一种抗菌肽CL及其应用的制作方法

一种抗菌肽cl及其应用
技术领域
1.本发明属于抗菌产品技术领域，具体涉及一种抗菌肽cl及其应用。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌可引起人和动物的多种感染和疾病，包括皮肤感染、肺炎、感染性关节炎和脓毒症等，是临床上人类化脓感染中最常见的病原菌。当前，金黄色葡萄球菌耐药菌株呈现逐渐增加的趋势，甚至出现众多多重耐药型金黄色葡萄球菌(如：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素金黄色葡萄球菌)。由于新型抗生素研发成本高并且研发速度远远不及耐药细菌出现的速度，因此，迫切需要开发一种新型、高效、低毒并且不易产生耐药性的抗菌药物。
3.抗菌肽作为机体不可或缺的免疫系统成分，在抑菌和抗炎方面均发挥着举足轻重的作用。抗菌肽的来源非常广泛，包括动物、植物和微生物，序列仅由几个到几十个氨基酸组成，由于抗菌肽往往表现出净正电荷，所以也被称为阳离子宿主防御肽。抗菌肽有特有的膜破坏机制，与细菌细胞膜上的负电荷通过静电作用而进一步快速的杀死细菌，也正因为它独特的作用机制而不易产生耐药性。因此，发掘对金黄色葡萄球菌具有高抗菌活性的抗菌肽成为有潜力代替传统抗生素进行治疗的有力方向。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗菌肽cl及其应用。本发明所述抗菌肽cl对皮肤常见感染的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌呈强抑菌性，在开发防治皮肤细菌感染方面具有潜在的应用价值。
5.本发明提供了一种抗菌肽cl，所述抗菌肽cl的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明还提供了上述技术方案所述抗菌肽cl在制备具有抗菌和/或杀菌活性的产品中的应用。
7.优选的是，所述菌包括金黄色葡萄球菌。
8.优选的是，所述金黄色葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌的敏感菌株和/或耐药菌株。
9.本发明还提供了一种具有抗菌和/或杀菌活性的产品，所述产品包括上述技术方案所述的抗菌肽cl。
10.优选的是，所述产品包括洗漱用品、化妆品、卫生用品、纺织品或饲料。
11.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述技术方案所述的抗菌肽cl和药学上可接受的辅料。
12.本发明提供了一种抗菌肽cl。本发明的抗菌肽cl对金黄色葡萄球菌具有特异、高效的抑菌活性，同时低溶血活性，低细胞毒性以及高稳定性的优势；抗菌肽cl对皮肤常见感染的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌呈强抑菌性，在开发防治皮肤、口腔等细菌感染方面具有潜在的应用价值。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为本发明提供的真菌抗菌肽cl抑制细菌生长图；
15.图2为本发明提供的真菌抗菌肽cl引起细菌絮凝图；
16.图3为本发明提供的真菌抗菌肽cl引起细菌细胞内含物泄漏图；
17.图4为本发明提供的真菌抗菌肽cl引起细菌细胞atp泄漏图；
18.图5为本发明提供的真菌抗菌肽cl对绵羊红细胞的溶血活性测试值结果图；
19.图6为本发明提供的真菌抗菌肽cl对人肺癌细胞a549的细胞毒性值结果图；
20.图7为本发明提供的真菌抗菌肽cl对动物模型蜡螟侵染细菌后的生存影响值结果图。
具体实施方式
21.本发明提供了一种抗菌肽cl，所述抗菌肽cl的氨基酸序列如seq id no.1所示：lwwrwwrrrw。本发明所述抗菌肽cl为源于真菌的天然抗菌肽。具体的，本发明所述抗菌肽cl筛选自真菌卢式棒孢菌(clavispora lusitaniae)。真菌与细菌间存在复杂的协同和拮抗作用，本发明基于共存于同一生态环境的微生物间的共生关系，通过综合计算和实验方法快速表征，从真菌天然基因组内筛选出了高效、特异的新型抗菌肽cl。本发明所述抗菌肽cl含有10个氨基酸，其分子量为1686.99da，等电点为12.48，不稳定性指数为261.80，平均亲水性-1.870，疏水性44.45，跨膜能力为-6.9kcal/mol。本发明所述抗菌肽cl针对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌活性，且具有低溶血性、低细胞毒性、高稳定性且高效的体内抑菌活性的优势，具有应用安全性，对临床金黄色葡萄球菌感染防御等应用具有重要意义。具体的，本发明所述抗菌肽cl对人体皮肤常见感染菌株金黄色葡萄球菌，包括敏感菌株newman，临床耐甲氧西林mrsa菌株n315以及耐万古霉素vrsa菌株mu50均呈现强抑菌活性，具有研制其成为应用人体抗金黄色葡萄球菌感染药物的深远应用前景。
22.本发明还提供了上述技术方案所述抗菌肽cl在制备具有抗菌和/或杀菌活性的产品中的应用。在本发明中，所述菌优选包括金黄色葡萄球菌。在本发明中，所述金黄色葡萄球菌优选包括金黄色葡萄球菌的敏感菌株和/或耐药菌株。在本发明中，所述敏感菌株优选包括金黄色葡萄球菌newman。在本发明中，所述耐药菌株优选包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)n315和/或耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vrsa)mu50。
23.本发明还提供了一种具有抗菌和/或杀菌活性的产品，所述产品包括上述技术方案所述的抗菌肽cl。在本发明中，所述产品优选包括洗漱用品、化妆品、卫生用品、纺织品或饲料。
24.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述技术方案所述的抗菌肽cl和药学上可接受的辅料。在本发明中，所述药物组合物优选包括对人体金黄色葡萄球菌感染所致疾病有预防和/或治疗作用的药物组合物，更优选包括对人体皮肤和口腔金黄色葡萄球菌感染所致疾病有预防和/或治疗作用的药物组合物。
25.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种抗菌肽cl及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
26.实施例1
27.真菌抗菌肽cl筛选
28.通过对人体肠道共生真菌卢式棒孢菌clavispora lusitaniae atcc 42720(assemblyasm383v1)进行全基因组序列分析，通过优化的抗菌肽序列预测程序deep-ampep30(https://cbbio.online/axpep/)筛选抗菌性能高于99.8％，且氨基酸个数在10以内的抗菌肽，通过dbaasp数据库(https://www.dbaasp.org/tools？page＝linear-amp-prediction)对金黄色葡萄球菌抑菌活性预测指数筛选抑菌性能呈阳性的抗菌肽；进一步通过cellpm对抗菌肽的跨膜能力进行预测，筛选具有强跨膜活性(transfer energy《-5.0)的短肽序列。通过此方法获取短肽序列leu-trp-trp-arg-trp-trp-arg-arg-arg-trp，跨膜能力为-6.9kcal/mol，化学合成纯度高于95％的该短肽。
29.本发明的真菌抗菌肽cl有10个氨基酸残基，其氨基酸序列具体为：leu-trp-trp-arg-trp-trp-arg-arg-arg-trp，氨基酸序列的单字母缩写序列为lwwrwwrrrw，真菌抗菌肽cl的分子量为1686.99da，等电点为12.48，不稳定性指数为261.80，平均亲水性-1.870，疏水性44.45。
30.实施例2
31.真菌抗菌肽cl抑菌活性测定
32.本实施例中所涉及到的菌株包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)newman，n315和mu50。革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa pao1)、大肠杆菌(escherichia coli jm109)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanniiatcc19606)、人伤寒沙门氏菌(salmonella typhi ty2)以及志贺氏菌(shigellaflexneri m90t)。
33.实验采用二倍梯度稀释的方法，测定最小抑菌浓度，即能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。
34.mic值测定：
35.准备好新划线培养的细菌菌落，划取些许菌落置于1.5ml无菌水中，吹打混匀，使用紫外分光光度计调节菌液浓度为od
600
＝0.4，用适当体积的mh培养基稀释菌液200倍，调整至od
600
＝0.002；分装75μl菌液/孔至96孔板中；
36.使用dmso溶解真菌抗菌肽cl，浓度为4mg/ml；使用mh培养基依次配置300μl二倍梯度稀释的抗菌肽，浓度梯度为0μg/ml至200μg/ml；移液枪吹打混匀，依次加入75μl/孔至含有待测菌液的96孔板中，每个浓度设置三个孔重复；
37.将96孔板置于37℃，180rpm恒温培养摇床中培养24h；
38.使用酶标仪检测菌液在600nm处的光吸收值，以检测不到细菌生长的孔和相邻孔的样品浓度的平均值作为最小抑菌浓度，即mic值。
39.经三次重复实验验证真菌抗菌肽cl对金黄色葡萄球菌的抑菌活性如表1所示，其mic值在15～20μg/ml。对革兰氏阴性菌的抑菌活性如表2所示，其mic值大于等于50μg/ml
40.表1真菌抗菌肽cl对革兰氏阳性菌的抑菌活性表
41.金黄色葡萄球菌mic(μg/ml)
newman15n31515mu5020
42.表2真菌抗菌肽cl对革兰氏阴性菌的抑菌活性表
[0043][0044]
实施例3
[0045]
真菌抗菌肽cl引起抑制细菌生长曲线测定
[0046]
本实施例中所涉及到的菌株为革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)newman，n315和mu50。
[0047]
将待测细菌置于lb培养基，37℃，220rpm条件下培养12h；1:100转接于2ml mh培养基中，37℃，220rpm继续培养2.5h，使用酶标仪测量od
600
为0.6；稀释菌液至od
600
＝0.1；
[0048]
取150μl mh培养基于96孔板中，每孔分别加入10μl待测菌液，依次加入终浓度为0μg/ml，3.75μg/ml，7.5μg/ml，15μg/ml和30μg/ml的抗菌肽cl，混匀，至于酶标仪中，37℃培养，每1h测量od
600
读数，测量至20h；绘制生长曲线。
[0049]
结果如图1所示，三次重复实验显示随着抗菌肽cl浓度的增加，细菌生长被抑制，当抗菌肽浓度增加至15μg/ml时，在16h生长时间内监测不到细菌的生长，表明该浓度下金黄色葡萄球菌生长被抑制。
[0050]
实施例4
[0051]
真菌抗菌肽cl引起细菌絮凝测定
[0052]
本实施例中所涉及到的菌株为革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)newman，n315和mu50。
[0053]
将待测细菌置于lb培养基，37℃，220rpm条件下培养12h；1:100转接于10ml mh培养基中，37℃，220rpm继续培养2.5h，使用酶标仪测量od
600
为0.6；
[0054]
分装500μl待测菌液于2ml ep管中，依次加入0μg/ml(阴性对照)，3.75μg/ml，7.5μg/ml，15μg/ml，30μg/ml，60μg/ml，120μg/ml，240μg/ml的抗菌肽cl，置于37℃，200rpm孵育5min，转置于37℃，50rpm继续孵育15min；将ep管置于25℃，静置1h；拍照记录细胞絮凝情况；
[0055]
吸取上清液100μl于96孔板中，使用酶标仪测量od
600
读数，细菌絮凝率为细菌絮凝率(％)＝(od
对照组
–
od
处理组
)/od
对照组
×
100％。
[0056]
结果如图2所示，三次重复实验显示随着抗菌肽cl浓度的增加，细菌絮凝率逐渐提高，当抗菌肽浓度增加至60μg/ml时，细菌絮凝率达到最高点，表明抗菌肽cl可以引起金黄色葡萄球菌凝聚而引起细菌死亡。
[0057]
实施例5
[0058]
真菌抗菌肽cl引起细菌细胞内含物泄漏测定
[0059]
本实施例中所涉及到的菌株为革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)newman。
[0060]
将待测细菌置于bhi培养基，37℃，220rpm条件下培养12h；1:100转接于2ml bhi培养基中，37℃，220rpm继续培养6h；
[0061]
用pbs调整菌液浓度至od
600
＝0.1；依次分装2.5ml菌液于5ml ep管中，添加终浓度分别为10μg/ml和20μg/ml的抗菌肽于ep管中，至于混匀仪架上室温孵育；使用含有终浓度为0.01％triton-x100的菌液作为阳性对照；
[0062]
分别于0min，15min，30min，45min，60min，75min，90min吸取200μl菌液于96孔板(白板)中，加入2μl 1mg/ml的碘化丙啶，混匀；室温孵育15min；
[0063]
将96孔板至于酶标仪，使用激发波长540nm和发射波长621nm检测碘化丙啶的染色情况；
[0064]
如图3所示，三次重复实验显示随着抗菌肽cl孵育时间的延长，碘化丙啶染色荧光程度加深，表明抗菌肽cl可引起细菌细胞内含物质的泄漏。
[0065]
实施例6
[0066]
真菌抗菌肽cl引起细菌细胞atp释放测定
[0067]
本实施例中所涉及到的菌株为革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)newman。
[0068]
将待测细菌置于bhi培养基，37℃，220rpm条件下培养12h；1:100转接于2ml bhi培养基中，37℃，220rpm继续培养6h；
[0069]
用pbs调整菌液浓度至od
600
＝0.1，依次分装0.5ml菌液于1.5ml ep管中，添加终浓度为20μg/ml的抗菌肽cl于ep管中，取出100μl作为零点；将ep置于37℃，220rpm摇床培养，分别于5min，10min，15min取出100μl样品至于冰上(避光)；
[0070]
将以上样品9000g，4℃，5min离心，取上清，置于冰上(避光)；
[0071]
取100μlatp检测液于96孔板(白板)，混匀，室温放置3～5min，加入20μl上述样品置于酶标仪检测冷光值；
[0072]
如图4所示，三次重复实验显示随着抗菌肽cl孵育时间的延长，上清液中含atp数量增加，表明抗菌肽cl可引起细菌细胞的泄漏。
[0073]
实施例7
[0074]
真菌抗菌肽cl的热稳定性和ph稳定性测定
[0075]
本实施例中所涉及到的菌株为革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)mu50。
[0076]
准备1
×
pbs，0.1m的乙酸钠水溶液，使用0.22μm滤膜除菌；分别以两种溶液为母液，用hcl或naoh调配ph依次为2，4，6，8，11，13的溶液；
[0077]
使用1
×
pbs配制500μl含有400μg/ml的抗菌肽cl，分别置于4℃冰箱静置1h；25℃静置1h；50℃，70℃和90℃水浴加热1h；
[0078]
分别使用1
×
pbs和0.1m的乙酸钠水溶液配制的ph为2，4，6，8，11，13的溶液配制500μl含有400μg/ml的抗菌肽cl，置于室温25℃下静置1h；
[0079]
将上述处理的抗菌肽cl用实施例2所述方法测定mic值。
[0080]
如表3和表4所示，三次重复实验显示抗菌肽cl呈热稳定性；在中性和碱性ph处理
下抗菌肽cl的稳定性保持不变(mic值保持为20μg/ml)，酸性ph处理下，抗菌肽cl的稳定性有一定的影响(mic值为60μg/ml)。
[0081]
表3真菌抗菌肽cl的热稳定性结果表
[0082][0083]
表4真菌抗菌肽cl的中碱ph稳定结果表
[0084][0085][0086]
实施例8
[0087]
真菌抗菌肽cl溶血率测定
[0088]
1.取适量绵羊血，使用1
×
pbs缓冲液(ph 7.4)稀释3倍，分装190μl/孔至96孔板中；
[0089]
2.用1
×
pbs缓冲液(ph 7.4)配备不同浓度梯度的抗菌肽：分别为0μg/ml(阴性对照)，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml，800μg/ml浓度梯度，以0.2％tritonx-100作为阳性对照；
[0090]
3.加入10μl抗菌肽和阳性对照至以上含有绵羊血的96孔板中；37℃培养60min；
[0091]
4.取出96孔板，离心(3000
×
g，5min，4℃)，转移上清液100μl至新的96孔板，使用酶标仪于波长567nm处测定吸光度；
[0092]
5.抗菌肽溶血率按(检测孔od
567-阴性孔od
567
)/(阳性孔od
567-阴性孔od
567
)
×
100％进行计算。
[0093]
如图5所示，三次重复实验显示抗菌肽溶液与绵羊红细胞悬浮液经孵育，od
567
检测结果表明，与对照组相比，抗菌肽cl在浓度达到800μg/ml时未造成红细胞发生明显溶血现象，溶血率低于10％。
[0094]
实施例9
[0095]
真菌抗菌肽cl的细胞毒性测定
[0096]
实验采用cell counting kit-8(cck-8)方法测定细胞毒性；
[0097]
使用dmem培养基培养人肺癌细胞a549细胞，计数，调整细胞浓度为7
×
10^4细胞/ml；
[0098]
依次加入100μlpbs至96孔板最外周，防止细胞液蒸发而引起实验误差；接种100μl/孔细胞悬液至剩余的96孔板中，剩余一列加入dmem完全培养基为空白组，将96孔板置于37℃、5％co2条件下过夜培养(一般是12h)。
[0099]
取出96孔板，去除细胞上清液，分别加入100μl含有dmso对照组以及梯度浓度抗菌肽(依次为10μg/ml，30μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml)的dmem完全培养基，置于37℃、5％co2培养条件下孵育24h。
[0100]
去除上层细胞液，每孔加入100μl新鲜的dmem完全培养基，依次加入10％cck-8溶液，注意不要产生气泡，否则会影响分光光度计读数的准确性。将96孔板在37℃培养箱孵育2h。
[0101]
酶标仪检测450nm处的吸光值。
[0102]
重复三次实验。
[0103]
细胞存活率(％)＝(抗菌肽处理组-空白)/(dmso对照组-空白)
×
100％如图6和表5所示，抗菌肽cl溶液与a549细胞悬浮液经孵育，od
450
检测结果表明，抗菌肽cl浓度小于等于50μg/ml时尚未有细胞毒性，浓度高于100μg/ml时，溶血率低于50％，即抗菌肽cl具有低细胞毒性。
[0104]
表5细胞毒性结果表
[0105][0106]
实施例10
[0107]
真菌抗菌肽cl的体内杀菌活性测定
[0108]
本实施例中所涉及到的菌株为革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)mu50。
[0109]
实验采用动物侵染模型蜡螟幼虫测定真菌抗菌肽cl在体内的杀菌活性；
[0110]
称取0.3～0.4g的蜡螟幼虫，至于37℃培养箱饥饿12h；随机分配10只蜡螟幼虫于培养皿中；
[0111]
收集37℃，220rpm条件下培养12h的新鲜菌液，用pbs调整菌液至od
600
＝0.2；取出100μl菌液，加入终浓度为200μg/ml的抗菌肽，混匀；分别注射5μl菌液，菌液+抗菌肽至蜡螟幼虫的左后腿处，每组10只；将蜡螟至于37℃培养箱培养；
[0112]
使用pbs作为空白对照组，注射5μl至蜡螟幼虫的左后腿处，每组10只；将蜡螟至于37℃培养箱培养；
[0113]
每12h记录蜡螟幼虫的死亡情况，记录时间至120h；
[0114]
重复三次实验。
[0115]
如图7和表6所示，抗菌肽cl可显著增加蜡螟幼虫侵染细菌后的存活率，即具有体内杀菌活性。
[0116]
表6存活率结果表
[0117][0118]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种抗菌肽cl，其特征在于，所述抗菌肽cl的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述抗菌肽cl在制备具有抗菌和/或杀菌活性的产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌包括金黄色葡萄球菌。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌的敏感菌株和/或耐药菌株。5.一种具有抗菌和/或杀菌活性的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的抗菌肽cl。6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括洗漱用品、化妆品、卫生用品、纺织品或饲料。7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的抗菌肽cl和药学上可接受的辅料。

技术总结
本发明属于抗菌产品技术领域，涉及一种抗菌肽CL及其应用。本发明所述抗菌肽CL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述抗菌肽CL筛选自真菌卢式棒孢菌(Clavisporalusitaniae)，具有低溶血性、低细胞毒性、高稳定性且高效的体内抑菌活性的优势，具有应用安全性。本发明所述抗菌肽CL对皮肤常见感染的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌呈强抑菌性，在开发防治皮肤、口腔等细菌感染方面具有潜在的应用价值。面具有潜在的应用价值。面具有潜在的应用价值。


技术研发人员：陈实 王芳 吴周方
受保护的技术使用者：深圳市第二人民医院（深圳市转化医学研究院）
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/7/22