一种流感病毒疫苗及其应用的制作方法

1.本发明涉及医药领域，具体涉及流感病毒疫苗及其应用。


背景技术：

2.流行性感冒,简称流感,是流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，呈季节性流行，通常每年秋天进入流行季。冬春季达到流行高峰。
3.流感病毒属于正黏病毒科，是一种单股、负链rna基因组病毒，根据病毒核蛋白和基质蛋白的不同，分甲(a)、乙(b)、丙(c)、丁(d)四种类型,根据其包膜中血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)不同，又可分为不同的亚型(h亚型和n亚型)。甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，是引起季节性或者大流行流感的主要病毒。目前感染人的主要是甲型(又称a型)中的h1n1、h3n2亚型及乙型(又称b型)中的victoria和yamagata系。流感病毒变异的频率快，每年都会有新的流行毒株发生，其变异主要通过两种方式进行：抗原漂移和抗原转变。抗原漂移是由少量的点突变所导致的微小的变化，在甲型和乙型流感中都会发生,它可以使病毒避开免疫系统的识别，造成感染过的人再次发生感染、造成流感反复暴发。抗原转变是由不同ha抗原的基因重配所引起可以使病毒产生新的亚型，而且可以跨越物种直接感染人类，比如禽流感，主要发生在甲型流感中。
4.流感病毒囊膜表面有三种蛋白：ha(血凝素蛋白)、na(唾液酸苷酶)和m2(通道蛋白)。ha是含量最多的流感表面囊膜蛋白，是病毒黏附受体细胞的主要成分，也是诱导中和抗体产生的主要抗原。目前发现的ha亚型共18种，每个亚种含许多不同毒株，保持ha与近期流行毒株相似是疫苗产生高效中和抗体的基础。因此，近些年来，世卫组织每年预测、公布和发放主要流行毒株，供给各国疾控部门，方便疫苗生产企业应用。m2是流感病毒囊膜表面除ha和na外的第三种蛋白，分子量小，每个m2蛋白的膜外区仅23个氨基酸，其选择压力小，可变范围小，变异程度较低。在2019年以来ncbi收录的所有m2蛋白中，按胞外区序列区分一共仅有10多种，与ha的数千种相比，具有很高的保守性，且实验证明此段序列具有体液免疫和细胞免疫活性，是开发具有广泛预防效果的通用疫苗的抗原选择之一。
5.流感病毒主要通过飞沫传播,口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或间接接触被病毒污染物品也可以感染。人群对流感病毒普遍易感，流感病毒直接侵袭人体的呼吸系统，可引起病毒性肺炎、继发细菌性肺炎、急性呼吸窘迫综合征、休克、弥漫性血管内凝血等多种威胁生命的严重并发症。重症流感主要发生在老年人、年幼儿童、肥胖者、孕产妇和有慢性基础疾病者等高危人群，也可发生在一般人群。
6.接种流感疫苗可有效预防相应亚型/系的流感病毒感染，降低发生严重并发症的风险；通常接种流感疫苗2-4周后，可产生具有保护水平的抗体，6-8月后抗体滴度开始衰减。
7.根据疫苗种类，流感病毒疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗两大类，根据价数流感病毒疫苗有三价(h1n1、h3n2、b/victoria)和四价(h1n1、h3n2、b/victoria、b/yamagata)。
8.目前，我国批签发的流感疫苗品种主要为四价灭活/裂解疫苗、三价灭活/裂解疫
苗和三价减毒活疫苗三个产品类别。这类疫苗进行病毒灭活后提取ha为主的抗原作为疫苗，存在产量有限，受益人群少，免疫原性低等问题，影响了流感疫苗的接受度和推广，因此开发高效广谱的重组疫苗是流感疫苗的重要研发方向。


技术实现要素：

9.本发明人通过研究发现，ha-fc作为抗原具有有效的中和抗体诱导能力，多拷贝串联m2胞外区(m2e)作为抗原可以诱导具有广谱作用性质的体液免疫和细胞免疫。将ha抗原、m2抗原及具有增效作用的fc标签共同串联表达，则可以同时利用三种元件的免疫作用。其中，m2上有t/b细胞表位的情况下，能够有效诱导中和抗体产生。但其作为短肽表位本身的抗体诱导能力通常较低，中和抗体效价较低，在实践中短肽作为抗原需要连接载体才能有效诱导抗体生产。m2胞外区(m2e)表位与ha连接后，ha既可以发挥ha作为抗原的作用，又可以发挥作为m2载体的作用，提高m2作为抗原的诱导能力。m2的序列保守性是有限的，串联多个不同m2可以涵盖更多种毒株，提高对流感毒株变异的不敏感度。
10.因此，本发明提供一种流感病毒疫苗融合蛋白，其由流感ha抗原基因编码的ha抗原片段与m2胞外区片段串联后与人免疫球蛋白基因编码的fc片段串联而成的融合蛋白。
11.优选地，ha抗原片段的c端连接m2胞外区片段，m2胞外区片段的c端再连接fc片段。
12.更具体地，所述流感ha抗原基因选自甲型流感h1n1、h3n2亚型、及乙型victoria和yamagata系的使人致病流感毒株。
13.更优选地，ha抗原基因来源于流感毒株的ha基因，例如毒株a/beijing/24/2019(h1n1)对应genbank编号:mn853429.1；优选地，选用其第1-2012碱基序列的点突变型r344t编码蛋白，例如其氨基酸序列如seq id no：1所示。
14.进一步优选地，m2胞外区片段是指其m2的n端2-23氨基酸序列，优选地串联2-6个m2胞外区片段，例如2、3、4、5或6个；优选地，所述2-6个m2胞外区片段来源于不同或相同的m2，例如分别来源于qid40717，qfr17397，qfr17408，qfr17284，qdw80887，所述m2胞外区片段的一个例子中其氨基酸序列如seq id no：2所示。
15.在一个具体实施方式中，ha抗原片段、m2胞外区片段、fc片段之间可以有，也可以没有连接片段。
16.另外优选地，fc片段来源于人igg1，所述fc片段的一个例子中其氨基酸序列如seq id no：3所示。
17.本发明提供编码所述的流感病毒疫苗融合蛋白的核酸、表达载体和重组宿主细胞，优选地所述宿主细胞为hek293ft细胞、mdck细胞、vero细胞、cho-k1q细胞、hek293ft细胞或其它人体细胞。
18.本发明还提供所述的流感病毒疫苗融合蛋白为活性成分的流感疫苗，任选地还包括佐剂或药学上可接受的辅料。
19.本发明进一步提供所述的流感病毒疫苗融合蛋白或所述的流感疫苗在制备预防或治疗流感的药物中的应用。
20.本发明的有益效果：ha是结合宿主受体的膜蛋白，其诱发的部分抗体结合ha后可以防止病毒与受体结合，起到防止病毒入侵的作用，是有效的诱导中和抗体的抗原。m2的序列保守性赋予了它诱导的免疫反应具有广谱的结合病毒的作用，但m2的序列短，且中和抗
体诱导能力弱，单独的m2抗原起到的作用效力有限。本发明的蛋白抗原结合了有效的关键的中和抗体免疫原ha和广谱型免疫原m2e，可以兼顾预防主要流行毒株和次要流行毒株的感染。本发明的融合蛋白中的串联m2可以来自不同毒株，可兼顾的毒株范围更广。本发明的融合蛋白相比单独ha抗原、单独的m2抗原具有更高的抗原性。进一步，本发明中的fc片段能提升蛋白纯化效率，和延长抗原体内半衰期。
附图说明
21.图1、蛋白ha-m2e-fc、ha-fc电泳检测。其中，m:蛋白分子量maker，1、2：ha-m2ex5-fc，3、4：ha-fc。
22.图2、三免六周小鼠血清结合抗体elisa检测。
具体实施方式
23.本技术的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。本技术实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本技术实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
24.实施例1：人流感ha-m2e-fc、ha-fc基因载体构建
25.1、来源于流感毒株a/beijing/24/2019(h1n1)的ha基因，编号genbank:mn853429.1，选用第1-2012碱基序列的点突变型r344t(该位点为ha0断裂为ha1和ha2的位点，突变会使蛋白保持ha0状态，即保持融合前构象，可使产生的抗体更多得针对融合前构象，或者说病毒未进入细胞以前的构象。融合前构象利于诱导中和抗体，其氨基酸序列如seq id no：1所示)。n端连接序列：atgtacaggatgcagctgctctcttgcatcgccctgagtctcgcccttgtgaccaacagctacggcagcaagaaaaggagacagagaaggcgg做为信号肽，c端以串联方式依次连接或不连接5个m2基因的n端2-23氨基酸序列(本实施例采用m2胞外区片段的氨基酸序列如seq id no：2所示)，m2x5的c末端连接人igg1的fc片段(本实施例采用的fc片段的氨基酸序列如seq id no：3所示)。由基因公司合成构建融合蛋白于表达载体pks001的hindiii-xbai位点，经测序鉴定无误。
26.2、采用pcr克隆的方式，利用引物对h5spf/h5spr，进行pcr克隆，具体如下：
27.h5spf：gtttgtggtggccgccgctaccggcgtgcagtccgacacattatgtataggttatcatg
28.h5spr：ggcggccaccacaaacaggaacctccaggtccagtccatggtggcggcaagctt。
29.以上述载体为模板，采用pcr反应体系：10μm h5spf 0.5ul、10μm h5spr 0.5ul、5x phusion buffer 4ul、dntp 1ul、phusion polymerase 1ul和超纯水12.7ul。
30.采用pcr程序如下：
31.步骤程序设置194℃，4min294℃，45sec,45℃,45sec,72℃,5min30sec,3cycles394℃，45sec,65℃,45sec,72℃,5min30sec,26cycles472℃，10min
32.pcr结束后，反应产物中加入dpn i酶1ul于37℃消化4hrs，取10ul产物，采用常规方法转化top10大肠杆菌感受态细胞，筛选氨苄抗性菌株克隆进行测序鉴定，获得n端序列为h5抗体信号肽序列(atgga ctgga cctgg aggtt cctgt ttgtg gtggc cgccg ctacc ggcgt gcagt cc)的表达载体克隆菌株，并提取质粒。
33.实施例2：cho表达系统制备ha-m2x5-fc、ha-fc融合蛋白
34.细胞培养：cho-k1q细胞用添加4mm gln的cd02培养基(购自中山康天晟合)于37℃，5％co2，转速110rpm摇床悬浮培养。细胞培养活力达98％以上，密度2.0
×
106以上时用于转染。
35.质粒大提：用含氨苄青霉素的lb培养基于摇瓶培养含有实施例1所述目的表达载体的大肠杆菌工程菌，用无内毒素质粒大提试剂盒(购自天根生化)提取质粒，乙醇沉淀浓缩质粒。
36.电击转化法转化质粒于cho细胞，培养5天，用蛋白a亲和柱纯化培养上清，电泳检测获得高纯度目的蛋白ha-m2ex5-fc、ha-fc，结果见图1。
37.实施例3：免疫小鼠，制备血清，结合抗体检测
38.将实施例2制备获得的目的蛋白ha-m2ex5-fc与自制佐剂混合后(自制佐剂参见cn202110995286.1)，免疫balb/c小鼠，雌性，6-8周，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。免疫分组如下表1：
39.表1：小鼠免疫剂量分组试验
[0040][0041]
免疫与采血程序：于0、3、6周免疫，本实验采用肌内注射，0.1ml/针。3、6、9、12、15周采血，制备血清。
[0042]
抗血清结合效价检测：将实施例2制备的融合蛋白ha-m2ex5-fc、ha-fc配制溶液62.5ng/ml，一段m2e合成短肽(qdw80887的n端2-23个氨基酸)配制溶液1ug/ml,分别加入酶标板100ul/孔,4℃过夜包被。pbst洗板后加入1％bsa,pbst溶液封闭，37℃封闭2h，弃封闭液，加入100ul用封闭液梯度稀释的抗血清，每个样品设两个重复，37℃孵育1.5h，pbst洗板后加入hrp标记羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，pbst洗板三次，加入显色液，避光反应15min.加入50ul终止液终止反应。酶标仪读取450nm吸光度，以大于阴性样品0.1为稀释终点。用exel扣除空白对照平均值后计算，得出免疫结合效价。结果见图2。
[0043]
由结果可以看出，2ug抗原ha-m2e-fc融合蛋白已经接近免疫上限，三次免疫可诱导出达到106以上量级的血清抗体，说明该融合蛋白具有很高的免疫诱导能力。用ha-fc和一个m2e合成多肽都可检测到特异结合抗体，显示抗原各组成部分都可以诱导特异抗体的能力。ha-fc表现出很高的免疫抗体结合能力，但低于ha-m2e-fc,显示出因缺失m2e部分抗原而缺失的部分诱导抗体的能力。单独包被的m2ex1具有结合抗体的能力，5倍效应可一定
程度上填补ha-m2ex5-fc、ha-fc之间的结果差异。

技术特征：
1.一种流感病毒疫苗融合蛋白，其由流感ha抗原基因编码的ha抗原片段与m2胞外区片段串联后与人免疫球蛋白基因编码的fc片段串联而成的融合蛋白。2.如权利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，ha抗原片段的c端连接m2胞外区片段，m2胞外区片段的c端再连接fc片段。3.如权利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，所述流感ha抗原基因选自甲型流感h1n1、h3n2亚型、及乙型victoria和yamagata系的使人致病流感毒株。4.如权利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，ha抗原基因来源于流感毒株的ha基因，例如毒株a/beijing/24/2019(h1n1)对应genbank编号: mn853429.1；优选地，选用其第1-2012碱基序列的点突变型r344t编码蛋白，例如其氨基酸序列如seq id no：1所示。5.如权利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，m2胞外区片段是指其m2的n端2-23氨基酸序列，优选地串联2-6个m2胞外区片段，例如2、3、4、5或6个；优选地，所述2-6个m2胞外区片段来源于不同或相同的m2，例如分别来源于qid40717，qfr17397，qfr17408，qfr17284，qdw80887，所述m2胞外区片段的一个例子中其氨基酸序列如seq id no：2所示。6.如权利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，ha抗原片段、m2胞外区片段、fc片段之间可以有，也可以没有连接片段。7.如权利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，fc片段来源于人igg1，优选地其ncbi数据为编码4cdh a。8.编码如权利要求1至7任一项所述的流感病毒疫苗融合蛋白的核酸、表达载体和重组宿主细胞，优选地所述宿主细胞为hek293ft细胞、mdck细胞、vero细胞、cho-k1q细胞或人体细胞。9.如权利要求1至7任一项所述的流感病毒疫苗融合蛋白为活性成分的流感疫苗，任选地还包括佐剂或药学上可接受的辅料。10.如权利要求1至7任一项所述的流感病毒疫苗融合蛋白或如权利要求9所述的流感疫苗在制备预防或治疗流感的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及医药领域，具体公开一种流感病毒疫苗融合蛋白，其由流感HA抗原基因编码的HA抗原片段与M2胞外区片段（M2e；Membrane Protein (M2) Extracellular Region (M2e)串联后与人免疫球蛋白基因编码的Fc片段串联而成的融合蛋白。本发明的融合蛋白相比单独HA抗原、单独的M2胞外区片段抗原具有更高的抗原性，且其中Fc片段能提升蛋白纯化效率，和延长抗原体内半衰期。因此，本发明提供的流感疫苗具有较大优势，应用价值较大。应用价值较大。


技术研发人员：李杰 王丽英 王艳 伍树明 常文翔 舒展 银飞 张海江 刘永江
受保护的技术使用者：北京康乐卫士生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/7/22