一种癌细胞特异性T细胞的检测试剂盒的制作方法

一种癌细胞特异性t细胞的检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种癌细胞特异性t细胞的检测试剂盒。


背景技术：

2.t细胞尤其是癌细胞特异性t细胞发挥着抗癌主力军的作用。t细胞是机体特异性识别和杀灭癌细胞的主要细胞，每一种癌细胞特异性t细胞的克隆可以特异性识别一种抗原表位。癌症患者体内尤其是经过免疫治疗或者放疗的患者体内都含有一定数量的癌细胞特异性t细胞，因而检测癌症患者体内癌细胞特异性t细胞数量就显得尤为重要，尤其是如何做到准确全面的检测癌症患者体内的癌细胞特异性t细胞。发明人之前提出过使用负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子或微米粒子辅助检测癌细胞特异性t细胞(申请号202011027741.0，肿瘤特异性t细胞的检测方法)，但是在上述检测体系中使用的是同种癌症且同一亚型的癌细胞系或者肿瘤组织，而在实际应用中，可能没办法得到待检测患者的相同的癌细胞或者肿瘤组织样本，因而如何在没办法得到癌症患者本身癌细胞或肿瘤组织的情况下准确全面的检测癌症患者体内的癌细胞特异性t细胞就成为一个难题。为了解决上述问题，申请人提出本发明。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供了一种使用负载多种癌细胞或者多个患者肿瘤组织的全细胞抗原的纳米粒子(np)或微米粒子(mp)，间接激活杀伤性(效应性)癌细胞特异性t细胞(t
eff
)后，利用其被激活后的特异性标志物，定性和定量检测该部分癌细胞特异性t细胞的方法。有效地解决了在没办法获得癌症患者自身癌细胞或肿瘤组织的情况下，如何制备负载癌细胞抗原的纳米粒子或微米粒子，用于检测检测外周血、外周免疫器官或肿瘤浸润淋巴细胞中具有识别和杀伤癌细胞能力的广谱和多克隆的癌细胞特异性t细胞的问题。
4.本发明的第一个目的是提供一种癌细胞特异性t细胞的检测试剂盒，所述试剂盒中包括负载抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子，纳米粒子或微米粒子含有粒子制备材料和抗原组分，抗原组分选自如下(i)、(ii)、(iii)中的一种或者多种：
5.(i)多种癌细胞系和/或异体肿瘤组织全细胞组分的纳米粒子和/或微米粒子，
6.(ii)多种癌细胞系和/或异体肿瘤组织中全细胞蛋白质组分的纳米粒子和/或微米粒子，
7.(iii)多种癌细胞系和/或异体肿瘤组织中全细胞蛋白质组分和mrna组分的纳米粒子和/或微米粒子；
8.其中，所述多种癌细胞系为同种癌症不同亚型的癌细胞系；所述异体肿瘤组织为不同病人同种肿瘤相同亚型和/或不同亚型的肿瘤组织。
9.本发明所述的检测试剂盒，抗原组分中在含有(i)、(ii)、(iii)中一种或多种的基础上还可以同时含有如下(vi)和(v)中的一种或多种：
10.(vi)含有抗原多肽表位的人工合成多肽，抗原多肽表位为癌症特异性或者癌症相关抗原多肽表位；
11.(v)可以表达包含抗原多肽表位的核酸，抗原多肽表位为癌症特异性或者癌症相关抗原多肽表位，核酸为mrna或dna。
12.进一步的，本公开所述的检测试剂盒，其特征在于，所述多种癌细胞系或异体肿瘤组织通过如下一种方法处理后负载到纳米粒子和/或微米粒子：
13.(1)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织混合后，灭活并破坏其结构，得到待负载组分；或，
14.(2)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织灭活并破坏其结构后混合，得到待负载组分；或，
15.(3)收集多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的水溶性组分，将水溶性组分混合后得到待负载组分；或，
16.(4)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的非水溶性组分使用含有溶解剂的溶解液溶解非水溶性组分并收集溶解的非水溶性组分，将非水溶性组分混合后得到待负载组分；或，
17.(5)收集多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的水溶性组分，并使用含有溶解剂的溶解液非水溶性组分后收集溶解的非水溶性组分，将水溶性组分和非水溶性组分混合后得到待负载组分；或，
18.(6)使用含有溶解剂的溶解液直接处理多种癌细胞系或异体肿瘤组织，混合处理液得到待负载组分；或者
19.(7)使用(1)-(6)中任一项与(vi)含有抗原多肽表位的人工合成多肽和/或(v)可以表达包含抗原多肽表位的核酸混合后得到待负载抗原组分。
20.本公开所述的检测试剂盒，其特征在于，所述多种癌细胞系或异体肿瘤组织通过如下一种方法处理后负载到纳米粒子和/或微米粒子：
21.(1)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织混合后，灭活并破坏其结构，分离提取其中的蛋白质和多肽组分，即得到待负载抗原组分；或，
22.(2)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织灭活并破坏其结构并分离提取蛋白质和多肽组分后混合，得到待负载抗原组分；或，
23.(3)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织混合后，灭活并破坏其结构，分离提取其中的蛋白质和多肽组分以及mrna组分，即得到待负载抗原组分；或，
24.(4)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织灭活并破坏其结构并分离提取蛋白质和多肽组分以及mrna组分后混合，得到待负载抗原组分；或，
25.(5)收集多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的水溶性组分，然后分离提取其中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分，然后将水溶性组分中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分混合后得到待负载抗原组分；或，
26.(6)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的非水溶性组分使用含有溶解剂的溶解液处理，收集溶解的非水溶性组分，然后分离提取其中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分，将非水溶性组分中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分混合后得到待负载抗原组分；或，
27.(7)收集多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的水溶性组分，并使用含有溶解剂的溶
解液溶解非水溶性组分后收集溶解的非水溶性组分，将水溶性组分和非水溶性组分分别分离提取其中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分，然后混合后得到待负载抗原组分；或，
28.(8)使用含有溶解剂的溶解液直接处理多种癌细胞系或异体肿瘤组织，混合处理液后分离提取其中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分，即可得到待负载抗原组分；或
29.(9)使用(1)-(8)中任一项与(vi)含有抗原多肽表位的人工合成多肽和/或(v)可以表达包含抗原多肽表位的核酸混合后得到待负载抗原组分。
30.在本发明中，负载癌细胞或肿瘤组织全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子囊括了多种癌细胞系或者多个异体患者肿瘤组织中的癌细胞的全细胞抗原，因而能够覆盖癌症患者自己本身的癌细胞抗原。然后使用该纳米粒子和/或微米粒子激活外周血、外周免疫组织或者肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性t细胞，再利用检测被激活的癌细胞特异性t细胞细胞内或者细胞表面高表达或者分泌的特异性物质达到间接检测癌细胞特异性t细胞的目的。利用流式细胞术等手段分析多样和广谱的具有识别和杀伤癌细胞功能的癌症特异性t细胞的数量和比例。
31.所述递送粒子负载全细胞组分时，所负载的全细胞组分中含有水溶性组分和使用含特定溶解剂的溶解液溶解的非水溶性组分；所述递送粒子负载全细胞抗原时，所述全抗原组分含有细胞中的所有蛋白质和多肽组分和/或细胞的mrna组分。
32.所述负载于递送粒子的全细胞组分制备过程包括：先裂解癌细胞或者肿瘤组织，然后分别收集裂解液中的水溶性组分和非水溶性组分，将非水溶性组分使用含有特定溶解剂的溶解液溶解后与水溶性组分一同使用；
33.或者所述负载于递送粒子的全细胞组分制备过程包括：先使用含有特定溶解剂的溶解液裂解癌细胞或者肿瘤组织，然后使用含有特定溶解剂的溶解液溶解全细胞裂解液后使用。
34.或者，所述负载于递送粒子的全细胞组分中的全抗原组分的制备过程包括：先裂解癌细胞或者肿瘤组织，然后分别收集裂解液中的水溶性组分和非水溶性组分，将所有水溶性组分经过盐析、加热、酶解等处理后，沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液再溶解；所述非水溶性部分直接使用含有溶解剂的溶解液溶解，或者使用含有溶解剂的溶解液溶解后经过盐析、加热、酶解等处理后再将所得沉淀组分使用含有溶解剂的溶解液再二次溶解；将上述水溶性组分中的蛋白质多肽组分与非水溶性组分一起或者与非水溶性组分纯化处理后二次溶解的抗原组分一起构成了全细胞组分中的全抗原组分。
35.或者负载于递送粒子的全抗原组分的制备方法包括：将癌细胞和/或肿瘤组织使用含有溶解剂的溶解液裂解后，使用含有溶解剂的溶解液溶解裂解物组分，然后将所得溶解后裂解物组分经过盐析、加热等处理后再将所得沉淀组分使用含有溶解剂的溶解液二次再溶解。
36.进一步地，多种癌细胞系为至少两种，使用时质量比为1-20:1-20:1-20
……
，优选为1:1:1
…
；异体肿瘤组织为至少两种来源，使用时质量比为1-20:1-20:1-20
……
，优选为1:1:1
…
。
37.进一步地，水溶性组分和非水溶性组分按照质量比1-5:1-5混合。
38.进一步的，所述抗原组分、非水溶性组分、全细胞组分、或者全细胞抗原组分、沉淀和/或变性等适当方式处理后的蛋白质和多肽组分经含有溶解剂的溶解液溶解后负载于递
送纳米/微米粒子。
39.进一步地，溶解剂为含有结构式1的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐(如sds)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、triton、吐温、氨基酸、多肽、糖苷、胆碱中的一种或多种；
40.结构式1如下所示：
[0041][0042]
其中，r1、r2、r3、r4和r5为任意化学结构。
[0043]
含有结构式1的化合物包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、异硫氰酸胍、尿素、盐酸胍、其他含有胍基的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等。
[0044]
进一步的，所述粒子制备骨架材料、所负载抗原组分中蛋白质和多肽组分的质量比1：0.001-10；优选的，粒子制备骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比1：0.01-2；最优选的，粒子制备骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比1：0.05-1。
[0045]
进一步的，所述纳米粒或者微米粒子中还同时负载mrna时，所述粒子制备骨架材料和mrna组分的质量比1：0.001-10；优选的，粒子制备骨架材料和mrna组分的质量比1：0.01-2；最优选的，粒子制备骨架材料和mrna组分的质量比1：0.05-1。
[0046]
进一步地，纳米粒子和/或微米粒子由有机合成高分子材料、天然高分子材料、无机材料中的至少一种制备得到。
[0047]
进一步地，有机合成高分子材料包括但不限于plga、pla、peg-plga、peg-pla、pga、peg、pcl、poloxamer、pva、pvp、pei、ptmc、聚酸酐、pdon、ppdo、pmma、聚氨基酸、合成多肽；天然高分子材料包括但不限于卵磷脂、胆固醇、海藻酸盐、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜成分、淀粉、糖类、多肽；无机材料包括但不限于三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸盐、磷酸盐。
[0048]
在本发明中，粒子选择纳米级或微米级，这样能保证粒子被抗原提呈细胞吞噬，而为了提高吞噬效率，粒径大小要在适宜的范围内。纳米粒子(nanoparticle,np)的粒径大小为1nm-1000nm，更优选地，粒径大小为50nm-500nm，最优选地，粒径大小为100nm-300nm；微米粒子(micronparticle,mp)的粒径大小为1μm-1000μm，更优选地，粒径大小为1μm-100μm，更优选地，粒径大小为1μm-10μm，最优选地，粒径大小为1μm-5μm。
[0049]
进一步地，灭活和破坏多种癌细胞系或异体肿瘤组织的结构是采用照射、放射、辐射、加热、氧化、超声、均质化、反复冻融、匀浆、高速搅拌、高压破坏、高剪切力破坏、溶胀、化学物质、皱缩中的一种或多种方式进行。
[0050]
进一步地，具体是采用如下方法进行：将多种癌细胞系或异体肿瘤组织在-20℃～-273℃下冷冻，加水或不含溶解剂的溶液后进行反复冻融裂解，得到的上清液为水溶性组分，沉淀采用含溶解剂的溶解液处理，其中溶解后转为可溶的部分为非水溶性组分，水溶性组分和非水溶性组分合并后得到癌细胞全细胞组分。
[0051]
进一步地，所述试剂盒中还包括抗原提呈细胞。
[0052]
进一步地，抗原提呈细胞包括b细胞、树突状细胞(dc)和巨噬细胞中的至少一种。优选为包括树突状细胞在内的两种及以上，更优选为三种细胞的组合。
[0053]
进一步地，纳米粒子和/或微米粒子还负载有免疫增强佐剂。
[0054]
在本发明中，免疫增强佐剂包括但不限于模式识别受体激动剂、卡介苗、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂cpg、免疫佐剂poly(i:c)、免疫佐剂poly iclc、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、锰佐剂、铝佐剂、钙佐剂、细胞因子、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、角鲨烯、植物油、内毒素、脂质体佐剂、mf59、双链rna、双链dna、caf01、人参、黄芪的有效成分。
[0055]
优选地，免疫增强佐剂包括(1)poly(i:c)或poly(iclc)；(2)cpg-odn，其中，cpg-odn为a类cpg-odn、b类cpg-odn和c类cpg-odn中的至少1种，且至少其中1种为b类cpg-odn或c类cpg-odn。其中，a类cpg-odn选自cpg-odn 2216、cpg-odn 1585或cpg-odn 2336，b类cpg-odn选自cpg-odn 1018、cpg-odn 2006、cpg-odn 1826、cpg-odn 1668、cpg-odn 2007、cpg-odn bw006或cpg-odn sl01，c类cpg-odn选自cpg-odn 2395、cpg-odn sl03或cpg-odn m362。
[0056]
进一步地，纳米粒子和/或微米粒子还负载有促进溶酶体逃逸的物质。
[0057]
进一步的，促进溶酶体逃逸的物质为带正电荷的多肽(如kala多肽、rala多肽、蜂毒肽等)、精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、组氨酸、聚组氨酸、nh4hco3、鱼精蛋白或组蛋白。
[0058]
进一步地，纳米粒子和/微米粒子还负载有主动靶向抗原提呈细胞的靶头。
[0059]
进一步地，靶头包括但不限于甘露糖、甘露聚糖、cd19抗体、cd20抗体、bcma抗体、cd32抗体、cd11c抗体、cd103抗体或cd44抗体等。
[0060]
在本发明中，癌细胞特异性t细胞包括cd4
+
t细胞和/或cd8
+
t细胞，优选为同时包括cd4
+
t细胞和cd8
+
t细胞。
[0061]
试剂盒在使用时，将所述负载多种癌细胞系和/或异体肿瘤组织的纳米粒子和/或微米粒子与抗原提呈细胞和待测细胞共孵育，通过抗原提呈细胞间接激活抗原特异性t细胞，再使用一定的检测手段检测待测细胞内部或表面的或者分泌出的特异性标志物，通过分析特异性标志物在细胞外或者细胞内的含量间接实现所述癌细胞特异性t细胞的检测。
[0062]
进一步的，所述纳米粒子/微米粒子激活癌细胞特异性t细胞的过程为将纳米粒子/微米粒子与抗原提呈细胞和t细胞同时共孵育以激活t细胞；或者所述纳米粒子/微米粒子激活癌细胞特异性t细胞的过程为先将纳米粒子/微米粒子与抗原提呈细胞共孵育激活抗原提呈细胞，再将激活的抗原提成细胞与t细胞共孵育以激活t细胞。
[0063]
进一步的，所述纳米粒子/微米粒子与抗原提呈细胞共孵育时的浓度为0.001mg/ml到50mg/ml，优选0.01-2mg/ml；共孵育时间为3h-72h，优选5-48小时；孵育温度为4-40℃，优选37℃。
[0064]
进一步的，所述纳米粒子/微米粒子与抗原提呈细胞和t细胞同时共孵育时的浓度为0.001mg/ml到50mg/ml，优选0.01-2mg/ml；共孵育时间为3h-72h，优选5-48小时；孵育温
度为4-40℃，优选37℃。
[0065]
进一步的，所述特异性标志物包括蛋白质、多肽、核酸、糖类或者脂类。
[0066]
进一步地，特异性标志物为蛋白质时，包括但不限于干扰素-γ、白介素、颗粒酶、穿孔素、cd69、fas、fasl、cd107、cd40l、cd25、ox40(cd134)、cd25、cd39、cd103、cd56、cd279、cd278、cd244、cd27、cd154、tcf-1、cd102、cd107、cd137、cd44、il-2r、fasl、cd28等。利用特异性标志物分析检测癌细胞特异性t细胞数量和比例的技术包括但不限于流式细胞术、磁珠分选法、酶联免疫斑点法(elispot)、酶联免疫吸附法(elisa)、多细胞因子检测法等。利用特异性标志物分析检测癌细胞特异性t细胞数量和比例时可以使用的标志物为至少一种标志物。
[0067]
进一步地，待测细胞可为t细胞或者含有t细胞的细胞混合物，如来源于外周血、外周免疫器官或肿瘤浸润淋巴细胞的t细胞或者含有t细胞的细胞混合物。
[0068]
进一步地，待测细胞与纳米粒子和/或微米粒子共孵育之前，可以对其进行分选，分选出其中的t细胞，具体地，使用流式细胞术或者磁珠分选法从外周血、外周免疫组织、肿瘤浸润淋巴细胞中分选cd3
+
的细胞、分选出cd45
+
cd3
+
的细胞、分选出cd3
+
cd8
+
的细胞、分选出cd45
+
cd3
+
cd8
+
的细胞、分选出cd3
+
cd4
+
的细胞或分选出cd45
+
cd3
+
cd4
+
的细胞。
[0069]
进一步的，待测细胞与纳米粒子和/或微米粒子共孵育之前，可以对其进行分选，分选出其中的t细胞，具体地，使用流式细胞术或者磁珠分选法从外周血、外周免疫组织、肿瘤浸润淋巴细胞中分选cd3
+
的细胞、分选出cd45
+
cd3
+
的细胞、分选出cd3
+
cd8
+
的细胞、分选出cd45
+
cd3
+
cd8
+
的细胞、分选出cd3
+
cd4
+
的细胞或分选出cd45
+
cd3
+
cd4
+
的细胞。尔后，在共孵育之前，可以进行进一步纯化，将极少量特定待检测标志物阳性的t细胞先去除，比如先去除cd25+的t细胞，或者先去除cd69阳性的t细胞后再进行共孵育。
[0070]
进一步地，共孵育体系中可以含有细胞因子或抗体。进一步地，细胞因子包括但不限于粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白介素2(il-2)、白介素7(il-7)、白介素14(il-14)、白介素4(il-4)、白介素15(il-15)、白介素21(il-21)、白介素17(il-17)、白介素12(il-12)、白介素6(il-6)、白介素33(il-33)、γ干扰素(ifn-γ)、tnf-α等；优选地，共孵育体系中含有粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白介素2(il-2)、白介素7(il-7)、白介素15(il-15)和白介素12(il-12)。进一步地，抗体包括但不限于αcd-3抗体、αcd-4抗体、αcd-8抗体、αcd-28抗体、αcd-40抗体、αox-40抗体、αox-40l抗体等。
[0071]
进一步地，纳米粒子和/或微米粒子中用于制备抗原的癌细胞或肿瘤组织不是来自于待检测样本的癌症患者。
[0072]
本发明突破现有检测方式的限制，使粒子上负载全部抗原和经激活的抗原提呈细胞细胞膜，能够检测更广谱和多样的癌细胞特异性t细胞，且高度特异，在免疫检测中效果更佳，从而为免疫治疗提供了一种潜在的生物标志物检测方法。
[0073]
所述纳米粒子或微米粒子负载的癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞组分的制备步骤为：先分别裂解每一种癌细胞系和/或每一位癌症患者的肿瘤组织得到其裂解物，然后使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解就得到了溶解后的非水溶性组分，然后将每一种癌细胞和/或每一位癌症患者的水溶性组分和非水溶性组分分别混合后得到水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物，
二者一起使用即为所述全细胞组分；或者将多个癌细胞和/或多位癌症患者的肿瘤组织混和后将其裂解物，然后使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到裂解物中的水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解就得到了溶解后的非水溶性组分混合物，二者一起使用即为所述全细胞组分。
[0074]
或者所述纳米粒子或微米粒子负载的癌细胞和/或肿瘤组织中的全细胞组分的制备步骤为：先分别使用含有溶解剂的溶解液裂解每一种癌细胞系和/或每一位癌症患者的肿瘤组织得到其裂解物，然后使用含有溶解剂的溶解液溶解所有裂解物组分后得到每一个癌细胞系和/或每一位癌症患者肿瘤组织的全细胞组分，然后将一个癌细胞系和/或每一位癌症患者肿瘤组织的全细胞组分混合后得到所述全细胞组分；或者将多个癌细胞和/或多位癌症患者的肿瘤组织混和后将其使用含有溶解剂的溶解液裂解，然后使用含有溶解剂的溶解液溶解所有裂解物，即得到所述全细胞组分。
[0075]
或者所述纳米粒子或微米粒子负载的癌细胞和/或肿瘤组织中的抗原组分的制备步骤为：先分别裂解每一种癌细胞系和/或每一位癌症患者的肿瘤组织得到其裂解物，然后使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分，然后将非水溶性组分直接使用含有溶解剂的溶解液溶解就得到了溶解后的非水溶性组分，将得到的裂解物中的水溶性组分经过盐析和/或加热、酶解等适当方法处理后将其中的蛋白质和多肽组分沉淀，然后将沉淀部分的蛋白质和多肽组分使用含有溶解剂的溶解液溶解就得到了水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，然后将每一种癌细胞和/或每一位癌症患者的水溶性组分中的蛋白质多肽组分和非水溶性组分分别混合后得到水溶性组分中蛋白质多肽组分混合物和非水溶性组分混合物，二者一起使用即为所述抗原组分；或者先将多个癌细胞和/或多位癌症患者的肿瘤组织混和后将其裂解物，然后使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到裂解物中的水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解就得到了溶解后的非水溶性组分混合物，将得到的裂解物中的水溶性组分混合物经过盐析和/或加热、酶解等适当方法处理后将其中的蛋白质和多肽组分沉淀或变性，然后将沉淀/变性部分的蛋白质和多肽组分使用含有溶解剂的溶解液溶解就得到了水溶性组分中蛋白质多肽组分混合物，将非水溶性组分混合物和水溶性组分中蛋白质多肽组分混合物一起使用即为抗原组分。
[0076]
所述纳米粒子或微米粒子负载的癌细胞和/或肿瘤组织中全细胞蛋白质和多肽抗原组分制备步骤为：先将多个癌细胞系和/或多个肿瘤患者的肿瘤组织混合，然后使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞系和/或肿瘤组织混合物，然后使用含有溶解剂的溶解液溶解所有裂解物，然后使用盐析和/或加热、酶解等适当方法处理使其中的蛋白质多肽组分析出或变性后形成沉淀/变性分离出来，然后使用含有溶解剂的溶解液再二次溶解后即得到所述抗原组分。或者将每个癌细胞系和/或每个肿瘤患者的肿瘤组织混合，然后使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞系和/或肿瘤组织，然后使用含有溶解剂的溶解液溶解所有裂解物，然后使用盐析和/或加热处理使其中的蛋白质多肽组分析出或变性后形成沉淀或变性分离出来，然后使用含有溶解剂的溶解液再二次溶解后混合，即得到所述抗原组分。
[0077]
所述纳米粒子或微米粒子负载的癌细胞和/或肿瘤组织中的非水溶性组分中的蛋
白质和多肽组分制备步骤为：先裂解癌细胞系和/或肿瘤组织得到其裂解物；然后使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分；然后将得到的裂解物中的非水溶性组分经过盐析和/或加热、酶解等适当方法处理后将其中的蛋白质和多肽组分沉淀或变性；然后将沉淀部分的蛋白质和多肽组分使用含有溶解剂的溶解液溶解就得到了非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分。在使用时，将上述非水溶性组分中的蛋白质多肽组分与水溶性组分中的蛋白质多肽组分一起使用作为全细胞蛋白质多肽抗原组分。
[0078]
上述全细胞蛋白质多肽抗原组分中还可以加入全细胞mrna抗原组分一起使用，制备方法为先通过盐析和/或加热、酶解等适当方法分离纯化出蛋白质多肽组分后：mrna组分位于上清液中，将上清液中的mrna组分使用特定方法分离纯化出mrna组分；将蛋白质和多肽沉淀物使用含有溶解剂的溶解液溶解，然后再将溶解后的蛋白质多肽组分与mrna组分混合后使用。
[0079]
所示分离纯化出mrna的方法包括但不限于使用dna酶降解掉其中的dna、使用适当试剂盒去除dna、使用特定试剂盒分离出mrna。
[0080]
所述纳米粒子或微米粒子负载的抗原组分制备过程中分离提纯水溶性组分中的抗原组分或者全细胞裂解物组分中的抗原组分的过程可以包括盐析；分离提纯水溶性组分中的抗原组分或者全细胞裂解物组分中的抗原组分的过程可以包括加热。
[0081]
所述纳米粒子或微米粒子负载的抗原组分制备过程中，盐析所使用的试剂所含的阳离子包括但不限于al
3+
、fe
3+
、fe
2+
、mg
2+
、sn
2+
、zn
2+
、ca
2+
、li
+
、na
+
、nh
4+
、k
+
、cu
2+
、ag
+
、ba
2+
等。盐析所使用的试剂所含的阴离子包括但不限于cl-、so
42-、no
3-、co
32-、sio3
2-、s2o
72-、b4o
72-、po4
3-、rcoo-、no
2-、s2o
82-、s
2-、cro
42-、mno4-、p2o
74-等。
[0082]
上述列出了几种常用的制备基于多种癌细胞系或者多个患者肿瘤组织的癌细胞系的制备方法，在实际应用中也可以根据情况组合使用或者使用其他相关的可行的制备方法。
[0083]
或者将上述几种方法制备的全细胞组分或者全细胞抗原组分先与体外合成的含有癌症特异性抗原表位/癌症相关抗原表位的多肽和/或可以表达癌症特异性抗原表位/癌症相关抗原表位的mrna混合后，再作为混合抗原组分使用负载到纳米粒子或者微米粒子。
[0084]
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0085]
本发明提供了一种使用纳米级或微米级粒子递送系统体外检测免疫细胞中癌细胞特异性t细胞的技术，所分析检测的癌细胞特异性t细胞广谱而且高度特异，包含所有克隆的可以特异性识别和杀伤癌细胞效应性(杀伤性)癌细胞特异性t细胞(t
eff
)；而且，与只负载一种癌细胞系的组分或者来源于一个异体癌症患者的肿瘤组织组分的纳米粒子和/或微米粒子相比，负载多细胞系或者多个癌症患者肿瘤组织的纳米粒子和/或微米粒子所激活的t细胞分泌的特异性标志物含量更高，这也就使得其更容易被检测出，避免了信号较弱或者较差而无法检测出的情况。而且，本发明可以使用获得的多个其他患者的肿瘤组织或者多个癌细胞系制备纳米粒子/微米粒子，克服了临床上大多数时候没办法及时获得被检测患者的肿瘤组织制备纳米粒子/微米粒子的难题。上述优势使得本发明所述粒子检测癌细胞特异性t细胞时避免了部分癌细胞特异性t细胞因为被激活后表达的特异性标志物较弱无法检测出的情况，因而本发明所述的检测方法的检测准确性更高。本发明还在此基础
上对与t细胞孵育过程、纳米粒子和/或微米粒子负载物质进行优化，使该方法能够检测出更全面的癌细胞特异性t细胞，且检测时信号更强更准确。
[0086]
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
[0087]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
[0088]
图1为本发明检测系统的制备过程及应用示意图；其中，a为水溶性组分和非水溶性组分分别收集和制备纳米粒子或微米粒子的示意图；b为采用含有溶解剂的溶解液溶解癌细胞全细胞抗原和制备纳米粒子或微米粒子的示意图；c为使用a或b中制备的纳米粒子和/或微米粒子用于激活后检测癌细胞特异性t细胞的示意图；
[0089]
图2-15分别为实施例1-14中用纳米粒子或微米粒子检测癌细胞特异性t细胞实验结果；*代表该组与治疗之前相比p≤0.05，有显著性差异；**代表该组与治疗之前相比p≤0.01，有显著性差异；***代表该组与治疗之前相比p≤0.005，有显著性差异；#代表p≤0.05,有显著性差异；##代表p≤0.01，有显著性差异；###代表p≤0.005，有显著性差异。
具体实施方式
[0090]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0091]
本发明所述的用于检测外周血、外周免疫组织或者肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性t细胞，该类癌细胞特异性t细胞在检测时先与纳米粒子和/或微米粒子及抗原提成细胞同时共孵育或者先与激活过的抗原提呈细胞(被纳米粒子和/或微米粒子)共孵育，然后再使用流式细胞术或者酶联免疫斑点法(elispot)或者酶联免疫吸附法(elisa)或者使用多细胞因子检测法或者使用磁珠分选法等检测手段分析癌细胞特异性t细胞被抗原特异性激活后表达或者分泌的特异性分子即可得到广谱的癌细胞特异性t细胞的信息。
[0092]
其中，抗原提呈细胞先被负载多个患者肿瘤组织和/或多种癌细胞的全细胞抗原或其混合物的纳米粒子和/或微米粒子激活，然后被激活的抗原提呈细胞再激活癌细胞特异性t细胞。检测癌细胞特异性t细胞的过程及应用领域如图1所示。
[0093]
在制备激活抗原提呈细胞的纳米粒子或微米粒子时，可裂解细胞或组织后先分别收集水溶性组分和水不溶性抗原并分别制备纳米或微米粒子系统；或者也可以直接采用含有溶解剂的溶解液直接裂解细胞或组织并溶解癌细胞全细胞抗原并制备纳米或微米粒子系统。本发明所述癌细胞全细胞抗原在裂解前或(和)裂解后既可经过包括但不限于灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、蛋白质提取、盐析、加热、化学修饰、核酸酶处理、蛋白酶内切或降解等处理后再制备纳米粒子或微米粒子；也可细胞裂解前或(和)裂解后不经过任何灭活或(和)变性、固化、生物矿化、加热、离子化、蛋白质提取、盐析、化学修饰、核酸酶处理、蛋白酶内切或降解直接制备纳米粒子或微米粒子。本发明部分实施例中，肿瘤组织细胞在裂解前经过了灭活或(和)变性处理，在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做灭活或(和)变性处理，或者也可以细胞裂解前和裂解后均做灭活或(和)变性处理；本发明部分实
施例中细胞裂解前或(和)裂解后的灭活或(和)变性处理方法为紫外照射和高温加热，在实际使用过程中也可以采用包括但不限于放射线辐照、高压、固化、生物矿化、离子化、蛋白质提取、盐析、加热、化学修饰、核酸酶处理、胶原酶处理、蛋白酶内切或降解、冷冻干燥等处理方法。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。
[0094]
溶解剂为含有结构式1的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐(如sds)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、triton、吐温、氨基酸、多肽、糖苷、胆碱中的一种或多种。
[0095]
尿素、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、精氨酸和盐酸胍等含有结构式1中的结构，发明人发现具有结构式1结构的物质可以作为溶解液中的溶解剂溶解细胞或者肿瘤组织中的非水溶性组分或者裂解物中的组分经过盐析、加热、酶解等处理后沉淀的组分，因而除了尿素、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、精氨酸、盐酸胍、二甲双胍等常见的含有胍基和脲基的结构的化合物外，其他含有该结构的化合物也具有作为溶解剂溶解非水溶性组分的能力。
[0096]
结构式1如下所示：
[0097][0098]
其中，r1、r2、r3、r4和r5为任意化学结构。
[0099]
含有结构式1中的结构的化合物包括但不限于包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类。
[0100]
进一步地，灭活和破坏癌细胞或者肿瘤组织的结构包括但不限于照射、放射、加热、辐射、加热、氧化、超声、均质化、反复冻融、匀浆、高速搅拌、高压破坏、高剪切力破坏、溶胀、化学物质、皱缩中的一种或多种。本发明中部分实施例中使用了反复冻融、加超纯水溶胀和超声处理，在实际应用中也可以使用任何其他可以灭活和破坏细胞或者肿瘤组织结构的方法。
[0101]
与纳米粒子或微米粒子和t细胞共孵育的抗原提呈细胞可以来源于与t细胞来源相同的自体或者同种异体，也可以来自于细胞系或者干细胞。抗原提呈细胞可以是dc细胞、b细胞、巨噬细胞或者上述三者的任意混合物，也可以是其他具有抗原提呈功能的细胞。
[0102]
在使用负载多个患者的肿瘤组织和/或多种癌细胞的全细胞抗原组分通过抗原提呈细胞激活癌细胞特异性t细胞时，体系中可含有细胞因子和/或抗体以提高激活效率。
[0103]
在一些实施方案中，采用负载多种癌细胞或多个患者的肿瘤组织的全细胞抗原组分的纳米粒子或微米粒子先被抗原提呈细胞吞噬和提呈，然后再通过抗原提呈细胞激活和检测外周血、外周免疫组织或肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性t细胞的具体方法如下：
[0104]
步骤1，将第一预定体积的含有第一预定浓度的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度制备粒子原材料的有机相中。
[0105]
在一些实施例中，水相溶液可含有多种癌细胞系/多个患者的肿瘤组织的裂解物中的各组分(或同时含有免疫增强佐剂)；裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性组分和
溶于含有尿素或盐酸胍或糖苷等溶解剂的溶解液中的原非水溶性组分，或者使用含有溶解剂的溶解液同时溶解的水溶性组分和非水溶性组分。水相溶液所含有的水溶性组分的浓度或原非水溶性组分的浓度，或者水溶性组分+非水溶性组分的浓度也即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于1ng/ml，能负载足够抗原以激活相关细胞。如果含有免疫增强佐剂时，其在初始水相中的浓度为大于0.01ng/ml。
[0106]
在一些实施例中，有机溶剂选用二氯甲烷。再实际应用中也可以选用其他溶剂，比如乙酸乙酯或者乙腈等。另外，在一些实施例中，制备粒子原材料的第二预定浓度的范围为0.5mg/ml-5000mg/ml，优选为10mg/ml-100mg/ml。
[0107]
实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预定体积的比例进行设定，在本发明中，水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000，优选地为1:1.5-10。在具体实施过程中可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒或微米粒的尺寸大小。
[0108]
优选地，水相溶液为裂解物组分溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/ml，优选1mg/ml～100mg/ml；水相溶液为裂解物组分/免疫佐剂溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/ml，优选1mg/ml～100mg/ml，免疫佐剂的浓度大于0.01ng/ml，优选0.01mg/ml～20mg/ml。有机相溶液中，溶剂为dmso、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、dmf、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；有机相的浓度为0.5mg/ml～5000mg/ml，优选为100mg/ml。
[0109]
步骤2，将步骤1得到的混合液进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或均质处理或微流控处理。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.1小时～24小时；超声处理时，超声功率大于5w，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于5psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于100rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01ml/min,比如0.1ml/min-100ml/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
[0110]
步骤3，将步骤2处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或进行均质处理或微流控处理。该步骤将步骤2得到的混合物加入到乳化剂水溶液中继续超声或搅拌纳米化或微米化。在本发明中，超声时间大于0.1秒，比如2～200秒，搅拌速度大于50rpm，比如50rpm～500rpm，搅拌时间大于1分钟，比如60～6000秒。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50w～500w，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01ml/min,比如0.1ml/min-100ml/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的纳米或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
[0111]
在一些实施例中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇(pva)水溶液，第三预定体积为5ml，第
三预定浓度为20mg/ml。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本发明中，第二预定体积与第三预定体积之的范围为1:1.1
ꢀ‑
1:1000进行设定，优选地可以为1:1.5-5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸，可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整。同样地，本步骤的超声时间或搅拌时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的取值根据，均为了得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。
[0112]
步骤4，将步骤3处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件。
[0113]
本步骤中，乳化剂水溶液为pva溶液或其他溶液。
[0114]
第四预定浓度为5mg/ml，第四预定浓度的选择，以得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒为依据。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本发明中，第三预定体积与第三预定体积之比为范围为1:1.5-1:2000，优选地为1:4-10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。
[0115]
在本发明中，本步骤的预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成，也即步骤1中的二氯甲烷挥发完成。
[0116]
步骤5，将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100rpm的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者第六预定体积的pbs(或生理盐水)中。或者使用超滤处理后，将体系中的液体更换为含有冻干保护剂的水溶液得到所需混悬液。
[0117]
步骤6，将步骤5得到的含有冻干保护剂的混悬液进行冷冻干燥处理后，将冻干物质备用。
[0118]
步骤7，将第六预定体积的步骤5中得到的重悬于pbs(或生理盐水)中的含纳米粒的混悬液或者采用第六预定体积的pbs(或生理盐水)重悬步骤6得到的冷冻干燥后的含有纳米粒或微米粒和冻干保护剂的冻干物质直接使用；或者上述样品与第七预定体积的水溶性组分或者溶解的原非水溶性组分混合后使用。
[0119]
在本发明中，第六预定体积与第七预定体积的体积比为1:10000到10000:1，优先体积比为1:100到100:1，最优体积比为1:30到30:1。
[0120]
步骤8，取得外周血、外周免疫组织或者肿瘤组织，收集上述组织中含有t细胞的免疫细胞。或者分选上述组织中的t细胞和抗原提呈细胞，然后按照一定比例混合，抗原提呈细胞与t细胞的数量比为1:0.1-20。
[0121]
步骤9，将步骤5或者步骤6或者步骤7制备的纳米和/或微米粒子与步骤8得到的含有t细胞和抗原提成细胞的免疫细胞混合后共孵育一定时间激活癌细胞特异性t细胞；或者将步骤5或者步骤6或者步骤7制备的纳米和/或微米粒子先与抗原提呈细胞共孵育一定时间，然后再将孵育后的抗原提呈细胞与t细胞共孵育一定时间激活癌细胞特异性t细胞。
[0122]
纳米粒子和/或微米粒子与待检测细胞共孵育时，纳米粒子和/或微米粒子浓度为0.001mg/ml-50mg/ml，优选为0.005mg/ml-5mg/m，更优选0.01-2mg/ml；共孵育时间为3h-72h，优选5-48小时；孵育温度为可以使细胞存活和激活的温度，优选为4-40℃，最优选37℃。
[0123]
步骤10，采用流式细胞术、酶联免疫斑点法、酶联免疫吸附法、多细胞因子检测法
或磁珠分选法等方法分析被抗原激活的癌细胞特异性t细胞的含量和比例。
[0124]
本公开证明了，在癌细胞特异性t细胞被激活后，其表面会表达激活标志物，比如cd69和cd25等，也会同时分泌具有杀伤性的物质，之前没有研究人员证实过t细胞在被激活后结构上表达激活标志物和功能上分泌杀伤性物质的重合程度。本公开证实了癌细胞特异性t细胞在被癌症抗原激活后，其会同时开始表达细胞结构上的激活标志物和细胞功能上的杀伤性分子。而且，本研究证实了cd25、cd69等结构上的激活标志物与分泌的杀伤性物质ifn—γ、fasl等重合，发现了结构上和功能上的一致性。本公开证明了只使用结构上的激活标志物或者只使用功能杀伤性物质可以同时作为结构和功能上都激活的癌细胞特异性t细胞的激活标志物。实施例中使用了ifn—γ、il-2r、cd25、cd69、fasl、cd40l、hla、cd107等结构上和功能上的激活标志物，在实际应用中也可以使用颗粒酶(比如颗粒酶b)、穿孔素等其他可以从结构上和功能上证明癌细胞特异性t细胞被癌症抗原特异性激活的标志物。而且，该标志物可以位于细胞内、位于细胞表面或者被分泌到细胞外。
[0125]
本发明部分实施例中使用了盐析、加热、酶解等方法纯化癌细胞/肿瘤组织裂解物中的抗原组分，在实际应用中也可以使用相分离、层析分离等其他可以去除裂解物中的dna成分或者分离纯化出其中的蛋白质多肽和mrna成分的方法。
[0126]
实施例1纳米粒子用于检测肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞
[0127]
本实施例使用纳米粒子(nanoparticle,np)检测的癌症患者的癌细胞特异性t细胞。本实施例中，将多种人肺癌的癌细胞系中的水溶性组分和非水溶性组分负载到纳米粒子，然后，以该纳米粒子辅助检测非小细胞肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞。
[0128]
(1)多种肺癌细胞系各组分的收集
[0129]
分别培养人肺癌细胞系a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞，其中a549细胞、h1299细胞、pc9细胞和h1437细胞属于肺癌亚型肺腺癌细胞系，h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞属于肺癌亚型肺鳞癌细胞系。
[0130]
将上述8种细胞分别收集后，将上述8种肺癌细胞系按照细胞数量比(等同于细胞质量比)1:1:1:1:1:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，将细胞沉淀使用超纯水重悬后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解癌细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8m尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8m尿素水溶液中可溶。以上水溶性组分和非水溶性组分即为制备纳米粒子1(np1)的抗原原料来源。其中，所制备的8种癌细胞系的水溶性组分复合物为制备纳米粒子2(np2)的抗原原料。
[0131]
或者只收集a549细胞，离心后去除培养基，将细胞沉淀使用超纯水重悬后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解癌细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8m尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8m尿素水溶液中可溶。以上水溶性组分和非水溶性组分即为制备纳米粒子3(np3)的抗原原料来源。
[0132]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后
通过细胞筛网过滤，然后加入适量超纯水后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解肿瘤组织中的细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8m尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8m尿素水溶液中可溶。以上水溶性组分和非水溶性组分即为制备纳米粒子4(np4)的抗原原料来源。
[0133]
(2)负载全细胞组分的纳米粒子的制备
[0134]
本实施例中纳米粒子1(np1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时负载癌细胞全细胞抗原中水溶性组分的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性组分的纳米粒子分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料plga分子量为10kda-30kda，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分，在内部负载细胞裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，组分分别见步骤(1)中的制备方法。
[0135]
纳米粒子2(np2)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子2平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分。
[0136]
纳米粒子3(np3)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子3平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分。
[0137]
纳米粒子4(np4)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子4平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分。
[0138]
对照纳米粒子5(np5)为负载多种多肽的对照纳米粒子，所负载的多肽为3种肺癌新抗原多肽：mage-a3(序列：flwgpralv)、cea(序列：ylsganlnl)、muc1(序列：trpapgstappahgvtsapdtrpapgstap)。三种新抗原多肽质量比为1:1:1。纳米粒子5的制备过程同纳米粒子1，但是制备时不使用任何癌细胞裂解物组分而使用新抗原多肽，该纳米粒子5平均粒径为280nm左右，负载肺癌的新抗原多肽100μg，但是不负载任何癌细胞裂解物组分。
[0139]
对照纳米粒子6(np6)为空白对照纳米粒子，其制备过程同纳米粒子1，但是制备时不使用任何癌细胞裂解物组分，该纳米粒子6平均粒径为280nm左右，不负载任何癌细胞裂解物组分。
[0140]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0141]
非小细胞肺癌患者a在在经过免疫治疗后痊愈。分别在非小细胞肺癌患者a进行免疫治疗前和免疫治疗后两周抽取非小细胞肺癌癌症患者a的外周血10ml。从10ml非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法先分离得到外周血单个核细胞(pbmc)。pbmc的分离过程如下：将10ml血液分成两份每份5ml,在5ml新鲜血液中加入pbs按1:1稀释血液；取淋巴细胞分离液5ml于15ml灭菌离心管中待用；吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面；在室温将所得样品在2000rpm离心20min；此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状；小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞；在样品中填加5倍以上体积的pbs洗2次，每次在1500rpm离心10min；尔后弃去上清液并加入1640培养基1ml混匀，取少量pbmc进行细胞计数后备用。
[0142]
将纳米粒子1(50μg负载水溶性组分的纳米粒子+50μg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者纳米粒子2(100μg负载水溶性组分的纳米粒子)或者纳米粒子3(50μg负载水溶性组分的纳米粒子+50μg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者纳米粒子4(50μg负载水溶性组分的纳米粒子+50μg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者纳米粒子5(100μg)或者空白纳米粒子6(不负载任何裂解物组分)+等量的游离的混合癌细胞裂解液(与制备纳米粒子1的裂解液相同)与pbmc(50万个)在10ml的aim v无血清培养基中共孵育72小时(37℃，5％co2)；或者将单独将pbmc(50万个)在10ml的aim v无血清培养基中共孵育72小时(37℃，5％co2)。然后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性负载。然后采用cd3抗体，cd4抗体，cd8抗体对细胞进行细胞外染色，尔后固定细胞和对细胞进行破膜，并采用fn-γ抗体对t细胞进行细胞内染色。尔后采用流式细胞仪检测样本t细胞。分别分析cd4
+
t细胞中被激活后可以分泌ifn-γ的t细胞在所有cd4
+
t细胞中所占的比例和cd8
+
t细胞中被激活后可以分泌ifn-γ的t细胞在所有cd8
+
t细胞中所占的比例。以上cd4
+
ifn-γ
+
t细胞和cd8
+
ifn-γ
+
t细胞即为癌细胞特异性t细胞。
[0143]
或者从前述分离得到的pbmc种先使用磁珠分选法从pbmc中分选出t细胞，然后将t细胞(50万个)与纳米粒子1(50μg负载水溶性组分的纳米粒子+50μg负载非水溶性组分的纳米粒子)在10ml的aim v无血清培养基中共孵育72小时(37℃，5％co2)。然后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性负载。然后采用cd3抗体，cd4抗体，cd8抗体对细胞进行细胞外染色，尔后固定细胞和对细胞进行破膜，并采用fn-γ抗体对t细胞进行细胞内染色。尔后采用流式细胞仪检测样本t细胞。分别分析cd4
+
t细胞中被激活后可以分泌ifn-γ的t细胞在所有cd4
+
t细胞中所占的比例和cd8
+
t细胞中被激活后可以分泌ifn-γ的t细胞在所有cd8
+
t细胞中所占的比例。以上cd4
+
ifn-γ
+
t细胞和cd8
+
ifn-γ
+
t细胞即为癌细胞特异性t细胞。
[0144]
负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分的纳米粒子/微米粒子被抗原提呈细胞吞噬后，抗原会被降解成多肽抗原表位并与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合后被提呈到抗原提呈细胞膜表面。由于纳米粒子和微米粒子负载的全细胞抗原可以交叉提呈释放，所以癌细胞抗原表位可以通过mhc i和mch ii两个途径被提呈到抗原提呈细胞膜表面。将抗原提呈细胞细胞膜制备成纳米粒子或微米粒子后，其负载的mhc分子和抗原多肽复合物可以直接与t细胞表面的可以特异性识别癌细胞抗原的t细胞表面受体结合。而且，如果该t细胞为可以杀伤癌细胞的特异性t细胞，该癌细胞会开始分泌ifn-γ、颗粒酶、穿孔素等杀伤性物质，通过分析可以分泌杀伤性物质的t细胞的数量和比例，就可以得到具有癌细胞识别和杀伤能力的效应性癌细胞特异性t细胞的含量。
[0145]
(4)实验结果
[0146]
如图2所示，单独将pbmc进行孵育时没有检测到任何癌细胞特异性t细胞。单独使用t细胞和纳米粒子1共孵育后能检测到的癌细胞特异性t细胞很少，使用负载多种多肽的纳米粒子5能检测到的癌细胞特异性t细胞也很少。而纳米粒子1、纳米粒子2、纳米粒子3、纳米粒子4和纳米粒子6+游离裂解物组分都能辅助检测到一定含量的癌细胞特异性t细胞。其中，纳米粒子1和纳米粒子4效果最好，纳米粒子1和纳米粒子4的效果相同，且二者的效果优于纳米粒子2、纳米粒子3和纳米粒子6+游离裂解物组分。
[0147]
将pbmc与纳米粒子1共孵育进行检测的效果明显好于单独使用t细胞和纳米粒子1
共孵育后进行检测，说明检测过程需要抗原提呈细胞辅助激活。纳米粒子1与纳米粒子4效果相同，说明混合癌细胞系含有和覆盖了非小细胞肺癌患者自身肿瘤组织癌细胞中的抗原；纳米粒子1和纳米粒子4优于纳米粒子3说明单一一种癌细胞系无法包含和覆盖绝大部分癌症患者癌细胞中的抗原，而使用多种癌细胞系能够使癌细胞抗原种类多样化，优于使用一种癌细胞系；纳米粒子1优于纳米粒子2说明将全细胞抗原组分负载到纳米粒子中优于只将水溶性的抗原组分负载到纳米粒子中的检测效果；纳米粒子1优于纳米粒子6+游离裂解物组分说明裂解物抗原组分负载到纳米粒子后比游离状态更易被抗原提呈细胞吞噬和提呈，从而更好的激活和检测癌细胞特异性t细胞。
[0148]
综上所述，本发明所述的粒子系统可以更准确的检测癌症患者外周血中的癌细胞特异性t细胞。
[0149]
实施例2基于多个癌症患者肿瘤组织的纳米粒子用于癌细胞特异性t细胞的检测
[0150]
本实施例使用来自多个癌症患者的肿瘤组织制备纳米粒子(nanoparticle,np)，并以该纳米粒子辅助检测癌细胞特异性t细胞。以plga为骨架材料，以poly(i:c)和cpg 7909为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分的纳米粒子，然后使用纳米粒子激活和检测外周血免疫细胞中的癌细胞特异性t细胞。
[0151]
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
[0152]
收取20位非小细胞肺癌患者和10位小细胞肺癌患者肺部手术切除得到的肿瘤组织。将每位患者的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m盐酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m盐酸胍水溶液中可溶。将30位癌症患者的肿瘤组织中的水溶性组分都分别按照质量比1:1混合得到30位癌症患者水溶性组分的混合物；将30位癌症患者的肿瘤组织中的溶于6m盐酸胍的非水溶性组分都分别按照质量比1:1混合得到30位癌症患者非水溶性组分的混合物。将水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物按质量比1:3混合后即为制备纳米粒子1(np1)的抗原原料来源。
[0153]
在将上述20位非小细胞肺癌患者中其中一位非小细胞肺癌患者a的肺部手术切除得到的肿瘤组织按照上述方法处理得到患者a的肿瘤组织的水溶性组分和溶于6m盐酸胍水溶液的非水溶性组分，将水溶性组分和非水溶性组分都分别按照质量比1:3混合，即为制备纳米粒子2(np2)的抗原原料来源。
[0154]
收取1位非小细胞肺癌患者b的肺部手术切除得到的肿瘤组织，患者b不包括在上述30位癌症患者中。患者b的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m盐酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m盐酸胍水溶液中可溶。将水溶性组分和非水溶性组分按质量比1:3混合后即为制备纳米粒子3(np3)的抗原原料来源。
[0155]
收取1位非小细胞肺癌患者c的肺部手术切除得到的肿瘤组织，患者c不包括在在上述30位癌症患者中。患者c的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m盐酸胍水溶液溶解
沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m盐酸胍水溶液中可溶。将水溶性组分和非水溶性组分按质量比1:3混合后即为制备纳米粒子4(np4)的抗原原料来源。
[0156]
使用多种肺癌的新抗原多肽：制备纳米粒子5(np5)。所负载的多肽为3种肺癌新抗原多肽：mage-a3(序列：flwgpralv)、cea(序列：ylsganlnl)、muc1(序列：trpapgstappahgvtsapdtrpapgstap)。三种新抗原多肽质量比为1:1:1。
[0157]
(2)纳米粒子系统的制备
[0158]
本实施例中纳米粒子均采用溶剂挥发法制备。
[0159]
负载30位癌症患者肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子1(np1)制备材料plga分子量为7da-17kda，所采用的免疫佐剂为poly(i:c)和cpg7909且佐剂包载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原和佐剂，在内部负载抗原(裂解组分)后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为100nm左右；每1mg plga纳米粒子约负载10μg蛋白质和多肽组分，每1mgplga纳米粒所使用的poly(i:c)和cpg7909免疫佐剂各0.01mg。
[0160]
负载患者a的肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子2(np2)制备材料和制备方法同纳米粒子1。该纳米粒子2平均粒径为100nm左右；每1mg plga纳米粒子约负载10μg蛋白质和多肽组分，每1mgplga纳米粒所使用的poly(i:c)和cpg7909免疫佐剂各0.01mg。
[0161]
负载非小细胞肺癌患者b的肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子3(np3)制备材料和制备方法同纳米粒子1。该纳米粒子3(np3)平均粒径为100nm左右；每1mg plga纳米粒子约负载10μg蛋白质和多肽组分，每1mgplga纳米粒所使用的poly(i:c)和cpg7909免疫佐剂各0.01mg。
[0162]
负载患者c的肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子4(np4)制备材料和制备方法同纳米粒子1。该纳米粒子4平均粒径为100nm左右；每1mg plga纳米粒子约负载10μg蛋白质和多肽组分，每1mgplga纳米粒所使用的poly(i:c)和cpg7909免疫佐剂各0.01mg。
[0163]
负载多肽的全细胞组分的纳米粒子5(np5)制备材料和制备方法同纳米粒子1。该纳米粒子5平均粒径为100nm左右；每1mg plga纳米粒子约负载10μg肺癌新抗原多肽组分，每1mgplga纳米粒所使用的poly(i:c)和cpg7909免疫佐剂各0.01mg。
[0164]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0165]
非小细胞肺癌患者b在在经过免疫治疗后痊愈。非小细胞肺癌患者c在在经过免疫治疗后效果较差没有明显的治疗效果。分别在非小细胞肺癌患者b和非小细胞肺癌患者c进行免疫治疗前和免疫治疗完成后第2周抽取非小细胞肺癌癌症患者b的外周血10ml。从10ml非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法先分离得到外周血单个核细胞(pbmc)。pbmc的分离过程如前所述。
[0166]
将纳米粒子1(2mg)或者纳米粒子2(2mg)或者纳米粒子3(2mg)或者纳米粒子4(2mg)或者纳米粒子5(2mg)分别与患者b或者患者c的pbmc(100万个)在1ml的aim v无血清培养基中共孵育4小时(37℃，5％co2)。然后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性负载。然后采用cd3抗体，cd4抗体，cd8抗体对细胞进行细胞外染色，尔后固定细胞和对细胞进行破膜，并采用fn-γ抗体对t细胞进行细胞内染色。尔后采用流式细胞仪检测样本t细胞。分别分析cd4
+
t细胞中被激活后可以
分泌ifn-γ的t细胞在所有cd4
+
t细胞中所占的比例和cd8
+
t细胞中被激活后可以分泌ifn-γ的t细胞在所有cd8
+
t细胞中所占的比例。以上cd4
+
ifn-γ
+
t细胞和cd8
+
ifn-γ
+
t细胞即为癌细胞特异性t细胞。
[0167]
(4)实验结果
[0168]
如图3所示，荧光强度越强，说明该癌细胞特异性t细胞所表达的杀伤性物质越多，检测时灵敏度会更高准确性会越好。在检测患者b的外周血中的癌细胞特异性t细胞时，纳米粒子1和纳米粒子3检测效果最好；在检测患者c的外周血中的癌细胞特异性t细胞时，纳米粒子1和纳米粒子4检测效果最好。说明使用多个患者混合肿瘤组织制备的检测纳米粒子与使用患者字体肿瘤组织制备的检测纳米粒效果相同。这是因为多个癌症的肿瘤组织混合到一起后其含有更多样的癌细胞抗原，能够覆盖癌症患者自体肿瘤组织所含有的癌细胞抗原。所覆盖的癌细胞抗原越全面，所能检测出的癌细胞特异性t细胞才会越全面和准确。
[0169]
在检测患者b的外周血中的癌细胞特异性t细胞时，纳米粒子2、纳米粒子4和纳米粒子5的检测效果都没有纳米粒子1和纳米粒子3检测效果好。说明使用单个异体患者的肿瘤组织制备的检测纳米粒子和负载多种新抗原多肽的检测纳米粒子的检测效果都没有使用自体的肿瘤组织制备的检测纳米粒子效果好。这是因为单个异体癌症患者的肿瘤组织其含有的癌症抗原癌症患者自体肿瘤组织所含有的癌细胞抗原有部分差异。
[0170]
在检测患者c的外周血中的癌细胞特异性t细胞时，纳米粒子2、纳米粒子3和纳米粒子5的检测效果都没有纳米粒子1和纳米粒子4检测效果好。说明使用单个异体患者的肿瘤组织制备的检测纳米粒子和负载多种新抗原多肽的检测纳米粒子的检测效果都没有使用自体的肿瘤组织制备的检测纳米粒子效果好。
[0171]
而且，免疫治疗前癌症患者b和癌症患者c外周血中的癌细胞特异性t细胞含量相近，且含量都较低。而免疫治疗后，癌症患者b(癌症患者b免疫治疗疗效好)外周血的癌细胞特异性t细胞明显升高很多，癌症患者c(癌症患者c免疫治疗疗效差)外周血中的癌细胞特异性t细胞却没有明显升高。这说明癌症患者外周血中癌细胞特异性t细胞含量的升高与癌症免疫治疗的疗效正相关，本发明所述纳米粒子检测癌细胞特异性t细胞的含量的变化可以用来预测癌症患者的免疫治疗疗效和预后。
[0172]
由此可见，本发明所述的纳米粒子可以更好的检测具有识别癌细胞和杀伤癌细胞能力的癌细胞特异性t细胞。纳米粒子被抗原提呈细胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞表面，可以识别并激活癌细胞特异性t细胞并表达特异性表面标志物，通过流式细胞术等技术分析高表达特异性表面标志物的t细胞的比例，即可以知道被激活的可以识别和具有杀伤效能的癌细胞特异性t细胞的数量和比例。
[0173]
实施例3基于多个肺癌患者肿瘤组织的微米粒子用于癌细胞特异性t细胞的检测
[0174]
本实施例使用来自多个癌症患者的肿瘤组织制备微米粒子(micron particle,mp)，并以该微米粒子(mp)辅助检测癌细胞特异性t细胞。以plga为骨架材料采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分的微米粒子，然后使用微米粒子激活和检测外周血免疫细胞中的癌细胞特异性t细胞。
[0175]
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
[0176]
收取12位非小细胞肺癌患者和3位小细胞肺癌患者肺部手术切除得到的肿瘤组织。将每位患者的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并
可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m盐酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m盐酸胍水溶液中可溶。将15位癌症患者的肿瘤组织中的水溶性组分都分别按照质量比1:1混合得到15位癌症患者水溶性组分的混合物；将15位癌症患者的肿瘤组织中的溶于6m盐酸胍的非水溶性组分都分别按照质量比1:1混合得到15位癌症患者非水溶性组分的混合物。将水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物按质量比5:1混合后即为制备微米粒子1(mp1)的抗原原料来源。
[0177]
在将上述12位非小细胞肺癌癌患者中其中一位非小细胞肺癌患者a的肺部手术切除得到的肿瘤组织按照上述方法处理得到患者a的肿瘤组织的水溶性组分和溶于6m盐酸胍水溶液的非水溶性组分，将水溶性组分和非水溶性组分都分别按照质量比5:1混合，即为制备微米粒子2(mp2)的抗原原料来源。
[0178]
收取1位其他的非小细胞肺癌患者b的肺部手术切除得到的肿瘤组织，患者b不包括在上述15位癌症患者中。患者b的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m盐酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m盐酸胍水溶液中可溶。将水溶性组分和非水溶性组分按质量比5:1混合后即为制备微米粒子3(mp3)的抗原原料来源。
[0179]
收取另1位其他的非小细胞肺癌患者c的肺部手术切除得到的肿瘤组织，患者c不包括在在上述15位癌症患者中。患者c的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m盐酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m盐酸胍水溶液中可溶。将水溶性组分和非水溶性组分按质量比5:1混合后即为制备微米粒子4(mp4)的抗原原料来源。
[0180]
使用多种肺癌的新抗原多肽：制备微米粒子5(mp5)。所负载的多肽为3种肺癌新抗原多肽：mage-a3(序列：flwgpralv)、cea(序列：ylsganlnl)、muc1(序列：trpapgstappahgvtsapdtrpapgstap)。三种新抗原多肽质量比为1:1:1。
[0181]
(2)微米粒子的制备
[0182]
本实施例中微米粒子均采用溶剂挥发法制备。
[0183]
负载15位癌症患者肿瘤组织的全细胞组分的微米粒子1(mp1)制备材料plga分子量为38da-54kda。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载抗原，然后将100mg微米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥16h。该微米粒子1平均粒径为1.5μm左右；每1mg plga微米粒子约负载200μg蛋白质和多肽组分。
[0184]
负载患者a的肿瘤组织的全细胞组分的微米粒子2(mp2)制备材料和制备方法同微米粒子1。该微米粒子2平均粒径为1.5μm左右；每1mg plga微米粒子约负载200μg蛋白质和多肽组分。
[0185]
负载非小细胞肺癌患者b的肿瘤组织的全细胞组分的微米粒子3(mp3)制备材料和制备方法同微米粒子1。该微米粒子3平均粒径为1.5μm左右；每1mg plga微米粒子约负载
200μg蛋白质和多肽组分。
[0186]
负载患者c的肿瘤组织的全细胞组分的微米粒子4(mp4)制备材料和制备方法同微米粒子1。该微米粒子4平均粒径为1.5μm左右；每1mg plga微米粒子约负载200μg蛋白质和多肽组分。
[0187]
负载多肽的全细胞组分的微米粒子5(np5)制备材料和制备方法同微米粒子1。该微米粒子5平均粒径为1.5μm左右；每1mg plga微米粒子约负载200μg肺癌新抗原多肽组分。
[0188]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0189]
非小细胞肺癌患者b在在经过免疫治疗后痊愈。非小细胞肺癌患者c在在经过免疫治疗后效果较差没有明显的治疗效果。分别在非小细胞肺癌患者b和非小细胞肺癌患者c进行免疫治疗前和免疫治疗完成后第2周抽取非小细胞肺癌癌症患者b的外周血10ml。从10ml非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法先分离得到外周血单个核细胞(pbmc)。pbmc的分离过程如前所述。
[0190]
将微米粒子1(0.1mg)或者微米粒子2(0.1mg)或者微米粒子3(0.1mg)或者微米粒子4(0.1mg)或者微米粒子5(0.1mg)分别与pbmc(100万个)在1ml的aim v无血清培养基中共孵育4小时(37℃，5％co2)。然后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性吸附。然后采用cd3抗体，cd4抗体，cd8抗体和il-2受体(il-2r)抗体对细胞进行染色。尔后采用流式细胞仪检测样本t细胞。分别分析cd4
+
t细胞中被激活高表达il-2受体的t细胞在所有cd4
+
t细胞中所占的比例和cd8
+
t细胞中被激活高表达il-2受体的t细胞在所有cd8
+
t细胞中所占的比例。以上cd4
+
il-2r
+
t细胞和cd8
+
il-2r
+
t细胞即为癌细胞特异性t细胞。
[0191]
(4)实验结果
[0192]
如图4所示在检测患者b的外周血中的癌细胞特异性t细胞时，微米粒子1和微米粒子3检测效果最好；在检测患者c的外周血中的癌细胞特异性t细胞时，微米粒子1和微米粒子4检测效果最好。说明使用多个患者混合肿瘤组织制备的检测微米粒子与使用患者字体肿瘤组织制备的检测微米粒效果相同。
[0193]
在检测患者b的外周血中的癌细胞特异性t细胞时，微米粒子2、微米粒子4和微米粒子5的检测效果都没有微米粒子1和微米粒子3检测效果好。说明使用单个异体患者的肿瘤组织制备的检测微米粒子和负载多种新抗原多肽的检测微米粒子的检测效果都没有使用自体的肿瘤组织制备的检测微米粒子效果好。在检测患者c的外周血中的癌细胞特异性t细胞时，微米粒子2、微米粒子3和微米粒子5的检测效果都没有微米粒子1和微米粒子4检测效果好。
[0194]
而且，免疫治疗前癌症患者b和癌症患者c外周血中的癌细胞特异性t细胞含量相近，且含量都较低。而免疫治疗后，癌症患者b(癌症患者b免疫治疗疗效好)外周血的癌细胞特异性t细胞明显升高很多，癌症患者c(癌症患者c免疫治疗疗效差)外周血中的癌细胞特异性t细胞却没有明显升高。这说明癌症患者外周血中癌细胞特异性t细胞含量的升高与癌症免疫治疗的疗效正相关，本发明所述微米粒子检测癌细胞特异性t细胞的含量的变化可以用来预测癌症患者的免疫治疗疗效和预后。
[0195]
实施例4结肠癌中癌细胞特异性t细胞的检测
[0196]
本实施例使用来自多个癌症患者的肿瘤组织制备微米粒子，并以该微米粒子辅助
检测癌细胞特异性t细胞。以pla为骨架材料采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织组分的微米粒子，然后使用微米粒子激活和检测外周血免疫细胞中的癌细胞特异性t细胞。
[0197]
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
[0198]
收取6位结肠癌患者手术切除得到的肿瘤组织。将每位患者的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8m尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在10％辛基葡萄糖苷水溶液中可溶。在水溶性组分(80mg/ml)中加入胰蛋白酶(trypsin，0.5mg/ml)和糜蛋白酶(chymotrypsin，0.5mg/ml)共孵育酶解1小时，然后在95℃加热10分钟灭活蛋白酶备用。将6位癌症患者的肿瘤组织中的水溶性组分都分别按照质量比1:1混合得到15位癌症患者水溶性组分的混合物；将6位癌症患者的肿瘤组织中的溶于10％辛基葡萄糖苷非水溶性组分都分别按照质量比1:1混合得到6位癌症患者非水溶性组分的混合物。将水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物按质量比5:1混合后即为制备微米粒子1(mp1)的抗原原料来源。
[0199]
收取1位其他的结肠癌癌患者a的手术切除得到的肿瘤组织，患者a不包括在上述6位癌症患者中。将患者a的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8m尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在10％辛基葡萄糖苷水溶液中可溶。在水溶性组分(80mg/ml)中加入胰蛋白酶(trypsin，0.5mg/ml)和糜蛋白酶(chymotrypsin，0.5mg/ml)共孵育1小时，然后在95℃加热10分钟灭活蛋白酶备用。将水溶性组分和非水溶性组分按质量比5:1混合后即为制备微米粒子2(mp2)的抗原原料来源。
[0200]
(2)微米粒子的制备
[0201]
本实施例中微米粒子1采用溶剂挥发法制备。微米粒子1制备材料为peg2000-pla(分子量为40kda)和pla(分子量为40kda)，其中为peg2000-pla(分子量为40kda)和pla(分子量为40kda)的质量比19:1。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载裂解物混合物，在然后将100mg微米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥24h。微米粒子1平均粒径为5.0μm左右，每1mg pla微米粒子1约负载240μg蛋白质或多肽组分，每1mgpla微米粒含有cpgm362、cpg1018和poly iclc免疫佐剂各0.04mg。
[0202]
本实施例中微米粒子2采用溶剂挥发法制备。微米粒子2制备材料为peg2000-pla(分子量为40kda)和pla(分子量为40kda)，其中为peg2000-pla(分子量为40kda)和pla(分子量为40kda)的质量比19:1。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载裂解物，在然后将100mg微米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥24h。微米粒子2平均粒径为5.0μm左右，每1mg pla微米粒子2约负载240μg蛋白质或多肽组分，每1mgpla微米粒子含有cpgm362、cpg1018和poly iclc免疫佐剂各0.04mg。
[0203]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0204]
患者a在手术切除肿瘤组织后进行了免疫治疗，而且免疫治疗后患者有很好的疗
效，肿瘤块持续缩小。分别在患者免疫治疗前和免疫治疗后的第三周，分别抽取癌症患者外周血5ml。从外周血中首先分离出pbmc，然后使用磁珠法从pbmc中分别分选出t细胞和b细胞。
[0205]
先将所得b细胞(100万个)和500μg的微米粒子(微米粒子1，或者微米粒子2)、il-2(100u/ml)、il-7(500u/ml)及il-15(50u/ml)在5ml aim v无血清培养基中共孵育3小时(37℃，5％co2)，孵育后收集b细胞后在400g离心5分钟，然后再将孵育后的b细胞重悬后和相应的t细胞(50万个)在1ml aim v无血清培养基中共孵育3小时(37℃，5％co2)。尔后收集上清液并采用双抗体夹心法酶联免疫吸附法(elisa)检测上清液中ifn-γ的浓度，ifn-γ的浓度的高低可说明癌细胞特异性t细胞含量的多少：ifn-γ的浓度越高说明癌细胞特异性t细胞含量越多；ifn-γ的浓度越低说明癌细胞特异性t细胞含量越少。
[0206]
(4)实验结果
[0207]
如图5所示，微米粒子1和微米粒子2在患者外周中所检测到的ifn-γ的浓度无显著性差异，说明两种微米粒子检测能力相同。而且，患者免疫治疗后外周血中癌细胞特异性t细胞明显增多。这说明本发明所述纳米粒子或微米粒子通过检测癌细胞特异性t细胞可以预估癌症免疫治疗效果。
[0208]
实施例5结肠癌中癌细胞特异性t细胞的检测
[0209]
本实施例使用来自多个癌症患者的肿瘤组织制备微米粒子，并以该微米粒子辅助检测癌细胞特异性t细胞。以plga为骨架材料采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织组分的微米粒子，然后使用微米粒子激活和检测外周血免疫细胞中的癌细胞特异性t细胞。
[0210]
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
[0211]
收取6位结肠癌患者手术切除得到的肿瘤组织。将每位患者的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后加入适量2m盐酸氨基脲裂解细胞。待细胞裂解后，使用2m盐酸氨基脲水溶液溶解全细胞裂解物组分。将6位癌症患者的肿瘤组织裂解物组分按质量比1:1:1:1:1:1混合得到6位癌症患者的肿瘤组织裂解物混合物，即为制备微米粒子1(mp1)的抗原原料来源。
[0212]
收取1位其他的结肠癌癌患者a的手术切除得到的肿瘤组织，患者a不包括在上述6位癌症患者中。将患者a的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后加入适量2m盐酸氨基脲裂解细胞。待细胞裂解后，使用2m盐酸氨基脲水溶液溶解全细胞裂解物组分，即为制备微米粒子2(mp2)的抗原原料来源。
[0213]
(2)微米粒子的制备
[0214]
本实施例中微米粒子1(mp1)采用溶剂挥发法制备。微米粒子1制备材料plga分子量为24-38kda，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载裂解物混合物，在然后将100mg微米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥12h。微米粒子1平均粒径为2.5μm左右，每1mg plga微米粒子1约负载20μg蛋白质或多肽组分。
[0215]
本实施例中微米粒子2(mp2)采用溶剂挥发法制备。微米粒子2制备材料plga分子量为24-38kda，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载裂解物，在然后将100mg微米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥12h。微米粒子2平均粒径为2.5μm左右，每1mg plga微米粒子2约负载20μg蛋
白质或多肽组分。
[0216]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0217]
患者a在手术切除肿瘤组织后进行了放射治疗，而且放射治疗后患者有很好的疗效，肿瘤块消失。分别在患者免疫治疗前和放射治疗后的第4周，分别抽取癌症患者外周血15ml，从外周血中分离出pbmc。
[0218]
本实施例使用酶联免疫斑点法(elispot)检测被激活后的癌细胞特异性t细胞所分泌的ifn-γ。首先在96孔板中预包被吸附抗体(ifn-γ)，然后将所得pbmc细胞(2万个)和10μg的微米粒子(微米粒子1，或者微米粒子2)加入200μl的aim v无血清培养基中共孵育12小时(37℃，5％co2)，孵育结束后弃去细胞后加入检测抗体以及后续试剂，最后在孔板中形成斑点，并使用检测仪分析每一个孔中的斑点数。斑点越多说明癌细胞特异性t细胞越多，反之亦然。
[0219]
(4)实验结果
[0220]
如图6所示，微米粒子1和微米粒子2在患者外周中所检测到的癌细胞特异性t细胞数量无显著性差异，说明两种微米粒子检测能力相同。而且，患者经过放射治疗后外周血中癌细胞特异性t细胞明显增多。这说明本发明所述纳米粒子或微米粒子通过检测癌细胞特异性t细胞可以预估癌症放射治疗效果。
[0221]
实施例6乳腺癌中癌细胞特异性t细胞的检测
[0222]
本实施例使用来自多个乳腺癌癌症患者的肿瘤组织制备纳米粒子，并以该纳米粒子辅助检测外周血或者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞。
[0223]
(1)癌细胞的裂解
[0224]
收取12位三阴性乳腺癌患者手术切除得到的肿瘤组织。将每位患者的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后加入超纯水中，然后反复冻融5遍并伴有超声以裂解肿瘤组织中的癌细胞。在所裂解癌细胞中加入1mg/ml的核酸酶降解裂解物中的核酸，然后在95℃加热10分钟灭活核酸酶，然后在5000g离心5分钟收集上清液即为水溶性组分，沉淀使用10％脱氧胆酸钠溶解即为非水溶性组分。将12位乳腺癌患者的水溶性组分裂解物都按照质量比1:1混合后得到水溶性组分混合物；将12位乳腺癌患者的非水溶性组分裂解物都按照质量比1:1混合后得到非水溶性组分混合物。将水溶性组分混合物与非水溶性组分混合物按质量比5:1混合即为制备纳米粒子1(np1)的抗原组分1。
[0225]
收取另一位三阴性乳腺癌患者a手术切除得到的肿瘤组织。a患者不包括在上述12位癌症患者内。肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后加入超纯水中，然后反复冻融5遍并伴有超声以裂解癌细胞。在所裂解癌细胞中加入1mg/ml的核酸酶降解裂解物中的核酸，然后在95℃加热10分钟灭活核酸酶，然后在5000g离心5分钟收集上清液即为水溶性组分，沉淀使用10％脱氧胆酸钠溶解即为非水溶性组分，将水溶性组分与非水溶性组分按质量比5:1混合即为制备纳米粒子2(np2)的抗原组分2。
[0226]
(2)纳米粒子的制备
[0227]
本实施例中制备纳米粒子采用复乳法。纳米粒子1骨架材料plga分子量为10kda-20kda，所采用的免疫佐剂为cpg2395(c类)、cpg1018(b类)和poly iclc。制备时采用复乳法制备内部负载抗原组分1和佐剂的纳米粒子,然后将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该纳米粒子粒径为280nm左右，每
1mg plga纳米粒子约负载150μg蛋白质或多肽组分，负载cpg2395、cpg1018和poly(i:c)各0.02mg。
[0228]
纳米粒子2骨架材料plga分子量为10kda-20kda，所采用的免疫佐剂为cpg2395(c类)、cpg1018(b类)和poly iclc。制备时采用复乳法制备内部负载抗原组分2和佐剂的纳米粒子,然后将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该纳米粒子粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载150μg蛋白质或多肽组分，负载cpg2395、cpg1018和poly(i:c)各0.02mg。
[0229]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0230]
患者a在手术切除肿瘤组织后经过了癌症免疫治疗，且经过治疗后疗效很好，肿瘤块逐渐变小。分别在免疫治疗前或者免疫治疗后抽取患者10ml外周血。然后从外周血中分离出pbmc。
[0231]
将pbmc(600万个)、il-7(10ng)、il-15(10ng)与20μg纳米粒子(分别为纳米粒子1或者纳米粒子2)在2ml aim v无血清培养基中培养基中共孵育72小时(37℃，5％co2)。孵育后收集细胞并使用流式抗体依次标记细胞，然后使用流式细胞术分析cd3
+
cd25
+
t细胞在总的cd3
+
t细胞中的含量，即为癌细胞特异性t细胞。
[0232]
或者将pbmc(600万个)、il-7(10ng)、il-15(10ng)与5ng纳米粒子(分别为纳米粒子1或者纳米粒子2)在2ml aim v无血清培养基中培养基中共孵育72小时(37℃，5％co2)。孵育后收集细胞并使用流式抗体依次标记细胞，然后使用流式细胞术分析cd3
+
cd25
+
t细胞在总的cd3
+
t细胞中的含量，即为癌细胞特异性t细胞。
[0233]
或者将pbmc(600万个)、il-7(10ng)、il-15(10ng)与100mg纳米粒子(分别为纳米粒子1或者纳米粒子2)在2ml aim v无血清培养基中培养基中共孵育72小时(37℃，5％co2)。孵育后收集细胞并使用流式抗体依次标记细胞，然后使用流式细胞术分析cd3
+
cd25
+
t细胞在总的cd3
+
t细胞中的含量，即为癌细胞特异性t细胞。
[0234]
(4)实验结果
[0235]
如图7所示，与对照组相比，2种纳米粒子均可以辅助检测癌细胞特异性t细胞，其中，纳米粒子1纳米粒子2效果相似。而且，使用适当浓度(10μg/ml)纳米粒子检测的效果明显好于使用太低浓度(2.5ng/ml)或者太高浓度(50mg/ml)。
[0236]
实施例7胰腺癌中癌细胞特异性t细胞的检测
[0237]
本实施例以cd19抗体为靶头说明如何使用主动靶向纳米粒辅助检测外周血中的癌细胞特异性t细胞。
[0238]
(1)癌细胞的裂解
[0239]
收取10位胰腺癌患者手术切除得到的肿瘤组织。将每位患者的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后加入超纯水中，然后反复冻融5遍并伴有超声以裂解癌细胞，然后在95℃加热10分钟后在5000g离心5分钟收集上清液即为水溶性组分，沉淀使用10％十二烷基硫酸钠(sds)溶解即为非水溶性组分。将10位胰腺癌患者的水溶性组分裂解物都按照质量比1:1混合后得到水溶性组分混合物；将10位胰腺癌患者的非水溶性组分裂解物都按照质量比1:1混合后得到非水溶性组分混合物。将水溶性组分混合物与非水溶性组分混合物按质量比1:1混合即为制备纳米粒子1的抗原原料来源。
[0240]
收取另一位胰腺癌患者a手术切除得到的肿瘤组织。a患者不包括在上述10位癌症
患者内。肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后加入超纯水中，然后反复冻融5遍并伴有超声以裂解癌细胞，然后在95℃加热10分钟后在5000g离心5分钟收集上清液即为水溶性组分，沉淀使用10％十二烷基硫酸钠(sds)溶解即为非水溶性组分。将水溶性组分与非水溶性组分按质量比1:1混合即为制备纳米粒子2的原料来源。
[0241]
(2)纳米粒子的制备
[0242]
本实施例中制备纳米粒子采用复乳法。纳米粒子1骨架材料为plga(分子量20kda-40kda)和cd19抗体-peg5000-plga(20-40kda)的混合物，且二者比例为9:1。制备时采用复乳法制备内部负载裂解物组分的纳米粒子,然后将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该纳米粒子粒径为350nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载50μg蛋白质或多肽组分。
[0243]
纳米粒子2骨架材料plga(分子量20kda-40kda)和cd19抗体-peg5000-plga(20-40kda)的混合物，且二者比例为9:1。制备时采用复乳法制备内部负载裂解物组分的纳米粒子,然后将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该纳米粒子粒径为350nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载50μg蛋白质或多肽组分。
[0244]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0245]
患者a在手术切除肿瘤组织后经过了癌症免疫治疗，且经过治疗后疗效很好，肿瘤块逐渐变小。分别在免疫治疗前或者免疫治疗后抽取患者12ml外周血。然后从外周血中分离出pbmc。将pbmc(1000万个)和500μg纳米粒子(分别为纳米粒子1或者纳米粒子2或者纳米粒子3)在2ml aim v无血清培养基中培养基中共孵育12小时(37℃，5％co2)。孵育后收集细胞并使用流式抗体依次标记细胞，然后使用流式细胞术分析cd3
+
cd69
+
t细胞在总的cd3
+
t细胞中的含量，即为癌细胞特异性t细胞。
[0246]
(4)实验结果
[0247]
如图8所示，纳米粒子1和纳米粒子2效果相同。说明多个异体癌症患者的肿瘤组织制备的纳米粒子检测癌细胞特异性t细胞的效果与癌症患者字体肿瘤组织制备的纳米粒子检测癌细胞特异性t细胞的效果相当。实施中使用cd19抗体作为主动靶向的靶头，在实际应用中也可以使用甘露糖、cd32抗体、cd20抗体、甘露聚糖、cd205抗体等任何具有靶向靶细胞能力的靶头。
[0248]
实施例8纳米粒子检测黑色素瘤中的癌细胞特异性t细胞
[0249]
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
[0250]
收集5位黑色素瘤患者的肿瘤组织。将5位患者的肿瘤组织按照质量比1:1:1:1:1混合后切块并研磨，然后通过细胞过滤网后加入适量8m尿素水溶液裂解上述细胞，并使用8m尿素水溶液完全溶解肿瘤组织裂解物组分，即为制备纳米粒子1和纳米粒子2的抗原组分1。
[0251]
收集另外一位黑色素瘤患者a的肿瘤组织。a患者不包括在上述5位癌症患者内。将患者a的肿瘤组织切块并研磨，然后通过细胞过滤网后加入适量8m尿素水溶液裂解上述细胞，并使用8m尿素水溶液完全溶解肿瘤组织裂解物组分，即为制备纳米粒子3和纳米粒子4的抗原组分2。
[0252]
(2)纳米粒子的制备
[0253]
本实施例中纳米粒1(np1)采用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料为plga分子量都为10kda-30kda，并使用了增加溶酶体免疫逃逸的物质kala多肽(weaklakalakalakhlakalakalkacea)，且裂解物组分和kala多肽包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分和kala多肽，然后将100mg纳米粒子在12000g离心25分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为250nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，每1mg plga纳米粒负载kala多肽0.15mg。
[0254]
纳米粒2(np2)的制备材料和方法相同，其粒径为250nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载0.01μg蛋白质或多肽组分，每1mg plga纳米粒负载kala多肽0.15mg。
[0255]
纳米粒子3(np3)的制备材料和制备方法相同，为250nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分，每1mg plga纳米粒负载kala多肽0.15mg。
[0256]
纳米粒子4(np4)的制备材料和制备方法相同，为250nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载0.01μg蛋白质或多肽组分，每1mg plga纳米粒负载kala多肽0.15mg。
[0257]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0258]
患者a在手术切除肿瘤组织后经过了癌症免疫治疗，且经过治疗后疗效很好，肿瘤块逐渐变小。分别在免疫治疗前或者免疫治疗后抽取患者12ml外周血。然后从外周血中分离出pbmc。将pbmc(1000万个)和100μg纳米粒子(分别为纳米粒子1或者纳米粒子2或者纳米粒子3)在10ml aim v无血清培养基中培养基中共孵育96小时(37℃，5％co2)。孵育后收集细胞并使用流式抗体依次标记细胞，然后使用流式细胞术分析cd3
+
hla-dr
+
t细胞在总的cd3
+
t细胞中的含量，即为癌细胞特异性t细胞。
[0259]
(4)实验结果
[0260]
如图9所示，负载多个异体癌症患者肿瘤组织混合物制备的纳米粒子检测效果与使用癌症患者自体肿瘤组织制备的纳米粒子的检测效果无显著性差异。而且，负载适当抗原组分的纳米粒子好于只负载低含量抗原组分的纳米粒子。
[0261]
实施例9肺癌中癌细胞特异性t细胞的检测
[0262]
本实施例中，首先肺癌肿瘤组织进行灭活和变性处理，尔后裂解细胞，并以6m盐酸胍水溶液溶解裂解肿瘤组织全细胞组分。然后，以plga为纳米粒子骨架材料，以cpg2007、cpg1018、和poly iclc为免疫佐剂，以聚精氨酸和聚赖氨酸为增强溶酶体逃逸的物质，制备负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子，用于检测癌细胞特异性t细胞。
[0263]
(1)癌细胞的裂解
[0264]
收集10位非小细胞肺癌患者的肿瘤组织。将10位患者的肿瘤组织按照质量比1:1:1:1:1：1:1:1:1:1混合后切块并研磨，然后通过细胞过滤网后加入适量6m盐酸胍水溶液裂解上述细胞，并使用6m盐酸胍水溶液完全溶解肿瘤组织裂解物组分，即为制备纳米粒子1(np1)的抗原原料来源。
[0265]
收集非小细胞肺癌患者a的肿瘤组织。a患者不包括在上述10位癌症患者内。将患者a的肿瘤组织切块并研磨，然后通过细胞过滤网后加入适量8m尿素水溶液裂解上述细胞，并使用8m尿素水溶液完全溶解肿瘤组织裂解物组分，即为制备纳米粒子2的抗原原料来源。
[0266]
(2)纳米粒子的制备
[0267]
本实施例中制备纳米粒子1(np1)制备采用复乳法，纳米粒子1骨架材料plga分子
量为10kda-20kda，所采用的免疫佐剂为cpg7909、cpg1018和poly iclc，所采用的溶酶体逃逸增加物质为聚精氨酸和聚赖氨酸。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分、佐剂和增加溶酶体逃逸的纳米粒子,然后将100mg纳米粒子在13000g离心20分钟，使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该纳米粒子粒径为500nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载50μg蛋白质或多肽组分，含cpg7909、cpg1018和poly iclc各0.01mg，含聚精氨酸和聚赖氨酸各0.02mg。
[0268]
本实施例中制备纳米粒子2(np2)制备同纳米粒子1。纳米粒子2粒径为500nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载50μg蛋白质或多肽组分，含cpg7909、cpg1018和poly iclc各0.01mg，含聚精氨酸和聚赖氨酸各0.02mg。
[0269]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0270]
患者a在手术切除肿瘤组织后经过了癌症免疫治疗，且经过治疗后疗效很好，肿瘤块逐渐变小。分别在免疫治疗前或者免疫治疗后抽取患者12ml外周血。然后从外周血中分离出pbmc。将pbmc(1000万个)和100μg纳米粒子(分别为纳米粒子1或者纳米粒子2或者纳米粒子3)在20ml aim v无血清培养基中培养基中共孵育12小时(37℃，5％co2)。孵育后收集细胞并使用不同荧光探针修饰的cd3抗体、cd4抗体、cd8抗体和cd69抗体染色，然后采用流式细胞术检测细胞中的cd8
+
cd69
+
cd34
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例以及cd4
+
cd69
+
cd34
+
t细胞占cd4
+
t细胞的比例，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性t细胞。
[0271]
(4)实验结果
[0272]
如图10所示，负载多个异体癌症患者肿瘤组织混合物制备的纳米粒子检测效果与使用癌症患者自体肿瘤组织制备的纳米粒子的检测效果无显著性差异。
[0273]
实施例10纳米粒子用于检测肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞
[0274]
本实施例使用纳米粒子(nanoparticle,np)检测的癌症患者的癌细胞特异性t细胞。本实施例中，将多种人肺癌的癌细胞系中的水溶性组分和非水溶性组分负载到纳米粒子，然后，以该纳米粒子辅助检测非小细胞肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞。
[0275]
(1)多种肺癌细胞系各组分的收集
[0276]
分别培养人肺癌细胞系a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞，其中a549细胞、h1299细胞、pc9细胞和h1437细胞属于肺癌亚型肺腺癌细胞系，h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞属于肺癌亚型肺鳞癌细胞系。
[0277]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比5:5:1:1:1:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，将细胞沉淀使用超纯水重悬后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解癌细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.3m胍基琥珀酸钠溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.3m胍基琥珀酸钠水溶液中可溶。将水溶性组分和非水溶性组分按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子1(np1)的抗原组分1。
[0278]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比5:5:1:1:1:1:1:1:1混合，
然后离心后去除培养基，将细胞沉淀使用超纯水重悬后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解癌细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.3m胍基琥珀酸钠溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.3m胍基琥珀酸钠水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.3m胍基琥珀酸钠水溶液备用，将上清液在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.3m胍基琥珀酸钠水溶液；然后将使用0.3m胍基琥珀酸钠溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后即为水溶性组分中的蛋白质多肽抗原组分。将以上非水溶性组分和水溶性组分中的蛋白质多肽组分按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子2(np2)的抗原组分2。
[0279]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比5:5:1:1:1:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，将细胞沉淀使用超纯水重悬后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解癌细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.3m胍基琥珀酸钠溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.3m胍基琥珀酸钠水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和碳酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.3m胍基琥珀酸钠水溶液备用，将上清液在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.3m胍基琥珀酸钠水溶液；然后将使用0.3m胍基琥珀酸钠溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后即为水溶性组分中的蛋白质多肽抗原组分。将以上非水溶性组分和水溶性组分中的蛋白质多肽组分按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子3(np3)的抗原组分3。
[0280]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后加入适量超纯水后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解肿瘤组织中的细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.3m胍基琥珀酸钠溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.3m胍基琥珀酸钠水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.3m胍基琥珀酸钠水溶液备用，将上清液在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.3m胍基琥珀酸钠水溶液；然后将使用0.3m胍基琥珀酸钠溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后即为水溶性组分中的蛋白质多肽抗原组分。将以上非水溶性组分和水溶性组分中的蛋白质多肽组分按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子4(np4)的抗原组分4。
[0281]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后加入适量超纯水后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解肿瘤组织中的细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.3m胍基琥珀酸钠溶解沉淀部
分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.3m胍基琥珀酸钠水溶液中可溶。以上即为制备纳米粒子5(np5)的抗原组分5。
[0282]
(2)负载全细胞组分的纳米粒子的制备
[0283]
本实施例中纳米粒子1(np1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料plga分子量为10kda-30kda，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分和佐剂，在内部负载细胞裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载5μg蛋白质或多肽组分。
[0284]
纳米粒子2(np2)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子2平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载5μg蛋白质或多肽组分。
[0285]
纳米粒子3(np3)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子3平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载5μg蛋白质或多肽组分。
[0286]
纳米粒子4(np4)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子4平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载5μg蛋白质或多肽组分。
[0287]
纳米粒子5(np5)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子5平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载5μg蛋白质或多肽组分。
[0288]
对照纳米粒子6(np6)为负载多种多肽的对照纳米粒子，所负载的多肽为3种肺癌新抗原多肽：mage-a3(序列：flwgpralv)、cea(序列：ylsganlnl)、muc1(序列：trpapgstappahgvtsapdtrpapgstap)。三种新抗原多肽质量比为1:1:1。纳米粒子5的制备过程同纳米粒子1，但是制备时不使用任何癌细胞裂解物组分而使用新抗原多肽，该纳米粒子6平均粒径为280nm左右，负载肺癌的新抗原多肽5μg，但是不负载任何癌细胞裂解物组分。
[0289]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0290]
非小细胞肺癌患者a在在经过免疫治疗后痊愈。分别在非小细胞肺癌患者a进行免疫治疗前和免疫治疗后两周抽取非小细胞肺癌癌症患者a的外周血10ml。从10ml非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(pbmc)。
[0291]
将纳米粒子1(10mg)或者纳米粒子2(10mg)或者纳米粒子3(10mg)或者纳米粒子4(10mg)或者纳米粒子5(10mg)或者纳米粒子6(10mg)与pbmc(100万个)在1ml的aim v无血清培养基中共孵育12小时(37℃，5％co2)；或者对照组只将pbmc(100万个)单独在1ml的aim v无血清培养基中共孵育12小时(37℃，5％co2)。然后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性负载，然后采用cd3抗体和颗粒酶b(granzyme b)抗体进行染色。尔后采用流式细胞仪检测样本t细胞。分析cd3
+
granzyme b
+
的t细胞在所有cd3
+
t细胞中所占的比例即为癌细胞特异性t细胞。
[0292]
(4)实验结果
[0293]
如图11所示，单独孵育pbmc没有任何被激活的癌细胞特异性t细胞；使用负载多种多肽的纳米粒子6能检测到很少的癌细胞特异性t细胞，纳米粒子1、纳米粒子2、纳米粒子3、纳米粒子4和纳米粒子5都能辅助检测到更多的癌细胞特异性t细胞。而且，纳米粒子1和纳米粒子5效果相同，纳米粒子2和纳米粒子4效果相同，而且纳米粒子2和纳米粒子4效果好于纳米粒子1和纳米粒子5，这说明使用特定方法将蛋白质多肽组分分离纯化出来再负载到纳米粒子效果更好。而且，纳米粒子2好于纳米粒子3，说明使用特定的盐析试剂效果更好。综
上所述，本发明所述的粒子系统可以更准确的检测癌症患者外周血中的癌细胞特异性t细胞。
[0294]
实施例11纳米粒子用于检测肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞
[0295]
本实施例使用纳米粒子(nanoparticle,np)检测的癌症患者的癌细胞特异性t细胞。本实施例中，将多种人肺癌的癌细胞系中的水溶性组分和非水溶性组分负载到纳米粒子，然后，以该纳米粒子辅助检测非小细胞肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞。
[0296]
(1)多种肺癌细胞系各组分的收集
[0297]
分别培养人肺癌细胞系a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞，其中a549细胞、h1299细胞、pc9细胞和h1437细胞属于肺癌亚型肺腺癌细胞系，h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞属于肺癌亚型肺鳞癌细胞系。
[0298]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比1:1:1:1:1:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，然后加入含有0.1％蛋白酶抑制剂的超纯水重悬细胞后反复冻融5次并加入6m盐酸胍裂解癌细胞，然后使用6m盐酸胍水溶液溶解裂解物组分，将裂解物组分与含有癌症相关抗原wt1
235-243-io102(gasaygslcytwnqmnldtllkalleiasclekalqvfcytwnq)的多肽和含有癌症相关抗原wt1
294-312 io103(frgiqdvrrvsgvaptlvr-eqclsaftl-fmtywhllnaftvtvpkdl)的多肽按质量比10:1:1混合后即为制备纳米粒子1(np1)的抗原组分1。
[0299]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比1:1:1:1:1:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，然后加入含有0.1％蛋白酶抑制剂的超纯水重悬细胞后反复冻融5次并加入6m盐酸胍裂解癌细胞，然后使用6m盐酸胍水溶液溶解裂解物组分。然后在上述样品中逐滴加入饱和氯化钠水溶液，尔后将样品在10000g离心25分钟，弃去上清液后将沉淀二次溶解于6m盐酸胍水溶液，将上述所得组分与含有癌症相关抗原wt1
235-243-io102(gasaygslcytwnqmnldtllkalleiasclekalqvfcytwnq)的多肽和含有癌症相关抗原wt1
294-312 io103(frgiqdvrrvsgvaptlvr-eqclsaftl-fmtywhllnaftvtvpkdl)的多肽按质量比10:1:1混合后即为制备纳米粒子2(np2)的抗原组分2。
[0300]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比1:1:1:1:1:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，然后加入含有0.1％蛋白酶抑制剂的超纯水重悬细胞后反复冻融5次并加入6m盐酸胍裂解癌细胞，然后使用6m盐酸胍水溶液溶解裂解物组分。然后在上述样品中逐滴加入饱和碳酸镁水溶液，尔后将样品在10000g离心25分钟，弃去上清液后将沉淀二次溶解于6m盐酸胍水溶液，将上述所得组分与含有癌症相关抗原wt1
235-243-io102(gasaygslcytwnqmnldtllkalleiasclekalqvfcytwnq)的多肽和含有癌症相关抗原wt1
294-312 io103(frgiqdvrrvsgvaptlvr-eqclsaftl-fmtywhllnaftvtvpkdl)的多肽按质量比10:1:1混合后即为制备纳米粒子3(np3)的抗原组分3。
[0301]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌
患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后加入含有0.1％蛋白酶抑制剂的超纯水重悬细胞后反复冻融5次并加入6m盐酸胍裂解癌细胞，然后使用6m盐酸胍水溶液溶解裂解物组分。然后在上述样品中逐滴加入饱和氯化钠水溶液，尔后将样品在10000g离心25分钟，弃去上清液后将沉淀二次溶解于6m盐酸胍水溶液，将上述所得组分与含有癌症相关抗原wt1
235-243-io102(gasaygslcytwnqmnldtllkalleiasclekalqvfcytwnq)的多肽和含有癌症相关抗原wt1
294-312 io103(frgiqdvrrvsgvaptlvr-eqclsaftl-fmtywhllnaftvtvpkdl)的多肽按质量比10:1:1混合后即为制备纳米粒子4(np4)的抗原组分4。
[0302]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后加入含有0.1％蛋白酶抑制剂的超纯水重悬细胞后反复冻融5次并加入6m盐酸胍裂解癌细胞，然后使用6m盐酸胍水溶液溶解裂解物组分，将裂解物组分与含有癌症相关抗原wt1
235-243-io102(gasaygslcytwnqmnldtllkalleiasclekalqvfcytwnq)的多肽和含有癌症相关抗原wt1
294-312 io103(frgiqdvrrvsgvaptlvr-eqclsaftl-fmtywhllnaftvtvpkdl)的多肽按质量比10:1:1混合后即为制备纳米粒子5(np5)的抗原组分5。
[0303]
(2)负载全细胞组分的纳米粒子的制备
[0304]
本实施例中纳米粒子1(np1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时负载癌细胞全细胞抗原中水溶性组分的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性组分的纳米粒子分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料plga分子量为10kda-20kda，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分和佐剂，在内部负载细胞裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为180nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分，组分分别见步骤(1)中的制备方法。
[0305]
纳米粒子2(np2)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子2平均粒径为180nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分。
[0306]
纳米粒子3(np3)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子3平均粒径为180nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分。
[0307]
纳米粒子4(np4)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子4平均粒径为180nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分。
[0308]
纳米粒子5(np5)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子5平均粒径为180nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分。
[0309]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0310]
非小细胞肺癌患者a在在经过免疫治疗后痊愈。分别在非小细胞肺癌患者a进行免疫治疗前和免疫治疗后两周抽取非小细胞肺癌癌症患者a的外周血10ml。从10ml非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法先分离得到外周血单个核细胞(pbmc)。
[0311]
首先使用流式细胞术将pbmc中cd3
+
cd25
+
的t细胞除去，然后将50万个pbmc中剩余细胞与纳米粒子1(25μg)或者纳米粒子2(25μg)或者纳米粒子3(25μg)或者纳米粒子4(25μg)或者纳米粒子5(25μg)在10ml的aim v无血清培养基中共孵育16小时(37℃，5％co2)。然
后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性负载。然后采用cd3抗体，cd25抗体对细胞进行细胞外染色。分析cd3
+
t细胞中被激活后cd3
+
cd25
+
的t细胞即为癌细胞特异性t细胞。
[0312]
(4)实验结果
[0313]
如图12所示，纳米粒子1、纳米粒子2、纳米粒子3、纳米粒子4和纳米粒子5都能辅助检测到癌细胞特异性t细胞。而且，纳米粒子1和纳米粒子5效果相同，纳米粒子2和纳米粒子4效果相同，而且纳米粒子2和纳米粒子4效果好于纳米粒子1和纳米粒子5，这说明使用特定方法将蛋白质多肽组分分离纯化出来再负载到纳米粒子效果更好。而且，纳米粒子2好于纳米粒子3，说明使用特定的盐析试剂效果更好。综上所述，本发明所述的粒子系统可以更准确的检测癌症患者外周血中的癌细胞特异性t细胞。
[0314]
综上所述，本发明所述的粒子系统可以更准确的检测癌症患者外周血中的癌细胞特异性t细胞。
[0315]
实施例12纳米粒子用于检测肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞
[0316]
本实施例使用纳米粒子(nanoparticle,np)检测的癌症患者的癌细胞特异性t细胞。本实施例中，将多种人肺癌的癌细胞系中的水溶性组分和非水溶性组分负载到纳米粒子，然后，以该纳米粒子辅助检测非小细胞肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞。
[0317]
(1)多种肺癌细胞系各组分的收集
[0318]
分别培养人肺癌细胞系a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞。
[0319]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比20:20:2:2:2:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，将细胞沉淀使用超纯水重悬后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解癌细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m硫酸胍溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m硫酸胍水溶液中可溶。将裂解液中的水溶性组分在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀的蛋白质和多肽组分溶解于6m硫酸胍水溶液，将上清液中的mrna使用mrna提取试剂盒提取出来，然后将mrna组分与6m硫酸胍溶解的蛋白质多肽组分混合即为水溶性中组分中的抗原组分；然后在6m硫酸胍溶解的非水溶性组分中加入饱和硫酸铵溶液盐析蛋白质和多肽组分，将盐析出的沉淀使用6m硫酸胍二次溶解后即为非水溶性组分中抗原组分。将以上非水溶性组分中的抗原组分和水溶性组分中的抗原组分按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子1(np1)的抗原组分1。
[0320]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后使用超纯水重悬后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解癌细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m硫酸胍溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m硫酸胍水溶液中可溶。将裂解液中的水溶性组分在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀的蛋白质和多肽组分溶解于6m硫酸胍水溶
液，将上清液中的mrna使用mrna提取试剂盒提取出来，然后将mrna组分与6m硫酸胍溶解的蛋白质多肽组分混合即为水溶性中组分中的抗原组分；然后在6m硫酸胍溶解的非水溶性组分中加入饱和硫酸铵溶液盐析蛋白质和多肽组分，将盐析出的沉淀使用6m硫酸胍二次溶解后即为非水溶性组分中抗原组分。将以上非水溶性组分中的抗原组分和水溶性组分中的抗原组分按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子2(np2)的抗原组分2。
[0321]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后使用超纯水重悬后反复冻融5次，在冻融过程中辅以超声破碎以更彻底的裂解癌细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6m硫酸胍溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6m硫酸胍水溶液中可溶。将以上非水溶性组分和水溶性组分按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子3(np3)的抗原组分3。
[0322]
(2)负载全细胞组分的纳米粒子的制备
[0323]
本实施例中纳米粒子1(np1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料plga分子量为20kda-40kda，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分和佐剂，在内部负载细胞裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为380nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载800μg蛋白质或多肽组分。
[0324]
纳米粒子2(np2)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子2平均粒径为380nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载800μg蛋白质或多肽组分。
[0325]
纳米粒子3(np3)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子3平均粒径为380nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载800μg蛋白质或多肽组分。
[0326]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0327]
非小细胞肺癌患者a在在经过免疫治疗后痊愈。分别在非小细胞肺癌患者a进行免疫治疗前和免疫治疗后两周抽取非小细胞肺癌癌症患者a的外周血10ml。从10ml非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(pbmc)。
[0328]
将纳米粒子1(0.5mg)或者纳米粒子2(0.5mg)或者纳米粒子3(0.5mg)与pbmc(100万个)在1ml的aim v无血清培养基中共孵育12小时(37℃，5％co2)。然后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性负载。然后采用cd3抗体以及fasl抗体对细胞进行细胞外染色，尔后固定细胞和对细胞进行破膜，并采用fn-γ抗体对t细胞进行细胞内染色。尔后采用流式细胞仪检测样本t细胞。分析cd3
+
t细胞中被激活后可以分泌ifn-γ的t细胞以及可以表达fasl的t细胞在所有cd3
+
t细胞中所占的比例。
[0329]
(4)实验结果
[0330]
如图13所示，纳米粒子1和纳米粒子2都能辅助检测到癌细胞特异性t细胞。而且，纳米粒子1和纳米粒子2效果相同，而且，被激活后可以分泌ifn-ifn-γ的t细胞和可以表达fasl的t细胞重合，这说明本发明所述的粒子系统可以更准确的检测癌症患者外周血中的癌细胞特异性t细胞。
[0331]
实施例13纳米粒子用于检测肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞
[0332]
本实施例使用纳米粒子(nanoparticle,np)检测的癌症患者的癌细胞特异性t细胞。本实施例中，将多种人肺癌的癌细胞系中的水溶性组分和非水溶性组分负载到纳米粒子，然后，以该纳米粒子辅助检测非小细胞肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞。
[0333]
(1)多种肺癌细胞系各组分的收集
[0334]
分别培养人肺癌细胞系a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞。
[0335]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比2:2:2:2:2:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，将细胞沉淀使用4m异硫氰酸胍重悬并裂解，然后加入适量4m异硫氰酸胍溶解裂解物，然后加入饱和氯化钠水溶液盐析蛋白质和多肽组分，将盐析出的沉淀使用4m异硫氰酸胍二次溶解后，将所得抗原组分与肺癌新抗原多肽mage-a3(序列：flwgpralv)以及肺癌新抗原多肽muc1(序列：trpapgstappahgvtsapdtrpapgstap)按质量比5:1:1混合，即为制备纳米粒子1(np1)的抗原组分1。
[0336]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后使用4m异硫氰酸胍重悬并裂解，然后加入适量4m异硫氰酸胍溶解裂解物，然后加入饱和氯化钠水溶液盐析蛋白质和多肽组分，将盐析出的沉淀使用4m异硫氰酸胍二次溶解后，将所得抗原组分与肺癌新抗原多肽mage-a3(序列：flwgpralv)以及肺癌新抗原多肽muc1(序列：trpapgstappahgvtsapdtrpapgstap)按质量比5:1:1混合，即为制备纳米粒子2(np2)的抗原组分2。
[0337]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后使用4m异硫氰酸胍重悬并裂解，然后加入适量4m异硫氰酸胍溶解裂解物，即为制备纳米粒子3(np2)的抗原组分3。
[0338]
(2)负载全细胞组分的纳米粒子的制备
[0339]
本实施例中纳米粒子1(np1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料plga分子量为10kda-30kda，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分和佐剂，在内部负载细胞裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分。
[0340]
纳米粒子2(np2)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子2平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分。
[0341]
纳米粒子3(np3)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子3平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分。
[0342]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0343]
非小细胞肺癌患者a在在经过免疫治疗后痊愈。分别在非小细胞肺癌患者a进行免疫治疗前和免疫治疗后两周抽取非小细胞肺癌癌症患者a的外周血10ml。从10ml非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(pbmc)。
[0344]
将纳米粒子1(5mg)或者纳米粒子2(5mg)或者纳米粒子3(5mg)与pbmc(1000万个)在10ml的aim v无血清培养基中共孵育12小时(37℃，5％co2)。然后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性负载。然后采用cd3抗体和cd40l抗体对细胞进行染色，尔后采用流式细胞仪检测样本。分析cd3
+
cd40l
+
t细胞在所有cd3
+
t细胞中所占的比例，即为癌细胞特异性t细胞含量。
[0345]
(4)实验结果
[0346]
如图14所示，纳米粒子1、纳米粒子2和纳米粒子3都能很好的辅助检测到癌细胞特异性t细胞。而且，纳米粒子1和纳米粒子2效果相同，且纳米粒子1和纳米粒子2效果略好于纳米粒子3，这说明本发明所述的粒子系统可以更准确的检测癌症患者外周血中的癌细胞特异性t细胞。
[0347]
实施例14纳米粒子用于检测肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞
[0348]
本实施例使用纳米粒子(nanoparticle,np)检测的癌症患者的癌细胞特异性t细胞。本实施例中，将多种人肺癌的癌细胞系中的水溶性组分和非水溶性组分负载到纳米粒子，然后，以该纳米粒子辅助检测非小细胞肺癌患者外周免疫器官中的癌细胞特异性t细胞。
[0349]
(1)多种肺癌细胞系各组分的收集
[0350]
分别培养人肺癌细胞系a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞。
[0351]
将上述8种细胞分别收集后，将上述a549细胞、h1299细胞、pc9细胞、h1437细胞、h226细胞、hcc1588细胞、h2170细胞和h520细胞按照细胞数量比1:1:1:1:1:1:1:1:1混合，然后离心后去除培养基，将细胞沉淀使用1m盐酸氨基脲水溶液重悬后裂解，然后使用1m盐酸氨基脲和0.5m精氨酸水溶性溶解裂解物组分，即为制备纳米粒子1(np1)的抗原组分1。
[0352]
或者收集该非小细胞肺癌患者a本人手术切除的肿瘤组织样本。该非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效很好，经治疗后肿瘤完全消失。将该非小细胞肺癌患者肿瘤组织剪碎后通过细胞筛网过滤，然后使用1m盐酸氨基脲水溶液重悬后裂解，然后使用1m盐酸氨基脲和0.5m精氨酸水溶性溶解裂解物组分，即为制备纳米粒子2(np2)的抗原组分2。
[0353]
(2)负载全细胞组分的纳米粒子的制备
[0354]
本实施例中纳米粒子1(np1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料plga分子量为10kda-30kda，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分和佐剂，在内部负载细胞裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载50μg蛋白质或多肽组分。
[0355]
纳米粒子2(np2)的制备过程同纳米粒子1，该纳米粒子2平均粒径为280nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载50μg蛋白质或多肽组分。
[0356]
(3)表面负载抗原提呈细胞膜组分的纳米粒子的制备
[0357]
收集患者a外周血，并分离得到pbmc，使用流式细胞从pbmc中分选出cd11c
+
的树突状细胞(dc)和cd19
+
的b细胞，将100万个dc和500万个b细胞按数量比1:10混合，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(pbs)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在pbs水中后在4℃低功率(22.5w)超声1分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在
8000g离心15分钟后收集上清液，然后在16000g离心90分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在pbs中重悬后与步骤(3)制备的5mg纳米粒子(纳米粒子1、或者纳米粒子2)混合后共孵育10分钟，然后使用0.3um的滤膜反复共挤出，然后将挤在在13000g离心30分钟，并使用10ml含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。使用抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子1共作用得到的纳米粒子为纳米粒子3，平均粒径为300nm左右，每1mg plga纳米粒子约负载60μg蛋白质或多肽组分；使用抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子2共作用得到的纳米粒子为纳米粒子4。
[0358]
(3)癌细胞特异性t细胞的检测
[0359]
非小细胞肺癌患者a在在经过免疫治疗后痊愈。分别在非小细胞肺癌患者a进行免疫治疗前和免疫治疗后两周抽取非小细胞肺癌癌症患者a的外周血10ml。从10ml非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(pbmc)。
[0360]
将纳米粒子3(5mg)或者纳米粒子4(5mg)与pbmc(100万个)在5ml的aim v无血清培养基中共孵育12小时(37℃，5％co2)。然后收集细胞后在400g离心5分钟，将细胞在pbs中重悬后先采用fc block处理t细胞以避免非特异性负载。然后采用cd3抗体和cd107a抗体进行细胞染色，尔后采用流式细胞仪检测样本t细胞。分析cd3
+
cd107a
+
t细胞在所有cd3
+
t细胞中所占的比例，即为癌细胞特异性t细胞含量。
[0361]
(4)实验结果
[0362]
如图15所示，纳米粒子3、纳米粒子4都能辅助检测到癌细胞特异性t细胞，这说明本发明所述的粒子系统可以更准确的检测癌症患者外周血中的癌细胞特异性t细胞。
[0363]
本实施例中使用了共挤出的方法将抗原提呈细胞膜负载到纳米粒子表面，在实际应用中也可以使用超声、共孵育、离心、超滤、搅拌、均质化等任何其他方法将抗原提呈细胞膜负载到纳米粒子表面。本实施例中使用了自体的抗原提呈细胞，在实际应用中也可以使用异体的抗原提呈细胞，或者使用抗原提呈细胞系，或者使用其他途径制备的抗御提呈细胞。本实施例抗原提呈细胞膜使用了dc和b细胞两种，在实际应用中也可以只使用其中一种或者使用多种抗原提呈细胞膜。本实施例使用了抗原提呈细胞的膜组分，在实际应用中也可以使用抗原提呈细胞分泌的细胞外囊泡膜组分、细菌膜组分等其他膜组分。本实施例中使用的抗原提呈细胞没有使用抗原激活，在实际应用中也可以使用全细胞组分抗原或者负载全细胞组分抗原的递送粒子先激活抗原提呈细胞后再将抗原提呈细胞的细胞膜负载到递送粒子表面。
[0364]
本实施例中在肺癌等少数实体瘤中进行了实验，在实际应用中也可以用于其他类型的实体瘤患者体内癌细胞特异性t细胞的检测，而且，也可以用于血液瘤等非实体瘤癌症患者体内癌细胞特异性t细胞的检测。
[0365]
本公开实施例中检测的是外周血中的癌细胞特异性t细胞，在实际应用中也可以用于检测其他外周免疫器官(如淋巴结等)或者肿瘤组织中的癌细胞特异性t细胞。
[0366]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种癌细胞特异性t细胞的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括负载抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子，纳米粒子或微米粒子含有粒子制备材料和抗原组分，抗原组分选自如下(i)、(ii)、(iii)中的一种或者多种：(i)多种癌细胞系和/或异体肿瘤组织全细胞组分的纳米粒子和/或微米粒子，(ii)多种癌细胞系和/或异体肿瘤组织中全细胞蛋白质组分的纳米粒子和/或微米粒子，(iii)多种癌细胞系和/或异体肿瘤组织中全细胞蛋白质组分和mrna组分的纳米粒子和/或微米粒子；其中，所述多种癌细胞系为同种癌症不同亚型的癌细胞系；所述异体肿瘤组织为不同病人同种肿瘤相同亚型和/或不同亚型的肿瘤组织。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，抗原组分中在含有(i)、(ii)、(iii)中一种或多种的基础上还可以同时含有如下(vi)和(v)中的一种或多种：(vi)含有抗原多肽表位的人工合成多肽，抗原多肽表位为癌症特异性或者癌症相关抗原多肽表位；(v)可以表达包含抗原多肽表位的核酸，抗原多肽表位为癌症特异性或者癌症相关抗原多肽表位，核酸为mrna或dna。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述多种癌细胞系或异体肿瘤组织通过如下一种方法处理后负载到纳米粒子和/或微米粒子：(1)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织混合后，灭活并破坏其结构，得到待负载组分；或，(2)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织灭活并破坏其结构后混合，得到待负载组分；或，(3)收集多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的水溶性组分，将水溶性组分混合后得到待负载组分；或，(4)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的非水溶性组分使用含有溶解剂的溶解液溶解，从而收集得到溶解的非水溶性组分，将非水溶性组分混合后得到待负载组分；或，(5)收集多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的水溶性组分后，将非水溶性组分使用含有溶解剂的溶解液溶解从而收集溶解的非水溶性组分，将水溶性组分和非水溶性组分混合后得到待负载组分；或，(6)使用含有溶解剂的溶解液直接处理多种癌细胞系或异体肿瘤组织，混合处理液得到待负载组分；或，(7)使用(1)-(6)中任一项与(vi)含有抗原多肽表位的人工合成多肽和/或(v)可以表达包含抗原多肽表位的核酸混合后得到待负载抗原组分。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述多种癌细胞系或异体肿瘤组织通过如下一种方法处理后负载到纳米粒子和/或微米粒子：(1)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织混合后，灭活并破坏其结构，分离提取其中的蛋白质和多肽组分，即得到待负载抗原组分；或，(2)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织灭活并破坏其结构并分离提取蛋白质和多肽组分后混合，得到待负载抗原组分；或，(3)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织混合后，灭活并破坏其结构，分离提取其中的蛋白质和多肽组分以及mrna组分，即得到待负载抗原组分；或，
(4)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织灭活并破坏其结构并分离提取蛋白质和多肽组分以及mrna组分后混合，得到待负载抗原组分；或，(5)收集多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的水溶性组分，然后分离提取其中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分，然后将水溶性组分中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分混合后得到待负载抗原组分；或，(6)将多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的非水溶性组分使用含有溶解剂的溶解液溶解后收集溶解的非水溶性组分，然后分离提取其中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分，将非水溶性组分中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分混合后得到待负载抗原组分；或，(7)收集多种癌细胞系或异体肿瘤组织中的水溶性组分，并使用含有溶解剂的溶解液溶解非水溶性组分后收集溶解的非水溶性组分，将水溶性组分和非水溶性组分分别分离提取其中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分，然后混合后得到待负载抗原组分；或，(8)使用含有溶解剂的溶解液直接处理多种癌细胞系或异体肿瘤组织，混合处理液后分离提取其中的蛋白质多肽组分和/或mrna组分，即可得到待负载抗原组分；或(9)使用(1)-(8)中任一项与(vi)含有抗原多肽表位的人工合成多肽和/或(v)可以表达包含抗原多肽表位的核酸混合后得到待负载抗原组分。5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，多种癌细胞系为至少两种，使用时质量比为1-20:1-20:1-20
……
；异体肿瘤组织为至少两种来源，使用时质量比为1-20:1-20:1-20
……
。6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，水溶性组分和非水溶性组分按照质量比1:5至5:1混合。7.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，溶解剂为含有结构式1的物质、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐(如sds)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、triton、吐温、氨基酸、多肽、糖苷、胆碱中的一种或多种；结构式1如下所示：其中，r1、r2、r3、r4和r5为任意化学结构。8.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，纳米粒子和/或微米粒子由有机合成高分子材料、天然高分子材料、无机材料中的至少一种制备得到。9.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，纳米粒子的粒径大小为1nm-1000nm；微米粒子的粒径大小为1μm-1000μm。10.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括抗原提呈细胞。11.根据权利要求1所述的检测试剂盒，所述纳米粒子/微米粒子激活癌细胞特异性t细胞的过程为将纳米粒子/微米粒子与抗原提呈细胞和t细胞同时共孵育以激活t细胞；或者所述纳米粒子/微米粒子激活癌细胞特异性t细胞的过程为先将纳米粒子/微米粒子与抗原提呈细胞共孵育激活抗原提呈细胞，再将激活的抗原提成细胞与t细胞共孵育以激活t细胞。所述纳米粒子/微米粒子与抗原提呈细胞共孵育时的浓度为0.001mg/ml到50mg/ml；所
述纳米粒子/微米粒子与抗原提呈细胞和t细胞同时共孵育时的浓度为0.001mg/ml到50mg/ml。12.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，纳米粒子和/微米粒子还负载有主动靶向抗原提呈细胞的靶头。13.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，纳米粒子和/或微米粒子还负载有免疫增强佐剂和/或促进溶酶体逃逸的物质。

技术总结
本发明涉及一种癌细胞特异性T细胞的检测试剂盒，将外周血、外周免疫器官或肿瘤浸润淋巴细胞中含有T细胞的免疫细胞与负载多种癌细胞系和/或异体肿瘤组织的粒子共孵育以激活可以识别和杀伤癌细胞的癌细胞特异性T细胞，检测分析被激活的癌细胞特异性T细胞数量和比例，进而评估患者体内可识别和杀灭癌细胞的特异性免疫能力的强弱。本发明克服了临床上在无法获得癌症患者自身肿瘤组织时如何制备可纳米粒子/微米粒子并有效筛选和检测外周血、外周免疫器官或肿瘤浸润淋巴细胞中广谱和多克隆的特异性T细胞的难题。检测出的癌细胞特异性T细胞含量多少，可以作为癌症免疫治疗或放疗等治疗方法疗效的生物标志物，具有易分离获取和特异性高的特点。取和特异性高的特点。取和特异性高的特点。


技术研发人员：刘密
受保护的技术使用者：苏州尔生生物医药有限公司
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/22