一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT1及其应用

一种调控番茄果实芳香物质合成的基因slect1及其应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种调控番茄果实芳香物质合成的基因slect1及其应用。


背景技术：

2.水果是人类膳食的重要组成部分，其品质主要包括色泽、风味、质地和营养等。果实品质是影响果品消费的重要指标，其中果实的芳香品质与消费者喜好密切相关。随着技术手段的进步，果实芳香品质研究快速开展，日渐成为果实品质生物学领域的研究热点。番茄基因组注释质量高，生长周期短，具有高效的遗传转化体系，是研究果实品质调控的理想材料。因此，开展番茄果实芳香物质的合成及其调控机制研究，对果实品质改良具有重要的理论价值和实践意义。
3.伴随着果实成熟，芳香物质逐渐累积释放。番茄果实中的芳香物质成分复杂，目前已有超过400种芳香物质被鉴定出来，主要包括醛类、酮类、醇类、萜类等。目前已成功鉴定了多个参与番茄果实芳香物质合成的基因，包括脂肪酸途径的sllip1、sllip8、slloxc、slhpl、sladh2和slaat1，类胡萝卜素途径slccd1，支链氨基酸途径的slbcat1、sltnh1等。目前，番茄果实芳香品质形成的机制研究主要集中在结构基因筛选、转录调控和dna甲基化层面，是否存在其他层面的协同调控有待进一步探索。
4.中心法则指出，遗传信息从dna转录为rna，再从rna翻译为具有不同功能的蛋白质，而表观遗传学也由这三部分构成。基因表达的每个环节均受到精细调控，通过表观修饰，相同的核苷酸序列可传递出可遗传的不同遗传信息。在dna甲基化和组蛋白修饰的研究基础上，可逆的rna甲基化修饰逐渐成为表观遗传学领域的研究热点。n
6-甲基腺嘌呤(n
6-methyladenosine,m6a)是真核生物中最常见的一种rna转录后修饰，可在时间和空间上被甲基转移酶和去甲基化酶动态调控。m6a结合蛋白通过对m6a修饰的选择性结合发挥生物学功能，如调控mrna剪切、翻译、出核、降解等过程。前期研究发现，m6a结合蛋白slect2具有调控番茄果实芳香物质合成的作用，但其他m6a结合蛋白在番茄果实芳香品质形成中的作用尚不明确。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供并验证一个调控番茄果实芳香物质合成的基因slect1。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一个有效调控番茄果实芳香物质合成的基因slect1。所述slect1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；slect1基因编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明提供了一种用于slect1基因突变的crispr/cas9基因编辑载体，所述载体为pylcrispr/cas9-slect1。所述载体可以表达靶向seq id no.1序列的sgrna。所述sgrna的序列为t1、t2、t3、t4，所述t1序列为seq id no.1的第207-226位核苷酸，所述t2序列为seq id no.1的第776-795位核苷酸，所述t3序列为seq id no.1的第942-961位核苷酸，所
述t4序列为seq id no.1的第1554-1573位核苷酸。所述pylcrispr/cas9-slect1基因编辑载体为利用bsa i限制性内切酶在pylcrispr/cas9-p
ubi-h的多克隆位点依次插入atu3d-t1-grna、atu3b-t2-grna、atu6-1-t3-grna和atu6-29-t4-grna得到的重组载体。
9.本发明提供了一种包含pylcrispr/cas9-slect1重组载体的微生物，所述微生物为农杆菌gv3101。
10.本发明的目的是提供所述基因slect1在调控番茄果实芳香物质合成中的应用，突变番茄中slect1基因可以显著提高番茄果实芳香物质含量。
11.本发明的另一个目的是提供所述基因slect1作为开展番茄基因工程育种的重要候选基因在番茄果实芳香品质改良中的应用。
12.本发明的有益效果：本发明提供了slect1基因在调控番茄果实芳香物质合成中的应用。敲除slect1基因能够显著提高番茄果实芳香物质含量，可为基因工程培育芳香品质优良的番茄种质提供候选基因资源。
附图说明
13.图1为slect1的4个靶位点(t1,t2,t3,t4)及其在slect1基因上的位置。
14.图2为slect1基因突变株系slect1#1和slect1#2的基因编辑方式。
15.图3为slect1基因突变株系slect1#1和slect1#2的蛋白质突变结果。
16.图4为野生型和slect1基因突变株系成熟果实电子鼻分析结果。
17.图5为野生型和slect1基因突变株系成熟果实芳香物质含量统计结果。
具体实施方式
18.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细说明，实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
19.下述实施例中的野生型番茄品种solanum lycopersicum cv ailsa craig，简称ac(marian bemer et al.,the tomato fruitfull homologs tdr4/ful1 and mbp7/ful2 regulate ethylene-independent aspects of fruit ripening[j].the plant cell,2012,24(11):4437-4451)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例：slect1基因突变导致番茄果实芳香物质含量升高
[0020]
本实施例通过crispr/cas9技术编辑番茄中slect1基因，该基因突变后，成熟番茄果实中芳香物质含量与野生型相比显著升高。slect1基因dna序列为序列表中seq id no.1，氨基酸序列为序列表中seq id no.2。具体步骤如下：
[0021]
(一)构建pylcrispr/cas9-slect1基因编辑载体
[0022]
选择靶序列：靶位点t1序列为seq id no.1的第207-226位核苷酸，靶位点t2序列为seq id no.1的第776-795位核苷酸，靶位点t3序列为seq id no.1的第942-961位核苷酸，靶位点t4序列为seq id no.1的第1554-1573位核苷酸。
[0023]
选择启动子：拟南芥内源的atu3d为靶位点t1的启动子，atu3b为靶位点t2的启动
子，atu6-1为靶位点t3的启动子，atu6-29为靶位点t4的启动子。
[0024]
制备含有靶位点的sgrna表达盒：经过2轮pcr，分别获得atu3d-t1-grna、atu3b-t2-grna、atu6-1-t3-grna和atu6-29-t4-grna共4个dna片段。atu3d-t1-grna为atu3d启动靶位点t1的sgrna表达盒，atu3b-t2-grna为atu3b启动靶位点t2的sgrna表达盒，atu6-1-t3-grna为atu6-1启动靶位点t3的sgrna表达盒，atu6-29-t4-grna为atu6-29启动靶位点t4的sgrna表达盒。制备方法如下：第一轮pcr反应为25μl体系：kod酶(toyobo)0.5μl、10
×
kod plus buffer(toyobo)2.5μl、dntp 2.5μl、mgso41.5μl、pylgrna-lacz-atu3d/atu3b/atu6-1/atu6-29质粒1μl、u-f引物(5μmol/l)1μl、gr-r引物(5μmol/l)1.0μl、gr-slect1-t1/t2/t3/t4引物2.5μl、atu-slect1-t1/t2/t3/t4引物2.5μl、ddh2o 10μl。pylgrna-lacz-atu3d质粒、pylgrna-atu3b质粒、pylgrna-atu6-1质粒、pylgrna-atu6-29质粒均记载在文献(ma et al.,a robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multipleb x genome editing in monocot and dicot plants[j].molecular plant,2015,8(8):1274-1284)中。第一轮pcr反应程序为：94℃60s；94℃10s，58℃15s，68℃20s，28个循环；68℃7min。第一轮pcr反应结束后，获得4个pcr产物，随后进行第二轮pcr反应。第二轮pcr反应为20μl体系：kod酶(toyobo)0.5μl、10
×
kod plus buffer(toyobo)2.0μl、dntp 2.0μl、mgso
4 1.2μl、第一轮pcr反应产物(稀释10倍)1.0μl、特异性引物对(pps-ggl、pgs-gg2或pps-gg2、pgs-gg3或pps-gg3、pgs-gg4或pps-gg4、pgs-ggr，1.5μmol/l)2.0μl、ddh2o 11.3μl。第二轮pcr反应程序为：94℃60s；94℃10s，58℃15s，68℃20s，25个循环；68℃7min。第二轮pcr反应结束后，将4个pcr产物等量混合后进行纯化。两轮pcr反应所用的引物序列如表1所示。
[0025]
表1、载体构建引物序列
[0026]
制备pylcrispr/cas9-slect1重组载体：采用golden gate cloning方法(ma et al.,robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[j].molecular plant,2015,8(8):1274-1284)完成sgrna表达盒与pylcrispr/cas9-p
ubi-h载体的酶切连接反应。反应体系为：10
×
cutsmart buffer(neb)1.5μl、pylcrispr/cas9-p
ubi-h载体2.0μl、经过纯化的atu3d-t1-grna、atu3b-t2-grna、atu6-1-t3-grna和atu6-29-t4-grna四个dna片段的混合物1.0μl、bsai-hf(neb)0.5μl、t4 dna ligase(promaga)1.0μl、10
×
t4 dna ligase buffer(promaga)1.5μl、ddh2o 7.5μl。反应条件为：37℃10min，10℃5min，20℃5min，3个循环；37℃3min，10℃5min，20℃5min，10个循环；37℃5min。将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布到含有相应抗性(kan
+
)的lb培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落，提取质粒并测序，将测序正确的重组质粒转化农杆菌gv3101感受态细胞。
[0027]
(二)番茄的遗传转化
[0028]
利用农杆菌介导的叶盘转化法开展番茄的遗传转化。所有操作均在无菌超净台中进行，具体操作步骤如下：
[0029]
播种：取适量ac番茄种子于无菌培养皿，使用75％乙醇消毒30s，而后使用4％次氯
酸钠溶液消毒8min，无菌水润洗数次后将种子均匀摆放至1/2ms培养基。
[0030]
种子萌发：将种子置于25℃黑暗条件下培养，直至出芽(约3天)。而后置于光下培养，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗。3-5天后，幼苗子叶完全展开，用于开展下一步操作。
[0031]
预培养：用手术刀将番茄子叶切成5
×
5mm的方块，叶背朝上均匀摆放至铺有一层滤纸的kcms培养基，暗培养过夜。
[0032]
制备侵染液：挑取已转入pylcrispr/cas9-slect1基因编辑载体的农杆菌单菌落，接种至3ml含有相应抗性(kan
+
、get
+
)的lb培养基，28℃震荡过夜培养。次日吸取300-500μl菌液于20ml含有相应抗性(kan
+
、get
+
)的lb培养基中，28℃震荡培养至od
600
＝0.6-0.8。5000rpm离心10min收集菌体，用无菌水将菌液稀释至od
600
＝0.1-0.2。
[0033]
侵染：刮取暗培养后的番茄子叶于无菌培养皿，倒入侵染液，侵染5min，期间轻轻晃动培养皿。侵染完成后倒掉侵染液，吸净子叶上残留的侵染液。将子叶重新摆放至kcms培养基，暗培养2d。
[0034]
选择培养与再生：暗培养2d后，将外植体小心转入2z培养基，25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养2周后转入0.2z培养基继代培养，而后每2周进行一次继代培养。选择培养的过程中及时清理污染的材料，直至外植体长出愈伤组织并再生芽。
[0035]
生根培养：待再生芽伸长至1cm左右，将再生芽切下并转入r生根培养基培养，直至生根。
[0036]
土培：将生根良好的小苗从r培养基中移出，洗净培养基后移栽至花盆中土培，注意保湿。
[0037]
培养基配方如下：1/2ms：ms盐2.22g/l，蔗糖10g/l，肌醇100mg/l，琼脂8g/l，调节ph＝5.8
±
0.03；kcms：ms盐4.44g/l，蔗糖30g/l，肌醇100mg/l，琼脂8g/l，调节ph＝5.8
±
0.03，灭菌后加入as至浓度为0.1mg/l；2z：ms盐4.44g/l，蔗糖20g/l，肌醇100mg/l，琼脂7.4g/l，调节ph＝6.0
±
0.03，灭菌后加入潮霉素至浓度为6mg/l、特美汀至浓度为300mg/l、玉米素至浓度为2mg/l；0.2z：ms盐4.44g/l，蔗糖20g/l，肌醇100mg/l，琼脂7.4g/l，调节ph＝6.0
±
0.03，灭菌后加入潮霉素至浓度为6mg/l、特美汀至浓度为300mg/l、玉米素至浓度为0.2mg/l；r：ms盐4.44g/l，蔗糖30g/l，琼脂8g/l，调节ph＝6.0
±
0.03，灭菌后加入潮霉素至浓度为6mg/l、特美汀至浓度为300mg/l、nv至浓度为2mg/l。
[0038]
(三)slect1基因突变体的筛选
[0039]
提取步骤(二)所得slect1基因编辑植株的基因组dna，在每个靶位点上游和下游约200bp附近设计pcr引物，扩增靶位点附近的dna序列并测序，以检测slect1基因编辑植株的编辑方式。靶点pcr引物及测序引物见表2。
[0040]
表2、靶点检测引物序列
[0041]
测序成功后，利用crispr靶点编辑方式分析网站dsdecode(http://dsdecode.scgene.com/)并结合人工读峰图的方式与标准序列进行比对，对各个靶位点的编辑方式进行分析。
[0042]
通过上述方式筛选到的slect1基因敲除突变体slect1#1和slect1#2的基因编辑方式如图2所示。在slect1#1突变体中，t3位点发生5个核苷酸的缺失，即seq id no.1的第954-958位核苷酸缺失。在slect1#2突变体中，t4位点附近发生3个核苷酸和65个核苷酸的缺失，即seq id no.1的第1666-1668位、第1534-1598位核苷酸缺失。slect1#1获得剩余48个氨基酸的截短蛋白，slect1#2分别获得剩余705个和144个氨基酸的截短蛋白，如图3所示。
[0043]
(四)基于电子鼻的番茄果实感官评价分析
[0044]
选取野生型、slect1#1和slect1#2突变体成熟果实(破色后7天)，每组样品2个生物学重复，每个生物学重复为随机的6个果实。果实用液氮速冻并研磨成粉末，称取2g粉末于10ml离心管中，加入5ml饱和nacl溶液，充分涡旋混匀。吸取2ml果汁混合液于10ml进样瓶中(每个生物学重复设置2个技术重复)，置于冰上备用。进样瓶依次置于40℃加热30min，抽取2ml顶空气体，使用电子鼻(αfox4000，alpha-mos，法国)检测样品间的芳香差异，载气为空气(杭州今工特种气体有限公司)。采集时间：120s，采集周期：1s，延滞时间：240s，(载气)流速：150ml/min，注射体积：500μl，注射速度：500μl/min。采用电子鼻系统自带的主成分分析(principal component analysis，pca)方法进行聚类分析。
[0045]
如图4的pca分析结果可以看出：在pc1维度，slect1#1和slect1#2突变体聚类，能够与野生型(wt)明显区分，证明slect1突变体和野生型果实在嗅觉上存在显著差异。
[0046]
(五)番茄果实挥发性芳香物质含量分析
[0047]
选取野生型、slect1#1和slect1#2突变体成熟果实(破色后7天)，每组样品各3个生物学重复，每个生物学重复为随机的6个果实。果实用液氮速冻并研磨成粉末，称取5g粉末于20ml进样瓶，加入5ml饱和nacl溶液和20μl内标2-辛醇(0.8mg/ml)，充分涡旋混匀。利用顶空固相微萃取(hs-spme)结合气相色谱质谱联用(gc-ms)技术测定果实挥发性芳香物质的成分与含量。样品经40℃恒温平衡30min后，使用50/30μmdvb/car/pdms萃取头进行
30min固相微萃取。萃取头在gc-ms(agilent 7890-5975)进样口解吸附15min后，通过db-wax毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，j&w scientific)分离。升温程序为：从40℃以4℃/min速率升至230℃，再以100℃/min速率升至260℃，保持11.7min。以氦气(杭州今工特种气体有限公司)为载气，ms离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70ev。通过与nist-8(nist/epa/nih，美国)标准谱库比对，对芳香物质定性；通过参考内标2-辛醇的峰面积，对物质含量定量计算。
[0048]
野生型和slect1突变体成熟果实芳香物质含量见图5，slect1#1和slect1#2突变体成熟果实芳香物质含量分别升高至野生型的166.86％和149.63％。证明slect1基因参与调控番茄果实芳香物质的合成。

技术特征：
1.一种slect1基因在调控番茄果实芳香物质合成中的应用，其特征在于，包括突变番茄中slect1基因显著提高番茄果实中芳香物质含量，所述slect1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述slect1编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.一种用于slect1基因突变的crispr/cas9基因编辑载体，其特征在于，所述载体为pylcrispr/cas9-slect1，所述载体表达靶向seq id no.1序列的sgrna，所述sgrna的序列为t1、t2、t3、t4，所述t1序列为seq id no.1的第207-226位核苷酸，所述t2序列为seq id no.1的第776-795位核苷酸，所述t3序列为seq id no.1的第942-961位核苷酸，所述t4序列为seq id no.1的第1554-1573位核苷酸。3.权利要求1所述基因slect1作为开展番茄基因工程育种的重要候选基因在改良番茄果实芳香品质中的应用。

技术总结
本发明提供了一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT1及其应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术编辑番茄中的SlECT1基因，获得了SlECT1基因突变株系slect1#1和slect1#2，二者成熟果实中芳香物质含量分别升高至野生型的166.86％和149.63％，证明SlECT1基因具有调控番茄果实芳香物质合成的功能。本发明所述SlECT1基因可为基因工程育种改善番茄果实风味提供候选基因资源。味提供候选基因资源。


技术研发人员：张波 卞寒晓 高颖
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/7/22