液体培养基中，放于32℃摇床培养至浑浊。
[0130]
(2)向其中加入2ml含有2％l-阿拉伯糖和氯霉素的lb液体培养基，32℃培养1h。
[0131]
(3)将步骤(2)中的菌液放于42℃摇床培养30min。
[0132]
(4)将步骤(3)中的菌液置于32℃摇床继续培养3h后，取100μl菌液做104倍稀释，取200μl稀释好的菌液涂布到含有1％l-阿拉伯糖和氯霉素抗性的lb平板，待菌液充分吸收后，于32℃细菌培养箱中倒置培养约24h。
[0133]
(5)挑取步骤(4)中所得的单菌落分别点涂于含氯霉素抗性和卡那霉素抗性的lb平板中。在卡那霉素抗性lb固体培养基不生长，且在氯霉素lb固体培养基中生长的菌落为重组成功的菌落，并将获得的阳性克隆命名为pbac-pedv-nluc/orf3，通过dna测序验证重组质粒是否构建成功。
[0134]
7.4表达rfp基因的pedv全长感染性克隆质粒的构建
[0135]
7.4.1扩增b-rfp-i-scei-kan-c打靶片段
[0136]
(1)i-scei-kan片段的扩增同7.3.1(2)。
[0137]
(2)以puc57-rfp为模板，使用引物pedv-s-rfp f和pe-rfp-a-iscei r扩增得到rfp基因的前半段rfp-1；使用引物pe-rfp-a f和rfp r扩增得到rfp基因的后半段rfp-2。
[0138]
(3)以rfp-1片段与i-scei-kan片段为模板，以pedv-s-gfpf2和kanr作为引物，overlappcr扩增得到rfp-1-i-scei-kan片段；再以rfp-1-i-scei-kan片段和rfp-2片段为模板，以pedv-s-gfp f2和pedv-nluc-orf3 r2作为引物，通过overlap pcr方法扩增同时包含pedv-s基因下游的50bp同源臂以及pedv-orf3基因下游的50bp同源臂的打靶片段b-rfp-i-scei-kan-c，并进行切胶纯化。
[0139]
7.4.2电转化打靶片段b-rfp-i-scei-kan-c进行打靶
[0140]
方法同7.3.2。该步骤中打靶片段为b-rfp-i-scei-kan-c，获得的阳性克隆子命名为pbac-pedv-rfp/orf3-kan。
[0141]
7.4.3第二轮重组去掉i-scei-kan基因
[0142]
同7.3.3。通过测序鉴定获得阳性克隆是否正确，并将其命名为pbac-pedv-rfp/orf3。
[0143]
7.5表达gfp基因的pedv全长感染性克隆的构建
[0144]
7.5.1扩增b-gfp-i-scei-kan-c打靶片段
[0145]
(1)i-scei-kan片段的扩增同7.3.1(2)。
[0146]
(2)构建pmd19-t-gfp-p2a。以pegfp c3质粒为模板，使用引物对gfp f和gfp r，扩增片段gfp，以lenticrispr v2质粒为模板，使用引物对p2af和p2ar，扩增片段p2a；以片段gfp和片段p2a为模板通过overlap pcr扩增得到片段gfp-p2a，再将片段gfp-p2a连接至t载体，得到pmd19-t-gfp-p2a。
[0147]
(2)以pmd19-t-gfp-p2a为模板，使用引物pedv-s-gfp f和pe-gfp-a-iscei r扩增得到gfp基因的前半段gfp-1；使用引物pe-gfp-a f和p2a-pe-orf3 r扩增得到gfp基因的后半段gfp-2。
[0148]
(3)以gfp-1片段与i-scei-kan片段为模板，以pedv-s-gfpf2和kanr作为引物，overlappcr扩增得到gfp-1-i-scei-kan片段；再以gfp-1-i-scei-kan片段和gfp-2片段为模板，以pedv-s-gfp f2和p2a-pe-orf3 r2作为引物，通过overlap pcr方法扩增包含pedv-s基因下游的50bp同源臂以及pedv-orf3基因上游的50bp同源臂的打靶片段b-gfp-i-scei-kan-c，并进行切胶纯化。
[0149]
7.5.2电转化打靶片段进行打靶
[0150]
方法同7.3.2。该步骤中打靶片段为b-gfp-i-scei-kan-c，菌落pcr鉴定所使用的引物为和e r获得的阳性克隆子命名为pbac-pedv-gfp-orf3-kan。
[0151]
7.5.3第二轮重组去掉i-scei-kan基因
[0152]
同7.3.3。通过测序鉴定获得阳性克隆是否正确，并将其命名为pbac-pedv-gfp-orf3。
[0153]
表2扩增打靶片段引物
[0154][0155][0156]
其中，第一轮red重组的重组率可达80％以上(91.7％(nluc)，80.0％(rfp)，81.25％(gfp))(表3)。重组率＝(阳性菌落个数/检测菌落总个数)*100％。
[0157]
表3第一轮red重组率
[0158]
名称第一轮red重组率pbac-pedv-nluc/orf391.7％(11/12)pbac-pedv-rfp/orf380.0％(12/15)pbac-pedv-gfp-orf381.25％(13/16)
[0159]
经sanger测序验证pedv报告病毒质粒pbac-pedv-nluc/orf3，pbac-pedv-rfp/orf3和pbac-pedv-gfp-orf3均构建成功(图3c)。
[0160]
8、重组病毒的拯救
[0161]
(1)将包含重组病毒质粒pbac-pedv-nluc/orf3，pbac-pedv-rfp/orf3或pbac-pedv-gfp-orf3的阳性菌落扩大培养后，使用质粒中提试剂盒提取质粒。
[0162]
(2)将生长状态良好的vero细胞均匀铺到6孔板中，待细胞密度达到70％时，按照3000试剂说明书进行转染。
[0163]
(3)每孔的质粒用量为：pcaggs-t7-opt 0.3μg，辅助质粒pcaggs-pedv-n 0.2μg，感染性cdna克隆质粒(pbac-pedv，pbac-pedv-nluc/orf3，pbac-pedv-rfp/orf3或pbac-pedv-gfp-orf3)1.5μg。转染6h后，将细胞培养基更换为新鲜的含10％fbs的dmem培养基，并
在转染24h后，将细胞培养上清弃掉，用灭菌的pbs缓冲液(0.01m，ph＝7.2)清洗细胞单层2次，加入含有2μg/ml胰酶的dmem培养基。重组质粒pcaggs-t7-opt，pcaggs-pedv-n以及感染性cdna克隆质粒转染至vero细胞2天后，收取细胞上清再次感染新鲜的vero细胞(图2a)。
[0164]
(4)待细胞出现典型病变或者特异性荧光后，收取细胞培养上清，获得拯救病毒分别命名为rpedv，rpedv-nluc/orf3，rpedv-rfp/orf3，rpedv-gfp-orf3，标记为p0代。将拯救病毒在vero细胞连续传代，并把每一代病毒液标记后，于-80℃保存。
[0165]
9、重组病毒的鉴定
[0166]
9.1间接免疫荧光鉴定
[0167]
将野生型pedv、拯救的病毒rpedv、rpedv-nluc/orf3，rpedv-rfp/orf3和rpedv-gfp-orf3分别感染vero细胞，24h固定细胞，使用抗pedv-n蛋白的单克隆抗体进行检测。具体步骤如下：
[0168]
(1)将生长状态良好的vero细胞均匀铺到6孔板中，待细胞密度达到90％时，用灭菌的pbs缓冲液(0.01m，ph＝7.2)清洗细胞单层2次，取p0代拯救病毒液100μl接种于细胞单层，同时设置不接种病毒液孔，于37℃，5％的co2恒温培养箱孵育2h后，吸弃上清，加入含2μg/ml胰酶的dmem培养基，继续培养36h，收取细胞培养上清，标记为p1代。
[0169]
(2)将收取完上清的细胞单层用pbs洗涤1次，预冷的4％多聚甲醛室温固定10min，用pbs洗涤2次。
[0170]
(3)加入预冷的含0.1％tritonx-100和2％bsa的pbs溶液，室温下破膜、封闭30min，用pbs洗涤2次。
[0171]
(4)加入1：2000倍稀释的anti-pedv-n mab，37℃孵育1h，pbs洗3次。
[0172]
(5)加入1：2000倍稀释的dylight 488或549标记的羊抗鼠igg二抗，37℃避光孵育1 h，pbs洗3次。
[0173]
(6)加入1∶10稀释dapi染色液，室温孵育5min，用pbs洗3次，加适量pbs，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。
[0174]
结果显示，在荧光显微镜下可以观察到特异性荧光，而对照细胞无特异性荧光(图2b)，表明病毒感染的细胞中有n蛋白的表达，证明我们成功拯救了pedv病毒。
[0175]
rpedv-nluc/orf3组可以倒置荧光显微镜下看到特异性绿色荧光；rpedv-rfp/orf3组倒置荧光显微镜下不但可以看到特异性红色荧光(rfp基因表达)还可以看到特异性绿色荧光(n基因表达)；rpedv-gfp-orf3组在倒置荧光显微镜下不但可以观察到特异性绿色荧光(gfp基因表达)，还可以看到特异性红色荧光(n基因表达)，而对照细胞无特异性荧光(图4a)。综上，我们成功拯救了表达外源基因的pedv报告病毒。
[0176]
9.2western blot鉴定
[0177]
取pedv、rpedv、rpedv-nluc/orf3、rpedv-rfp/orf3和rbac-pedv-gfp-orf3(p1代)病毒液，以moi＝0.01分别感染vero细胞，24h后收取蛋白样品，进行western blot鉴定。其中，一抗使用抗pedv-n单克隆抗体，二抗使用hrp标记的羊抗鼠单克隆抗体。结果显示，病毒感染组均可以检测到n蛋白的表达，而空白细胞检测不到n蛋白的表达(图2c、图4b)。
[0178]
10、病毒的生物学特性鉴定
[0179]
为了解拯救病毒的生长特性，对野生型pedv和rpedv；rpedv、rpedv-nluc/orf3、rpedv-rfp/orf3和rpedv-gfp-orf3分别进行了表型以及生长动力学分析。
[0180]
10.1多步生长曲线
[0181]
(1)将vero细胞均匀铺到6孔板中，待细胞密度达到90％，感染病毒。
[0182]
(2)将pedv、rpedv、ppedv-nluc/orf3、rpedv-rfp/orf3和rpedv-gfp-orf3分别以moi＝0.001感染vero细胞，37℃培养箱孵育2h后，弃去上清，pbs清洗2次，加入2ml含2μg/ml胰酶的dmem培养基，继续培养。每个病毒设置2个复孔。
[0183]
(3)分别在病毒感染后6h、12h、24h和36h，收集病毒上清于-80℃保存备用。
[0184]
(4)将收集的病毒液用含2μg/ml胰酶的dmem培养基进行10倍梯度稀释，把铺于96孔板中的vero细胞用pbs洗2次，将稀释好的病毒液加入到96孔板中，每孔加入100μl，每个稀释度设置4个复孔。逐日观察病变，于感染后48h进行间接免疫荧光检测，使用reed-muench方法计算tcid
50
，并绘制病毒的生长曲线。
[0185]
生长动力学曲线结果表明，rpedv与pedv的滴度均在24h达到最高，具有相似的复制能力和生长特性(图2d)。rpedv-gfp-orf3与rpedv具有相似的生长特性，其毒价均在24h到达最高(3
×
105tcid
50
/ml)，rpedv-nluc/orf3，rpedv-rfp/orf3与rpedv相比，其最高毒价下降0.51g(图4c)。
[0186]
10.2病毒蚀斑试验
[0187]
(1)将vero均匀铺至12孔板中，待细胞密度大于90％时，弃去上清，并用灭菌的pbs清洗细胞单层2遍。
[0188]
(2)将pedv、rpedv和pedv报告病毒(rpedv-nluc/orf3，rpedv-rfp/orf3和rpedv-gfp-orf3)的病毒液以moi＝0.0001分别感染细胞，同时设置正常细胞作为阴性对照。37℃培养箱孵育2h后，弃去上清，pbs清洗2次。
[0189]
(3)将预热的2％低熔点琼脂与2
×
dmem(含20％tpb、4μg/ml胰酶)进行1∶1混匀，并按照每孔2ml加入到细胞单层中，室温静置1 h，将细胞培养板倒置放入37℃培养箱继续培养36h。
[0190]
(4)用含有0.5％结晶紫的醇溶液，室温过夜固定和染色。弃去染色液和琼脂后，用清水清洗细胞板，观察空斑的形态和大小，并拍照记录。
[0191]
空斑实验表明，rpedv和pedv都可以在vero细胞上形成空斑，并且空斑的形态大小相似(图2e)。rpedv-nluc/orf3，rpedv-rfp/orf3和rpedv-gfp-orf3都可以在vero细胞上形成空斑，并且空斑的形态大小与rpedv相似(图4d)。
[0192]
10.3rt-pcr分析外源基因的稳定性
[0193]
为了检测外源基因(nluc，rfp和gfp)的遗传稳定性，将报告病毒rpedv-nluc/orf3，rpedv-rfp/orf3和rpedv-gfp-orf3在vero细胞上连续传代11次，获得不同代次的病毒液。在传代期间观察红色或者绿色荧光的稳定性，发现荧光较稳定。通过rt-pcr及sanger测序的方法鉴定外源基因的稳定性。具体步骤如下：
[0194]
将收取的p0代rpedv-nluc/orf3，rpedv-rfp/orf3和rpedv-gfp-orf3病毒液在vero细胞上连续传代至p9代。分别取p3、p9代病毒液，提取病毒rna，并反转录为cdna。以pbac-pedv-nluc/orf3为阳性对照，用引物nluc f和nluc r进行rt-pcr，扩增nluc基因(516bp)；以pbac-pedv-rfp/orf3为阳性对照，用引物rfpf和rfpr进行rt-pcr，扩增rfp基因(711bp)；以pbac-pedv-gfp-orf3为阳性对照，通过引物gfp f和gfp r进行rt-pcr，扩增gfp基因(720bp)。最后，通过sanger测序来检测nluc，rfp以及gfp基因在pedv报告病毒中的遗
传稳定性。引物序列：
[0195]
nluc f：atggtcttcacactcgaagatttcgttg
[0196]
nluc r：gtgcgaacgcattctggcgtaa
[0197]
rfp f：atggtgtctaagggcgaagagc
[0198]
rfp r：gcaaactggggcacaaacttaattaa
[0199]
结果显示，在vero细胞上获得的p3和p9代pedv报告病毒的病毒液，其pcr产物大小与预计相符(图4e)；sanger测序结果显示，外源基因均未发生缺失或突变。以上结果表明，表达外源基因nluc，rfp或gfp基因的pedv报告病毒均可以在vero细胞上至少稳定传至9代。
[0200]
实施例2重组pdcov感染性克隆的构建及其应用
[0201]
1、细胞、毒株和菌株
[0202]
pdcov-gx2021-1株(genbank登录号：oq547740)、llc-pk1细胞、pegfp c3、pet30a、lenticrispr v2、pbelobac11、pcaggs-t7-opt、e.coli gs1783菌株均由本实验室保存。jm 109感受态细胞购买自上海唯地生物技术有限公司，并由本实验室保存。
[0203]
2、引物设计
[0204]
根据pdcov gx2021-1毒株的基因序列(genbank登录号：oq547740)，将pdcov全长基因分为8个片段(片段2a(genbank登录号：op382083，位置：4079-8324)、2b(genbank登录号：op382083，位置：8296-11658)，片段3(genbank登录号：op382083，位置：11628-15880)，片段4(genbank登录号：op382083，位置：15852-20628)，片段f(genbank登录号：op382083，位置：1-2028)、g(genbank登录号：op382083，位置：2019-4106)、m(genbank登录号：op382083，位置：22926-25422)、n(genbank登录号：op382083，位置：20234-22948))，分别设计上、下游引物(表4)，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
[0205]
表4pdcov全基因组扩增引物
[0206][0207][0208]
3、pbac-stuf的构建
[0209]
为了引入合适的酶切位点，使用引物对pd-stuf-f和pd-stuf-r通过pcr扩增得到stuffer片段(seq id no：9)，并利用限制性酶切位点not i和rsrii将其插入到线性化的pbelobac11中，得到pbac-pdcov-stuf，最终引入限制性内切酶位点sph i，bsiwi，saci，bstbi，pmei，bcvc i，swai和avrii，用于pdcov感染性克隆的构建。其中引物序列为：
[0210]
pd-stuf-f：
[0211]
cccgggcggccgctccactcgcatgcgtgcttgcgtacgacagactgagctcatagcatttcgaagagatgagtttaaacgatgtc
[0212]
pd-stuf-r：
[0213]
caaatgccggaccgtaccaaccctagggatgacgatttaaatcacgagagctgaggtgacatcgtttaaactcatctcttcgaaa
[0214]
4、pdcov全基因组序列的扩增
[0215]
提取pdcov gx2021-1的病毒rna，并按iii lst strand cdna synthesis supermix试剂盒(上海翌圣生物有限公司)说明书反转录得到cdna。以cdna为模板，使用表1中的引物，将pdcov全长基因分为8个片段进行pcr扩增。pcr反应结束后，取2μl产物，利用1％琼脂糖凝胶电泳分析，经凝胶成像系统观察。其余产物于-20℃保存。
[0216]
5、感染性克隆的构建
[0217]
将纯化的片段利用限制性酶切位点，顺次连接进入线性化的pbac-pdcov-stuf中(图5a)，并在5’端加入t7和cmv启动子，在3’端添加含有35个a碱基的poly(a)尾，最终得到pdcov全长感染性克隆质粒，并将其命名为pbac-pdcov。具体构建过程如图5a所示，以片段cmv+t7promoter和片段f为模板，使用pd-1f和pd-2727r，通过overlap pcr得到片段1ef，并利用noti和sphi将其插入到pbac-stuf得到pbac-pd-1ef；再使用sphi和bsiwi将片段g插入到pbac-pd-1ef，得到pbac-pd-1。使用引物对pa-f1和pa-r1进行无模板pcr得到含有poly a的片段p，以片段p和片段m为模板，使用引物pd-23607f和pd-26186r进行overlap pcr得到片段mp，并利用avrii和rsrii插入到pbac-pdcov-stuf，得到pbac-pd-5mp；再使用swai和avrii将片段n插入到pbac-pd-5mp，得到pbac-pd-5。使用bsiwi和saci以及saci和bstbi将片段2a和2b顺次插入到pbac-stuf，得到pbac-pd-2。最后利用限制性内切酶将片段1、片段3、片段4、片段5顺次连接到pbac-pd-2中，得到pdcov感染性克隆质粒，pbac-pdcov。经dna测序以及pcr鉴定(图5b)，结果显示成功构建pdcov全长感染性克隆质粒，并命名为pbac-pdcov。
[0218]
6、辅助质粒的构建
[0219]
以步骤4得到的pdcov的cdna为模板，使用引物pdcov-n f和pdcov-n r扩增的到pdcov-n基因片段，通过kpni和xhoi连接至pcaggs中，得到重组质粒pcaggs-pdcov-n。其中引物序列为：
[0220]
pdcov-n f：caagggtaccatggctgcaccagtagtcc
[0221]
pdcov-n r：gttcctcgagctacgctgctgattcctgctttatc
[0222]
7、pdcov报告病毒的构建
[0223]
根据pdcov病毒的构建策略(图7a)，外源基因nluc替换ns6基因；另外，利用ptv-1 2a短肽的自剪切作用，在保留pdcov完整基因组的基础上，将gfp插入到ns6基因的3’端。利用red同源重组系统(图7b)，构建pdcov重组病毒质粒。将发生第一轮red重组的菌落在含有
r，扩增kana片段；以i-scei-catpro片段和kana片段为模板，使用引物对i-scei-catpro f和kan r，通过overlap pcr扩增得到片段i-scei-kan，再将片段连接进入t载体，最后得到pmd19-t-i-scei-kan。
[0245]
(2)以pmd19-t-i-scei-kan为模板，使用引物i-scei-catpro f和kan r扩增含有i-scei酶切位点和抗性筛选基因的i-scei-kan片段，并切胶纯化。
[0246]
pcr扩增体系为：ddh2o22μl、primestarmax premix(2x)25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；pcr扩增条件为：98℃预变性3min、98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃总延伸5min。
[0247]
(3)以puc57-nluc为模板，使用引物pd-nluc f和pd-nluc-a-iscei r扩增得到nluc基因的前半段nluc-1；使用引物pd-nluc-a f和pd-nluc r1扩增得到nluc基因的后半段nluc-2。
[0248]
(4)以nluc-1片段与i scei-kan片段为模板，以pd-nluc f2和kan r作为引物，overlap pcr扩增得到nluc-1-i-scei-kan片段；再以nluc-1-i-scei-kan片段和nluc-2片段为模板，以pd-nluc f2和pd-nluc r2作为引物，通过overlap pcr方法扩增同时包含pdcov-m基因下游的50bp同源臂以及pdcov-ns6基因下游的50bp同源臂的打靶片段b-nluc-i-scei-kan-c，并进行切胶纯化。
[0249]
7.3.2电转化打靶片段b-nluc-i-scei-kan-c进行打靶
[0250]
(1)从-80℃冰箱取出一支gs1783-pbac-pdcov电转感受态细胞，放在冰上融化，向50μl电转化感受态细胞中加入100ng打靶片段b-nluc-i-scei-kan-c，混匀后加入到冰上预冷的电转杯(1mm
×
1 mm)中，轻敲电转杯，使菌体充分沉入电转杯底部，在15kv/cm条件下进行电击。
[0251]
(2)向电转杯中加入900μl无抗性的lb液体培养基中，吸吹数次，并全部转移至无菌的1.5ml离心管中，32℃，160rpm恒温摇床震荡培养2h。
[0252]
(3)取出离心管，5000rpm离心3min，并在超净工作台中，吸弃800μl上清，用剩余的液体重悬菌体，涂布于含有卡那霉素和氯霉素双抗生素抗性的固体lb平板中，倒置于32℃生化培养箱中培养24h。
[0253]
(4)以步骤(3)所获得的单菌落为模板，以pd-nluc f2和pd-nluc r2作为引物，菌落pcr扩增包括打靶片段b-nluc-i-scei-kan-c在内的目的片段，鉴定第一轮重组成功的阳性菌落。进一步地，将阳性菌落在含有卡那霉素的lb平板中划线纯化，获得阳性克隆子pbac-pdcov-nluc/ns6-kan。
[0254]
7.3.3第二轮重组去掉i-scei-kan基因
[0255]
(1)挑取pbac-pdcov-nluc/ns6-kan单菌落接种于2ml含氯霉素的lb液体培养基中，放于32℃摇床培养至浑浊。
[0256]
(2)向其中加入2ml含有2％l-阿拉伯糖和氯霉素的lb液体培养基，32℃培养1h。
[0257]
(3)将步骤(2)中的菌液放于42℃摇床培养30min。
[0258]
(4)将步骤(3)中的菌液置于32℃摇床继续培养约3h后，取100μl菌液做104倍稀释，取200μl稀释好的菌液涂布到含有1％l-阿拉伯糖和氯霉素抗性的lb平板，待菌液充分吸收后，于32℃细菌培养箱中倒置培养约24h。
[0259]
(5)挑取步骤(4)中所得的单菌落分别点涂于含氯霉素抗性和卡那霉素抗性的lb
平板中。在卡那霉素抗性lb固体培养基不生长，且在氯霉素lb固体培养基中生长的菌落为重组成功的菌落，并将获得的阳性克隆命名为pbac-pdcov-nluc/ns6，通过dna测序验证重组质粒是否构建成功。7.4表达gfp基因的pdcov全长感染性克隆质粒的构建
[0260]
7.4.1构建pmd 19-t-p2a-gfp
[0261]
以lenticrispr v2为模板扩增片段p2a，以pegfp c3为模板扩增片段gfp；以片段p2a和片段gfp为模板通过overlap pcr扩增得到片段p2a-gfp，再将片段p2a-gfp连接至t载体，得到pmd 19-t-p2a-gfp。
[0262]
7.4.2扩增b-gfp-i-scei-kan-c打靶片段
[0263]
(1)i-scei-kan片段的扩增同7.3.2。
[0264]
(2)构建pmd19-t-p2a-gfp。以lenticrispr v2质粒为模板，使用引物对p2a f和p2a r，扩增片段p2a，以pegfpc3质粒为模板，使用引物对gfpf和gfpr，扩增片段gfp；以片段p2a和片段gfp为模板通过overlap pcr扩增得到片段p2a-gfp，再将片段p2a-gfp连接至t载体，得到pmd19-t-p2a-gfp。
[0265]
(3)以pmd19-t-p2a-gfp为模板，使用引物pd-ns6-p2a f1和pd-ns6-gfp-a-isceir扩增得到gfp基因的前半段p2a-gfp-1；使用引物pd-ns6-gfp-a f和pd-ns6-p2a-gfp r1扩增得到gfp基因的后半段gfp-2。
[0266]
(4)以pbac-pdcov为模板，使用引物pd-ns6-3 f和pd-ns6-3 r扩增ns6基因3’端的基因，命名为ns6-3片段。
[0267]
(5)以p2a-gfp-1片段与i-scei-kan片段为模板，以pd-ns6-p2a f1和kanr作为引物，overlappcr扩增得到gfp-1-i-scei-kan片段；再以gfp-1-i-scei-kan片段、gfp-2片段和ns6-3片段为模板，以pd-ns6-p2a f2和pd-ns6-3 r作为引物，通过overlap pcr方法扩增包含pdcov-ns6基因下游的50bp同源臂以及pdcov-n基因上游的50bp同源臂的打靶片段b-p2a-gfp-i-scei-kan-c，并进行切胶纯化。
[0268]
7.4.3电转化打靶片段b-p2a-gfp-i-scei-kan-c进行打靶
[0269]
方法同7.3.3。该步骤中打靶片段为b-gfp-i-scei-kan-c，菌落pcr所使用的引物为pd-ns6-p2af2和pd-ns6-3 r，获得的阳性克隆子命名为pbac-pdcov-ns6-p2a-gfp-kan。
[0270]
7.4.4第二轮重组去掉i-scei-kan基因
[0271]
同7.3.4。通过测序鉴定获得阳性克隆是否正确，并将其命名为pbac-pdcov-ns6-p2a-gfp。
[0272]
表5扩增打靶片段引物
[0273][0274]
其中，第一步red重组的重组率可达86％以上(nluc(13/15)，gfp(14/15))经sanger测序证明pdcov重组病毒质粒pbac-pdcov-nluc/ns6和pbac-pdcov-ns6-gfp均构建成功(图7c)。
[0275]
8、重组病毒的拯救
[0276]
(1)将包含重组病毒质粒pbac-pdcov-nluc/ns6以及pbac-pdcov-ns6-gfp的阳性菌落扩大培养后，使用质粒中提试剂盒提取质粒。
[0277]
(2)将生长状态良好的llc-pk1细胞均匀铺到6孔板中，待细胞密度达到70％-80％时，按照3000试剂说明书进行转染。
[0278]
(3)每孔的质粒用量为：pcaggs-t7-opt 0.3μg，辅助质粒pcaggs-pdcov-n 0.2μg，感染性cdna克隆质粒(pbac-pdcov，pbac-pdcov-nluc/ns6或pbac-pdcov-ns6-gfp)1.5μg。转染4-6h后，将细胞培养基更换为新鲜的含10％fbs的dmem培养基，并在转染24h后，将细胞培养上清弃掉，用灭菌的pbs缓冲液(0.01m，ph＝7.2)清洗细胞单层2次，加入含有1μg/ml胰酶的dmem培养基，继续培养4天(图6a)，待细胞出现典型病变或者特异性荧光后，收取细胞培养上清，获得拯救病毒分别命名为rpdcov，rpdcov-nluc/ns6，rpdcov-ns6-gfp，标记为p0代。
[0279]
(4)将收取的p0代病毒液在llc-pk1细胞连续传代，并把每一代病毒液标记后，于-80℃保存。
[0280]
9、重组病毒的鉴定
[0281]
9.1间接免疫荧光鉴定
[0282]
将亲本病毒pdcov，拯救的病毒rpdcov，rpdcov-nluc/ns6，和rpdcov-ns6-gfp分别感染llc-pk1细胞，24h后固定细胞，分别感染llc-pk1细胞，24h固定细胞，使用抗pdcov-ns6蛋白的单克隆抗体或者抗pdcov-s蛋白的单克隆抗体进行检测，二抗使用dylight 488标记
muench方法计算tcid
50
，并绘制病毒的生长曲线。生长动力学曲线结果表明，rpdcov和pdcov都可以在llc-pk1细胞上生长，其滴度均在48h达到最高(10
7.5
tcid
50
/ml)，具有相似的复制能力和生长特性(图6d)。rpdcov-ns6-gfp与rpdcov具有相似的生长特性，其毒价均在48h到达最高；rpdcov-nluc/ns6与rpdcov相比，其最高毒价下降约21g(图8c)。

技术特征：
1.一种重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)扩增打靶片段：所述打靶片段的结构依次包含pedv-s基因下游的同源臂、目的基因1、酶切位点、抗性基因和pedv-orf3基因下游的同源臂；或所述打靶片段的结构依次包含pedv-s基因下游的同源臂、目的基因2、酶切位点、抗性基因和pedv-orf3基因上游的同源臂；2)电转化打靶片段进行第一轮基因重组得到阳性克隆；3)将步骤2)得到的阳性克隆通过第二轮重组去掉酶切位点和抗性基因得到重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述目的基因1包括nluc基因或rfp基因；所述目的基因2包括gfp-p2a基因。3.根据权利要求1或2的重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，步骤1)具体包括以下步骤：1.1)pcr扩增含有酶切位点和抗性筛选基因的基因片段1；1.2)以含有目的基因1或目的基因2的质粒为模板，pcr扩增得到目的基因1或目的基因2的前半段；pcr扩增得到目的基因1或目的基因2的后半段；1.3)以目的基因1的前半段与基因片段1为模板，通过overlap pcr扩增得到基因片段2；再以基因片段2和目的基因1的后半段为模板，通过overlap pcr方法扩增同时包含pedv-s基因下游的同源臂和pedv-orf3基因下游的同源臂的打靶片段；或以目的基因2的前半段与基因片段1为模板，通过overlap pcr扩增得到基因片段3；再以基因片段3和目的基因2的后半段为模板，通过overlap pcr方法扩增同时包含pedv-s基因下游的同源臂和pedv-orf3基因上游的同源臂的打靶片段。4.根据权利要求1所述的重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述pedv-s基因下游的同源臂和pedv-orf3基因下游的同源臂或pedv-orf3基因上游的同源臂的序列如seq id no：1或seq id no：2或seq id no：3所示。5.根据权利要求1所述的重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述酶切位点包括i-scei、所述抗性基因包括kan或者与感染性克隆质粒抗性不同的其他抗性基因。6.根据权利要求1所述的重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，步骤3)具体包括以下步骤：3.1)挑取步骤2)的阳性克隆的单菌落接种于含氯霉素的lb液体培养基中，培养至浑浊；3.2)向其中加入含有2％浓度的l-阿拉伯糖和氯霉素的lb液体培养基，30℃-32℃培养1h。3.3)将步骤3.2)中的菌液放于42℃摇床培养30min-60min；3.4)将步骤3.3)中的菌液置于30℃-32℃摇床继续培养3-4h后，取菌液做稀释，取稀释好的菌液涂布到含有1％l-阿拉伯糖和氯霉素抗性的lb平板，待菌液充分吸收后，于30℃-32℃细菌培养箱中倒置培养约24h；3.5)挑取步骤3.4)中所得的单菌落分别点涂于含氯霉素抗性和卡那霉素抗性的lb平板中，在卡那霉素抗性lb固体培养基不生长，且在氯霉素lb固体培养基中生长的菌落为重
组成功的菌落，并将获得的阳性克隆即得。7.权利要求1-6任一项所述的构建方法获得的表达目的基因的pedv感染性克隆。8.权利要求7所述表达目的基因的pedv感染性克隆在制备预防或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。9.权利要求7所述表达目的基因的pedv感染性克隆在制备pedv疫苗中的应用。

技术总结
本发明公开了重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法及其感染性克隆和应用，包括以下步骤：第一轮基因重组扩增打靶片段；电转化打靶片段得到阳性克隆；将得到的阳性克隆通过第二轮重组去掉酶切位点和抗性基因得到表达目的基因的PEDV感染性克隆。本发明建立了基于细菌人工染色体的PEDV反向遗传学系统，通过Red同源重组技术，在体外快速高效地编辑PEDV基因组，为研究病毒的分子生物学特性、致病机理以及开发基因工程疫苗提供有力的技术平台，该方法高效便捷、特异性强，为体外编辑PEDV基因组及其它病毒基因组提供了新的方法。因组及其它病毒基因组提供了新的方法。


技术研发人员：陈振海 潘朔楠 牟春晓 陈密 包文斌
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/22