一种抗RSV羊栖菜多糖及其制备方法与流程

一种抗rsv羊栖菜多糖及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及糖类提取技术领域，尤其涉及一种抗rsv羊栖菜多糖及其制备方法。


背景技术：

2.羊栖菜，褐藻门马尾藻科马尾藻属植物，又称为六角菜、海大麦、玉海草等，其藻体呈黄褐色，是中药“海藻”的主要植物来源之一。我国海藻资源丰富,其营养和药用价值较高且形态差异较大，成熟羊栖菜株高30～50cm。羊栖菜的产地主要分布在我国渤海(如辽宁)、东南沿海(如浙江、福建)、黄海(如山东)等暖温带海域，在日本、韩国、朝鲜等国也有一定分布。羊栖菜味苦、咸、寒，具有坚软散结、利水消肿、泻热化痰等功效，在中医临床上常用于治疗瘰疬、睾丸肿痛、痰饮水肿等疾病。
3.羊栖菜藻体的主要化学成分为羊栖菜多糖，占干藻体物质的50％以上，现代药理实验表明，羊栖菜多糖具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒、抑菌、降血糖及促进生长发育等生物活性。羊栖菜多糖是一类组成结构相似的酸性多糖混合物,分子量大多在3500kda以下，在目前技术条件下可分离出的羊栖菜多糖主要包括岩藻聚糖硫酸酯、褐藻胶、褐藻多糖硫酸脂以及褐藻淀粉等。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是肺病毒属副黏液科rna病毒，是从鼻伤风的黑猩猩体内分离，因其可以使病变细胞融合为多核巨细胞，故被称为呼吸道合胞病毒。rsv常见于温带地区春冬季节及热带地区雨季条件下，易感人群包括婴幼儿以及老年人等抵抗力较差的群体，rsv具有爆发时间长，流行地域广等特点。
4.因对婴幼儿免疫机能研究的不足、母体遗传引起的幼儿免疫差异及婴幼儿和老年人等易感人群对rsv免疫应答等不可控因素的存在，使当下尚无针对治疗rsv的疫苗或特效药，西药治疗中如支气管扩张剂沙丁胺醇、抗炎药物糖皮质激素等可用于rsv感染辅助用药，但在临床上存在影响生长发育、骨代谢等不良反应。而中药及复方制剂因毒副作用较小,在抗病毒方面拥有独特的优势。许多试验表明中药能够下调基因表达，降低炎症因子的表达量，还可以通过调节机体的免疫力等来发挥其抗rsv作用。
5.本技术人首次发现羊栖菜多糖对rsv及ev71病毒均有显著的抑制作用，并申请了专利cn201610763357.4，将羊栖菜粉末与蒸馏水混合后水煮、换液提取，将提取后的滤液浓缩后，加入5％三氯乙酸，离心去除蛋白质，然后将得到的溶液透析后冷冻，加入95％乙醇沉淀多糖，离心取沉淀，真空干燥得到羊栖菜多糖粉末。
6.对于羊栖菜多糖的分离与纯化进行相关的研究，有助于得到高纯度多糖，更好地发挥羊栖菜多糖抗rsv作用。其分离与纯化的效果直接影响了其活性以及对于化合物结构的解析，更是决定着是否能实现未来大规模的工业化生产，历年来羊栖菜多糖的提取方法有超声波法、微波法、水浸提法、酶解等，得到的粗多糖含有大量的蛋白质等杂质，这都会影响着多糖的纯度。


技术实现要素：

7.因此，为了克服上述所指出的缺陷和不足，本发明提供一种抗rsv羊栖菜多糖及其制备方法。
8.为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
9.一种抗rsv羊栖菜多糖，包括以下单糖组分：古罗糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，各单糖组分的摩尔比为1.29：8.24：0.52：0.94：0.28：1.39：0.42：1.61：0.69：4.26。
10.经过测试，所述抗rsv羊栖菜多糖的抑毒指数为420.41。
11.本发明还提供该抗rsv羊栖菜多糖的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)将羊栖菜粉末与水混合，开启搅拌并进行升温，加热至沸腾后继续搅拌2～4h，取滤液经过浓缩、冷冻干燥得到羊栖菜粗多糖；
13.(2)将羊栖菜粗多糖与水混合，搅拌20～60min后静置，待溶液澄清后，缓慢滴加无水乙醇，均匀搅拌1～3h后，静置过夜，次日进行过滤、烘干，重复以上操作四次，得到中间产物ⅰ，搅拌过程温度控制在50～70℃；
14.(3)将中间产物ⅰ加水搅拌溶解，然后加入sevage试剂，充分搅拌混匀后离心，然后过滤除去水层和有机溶剂层交界处的蛋白质，重复以上操作五次，收集有机层，进行浓缩、冷冻干燥后得到中间产物ⅱ；
15.(4)将中间产物ⅱ进行溶解，加入中压制备液相色谱仪的flash柱中，用2.5mol/l氯化钠溶液进行洗脱，控制流速为6ml/min，以紫外分光光度计进行检测，收集波长为216nm处馏分，用1kda的再生纤维素透析袋透析，浓缩、冷冻干燥得到中间产物ⅲ；
16.(5)将步骤(4)得到的中间产物ⅲ溶于水中，用葡聚糖凝胶g-200色谱进行分离，使用纯水进行洗脱，控制流速为0.5ml/min，采用硫酸-苯酚法跟踪检测，至无糖组分流出时，收集馏分并浓缩、减压干燥，得到抗rsv羊栖菜多糖。
17.进一步的改进是：步骤(1)中料液比1：100～150。
18.进一步的改进是：步骤(2)中料液比1：15～30。
19.进一步的改进是：步骤(2)中无水乙醇的添加量为羊栖菜粗多糖质量的30～40倍。
20.进一步的改进是：步骤(4)中压制备液相色谱仪的填料选择为：de-52。
21.通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是：
22.本发明提供的抗rsv羊栖菜多糖制备方法简单、效率高且实用性强，易于推广，能够提取不同分子段的活性多糖。运用紫外分光技术，在200-700nm波长范围内对羊栖菜粗多糖进行扫描，紫外图谱表明羊栖菜粗多糖在216nm处有最大吸收峰，故选择用中压制备液相色谱仪在216nm处进行扫描。在de-52柱色谱纯化时发现，选用2.5mol/l氯化钠溶液作为流动相，可为羊栖菜粗多糖的分离与纯化，得到高纯度多糖提供实验依据。最后再利用葡聚糖凝胶g-200柱层析进行分离，得到羊栖菜多糖。
23.对羊栖菜多糖进行结构解析能够为研究其抗rsv构效关系奠定基础，也可以促进抗rsv药以及多糖药物的发展。而羊栖菜粗多糖分离与纯化效果的好坏影响羊栖菜多糖抗rsv活性及其结构的解析。
附图说明
24.图1是本发明实施例中硫酸-苯酚法在线检测谱图；
25.图1中各标记的含义如下：a、sf-r1，b、sf-r2，c、sf-r3，d、sf-r4，e、sf-r5，f、sf-r6；
26.图2是sf-r1单糖衍生化高效液相色谱图；
27.图2中各标记的含义如下：1、古罗糖醛酸，2、甘露糖醛酸，3、葡糖胺，4、甘露糖，5、鼠李糖，6、葡萄糖醛酸，7、葡萄糖，8、半乳糖，9、木糖，10、岩藻糖；
28.图3是sf-r1的分子量分布谱图；
29.图4是sf-r1的场发射扫描电镜图；
30.图5是sf-r1的原子力显微镜图。
具体实施方式
31.以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
32.若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。
33.实施例
34.一种抗rsv羊栖菜多糖的制备方法，包括以下步骤：
35.(1)将羊栖菜粉末与蒸馏水混合，料液比1：150，开启搅拌并进行升温，加热至沸腾后继续搅拌3h，取滤液经过浓缩、冷冻干燥得到羊栖菜粗多糖；
36.(2)取100g羊栖菜粗多糖与蒸馏水混合，料液比1：20，搅拌30min后静置，待溶液澄清后，缓慢滴加4l无水乙醇，均匀搅拌2h后，静置过夜，次日进行过滤、烘干，重复以上操作四次，得到中间产物ⅰ，搅拌过程温度控制在60℃；
37.(3)取10g中间产物ⅰ加水搅拌溶解，然后加入sevage试剂(氯仿10ml，正丁醇2ml)，充分搅拌混匀后离心，然后过滤除去水层和有机溶剂层交界处的蛋白质，重复以上操作五次，收集有机层，进行浓缩、冷冻干燥后得到中间产物ⅱ；
38.(4)将中间产物ⅱ进行溶解，加入中压制备液相色谱仪的flash柱中，用2.5mol/l氯化钠溶液进行洗脱，控制流速为6ml/min，以紫外分光光度计进行检测，收集波长为216nm处馏分，用1kda的再生纤维素透析袋透析，浓缩、冷冻干燥得到中间产物ⅲ；
39.(5)将步骤(4)得到的中间产物ⅲ溶于水中，用葡聚糖凝胶g-200色谱进行分离，使用纯水进行洗脱，控制流速为0.5ml/min，采用硫酸-苯酚法跟踪检测，至无糖组分流出时，收集馏分并浓缩、减压干燥，得到六段羊栖菜多糖。参考图1，依次命名为sf-r1、sf-r2、sf-r3、sf-r4、sf-r5及sf-r6。
40.本发明中，步骤(1)中料液比在1:100～1:150范围内，均可实现相同的技术效果，并不局限于实施例所给的比值。同理，步骤(2)中料液比在1:15～1:30范围内均满足条件，无水乙醇的添加量为羊栖菜粗多糖质量的30～40倍均满足条件。
41.细胞株与病毒株:
42.均由山东省医学科学院基础医学研究所微生物室提供。hep-2(人喉癌上皮细胞)
取自中国科学院细胞库；rsv(呼吸道合胞病毒，long株，2000年10月引自中国预防医学科学院病毒所毒种室)。
43.细胞毒性测定：
44.参照文献的方法(王小燕,张美英,王亚峰等.槟榔提取物体外抗柯萨奇病毒b3及单纯疱疹病毒1型和乙型肝炎病毒的研究，时珍国医国药，2008；19(12)：2954～2955)，待在96孔板上培养的细胞生长至单层，加阳性药物及各分子段的羊栖菜多糖sf-r1、sf-r2、sf-r3、sf-r4、sf-r5、sf-r6，用细胞维持液从第1孔开始2倍比稀释12个浓度，接种在96孔板上，每个稀释度设3复孔，在37℃、5％co2条件下培养，显微镜下观察其cpe，持续观察药物毒性。经mtt染色，计算阳性药物和各羊栖菜分段多糖的tc
50
(半数中毒浓度)。tc
50
＝[antilog(log高于50％病变率药物稀释度的值-pd)]
×c首孔药物浓度
。双黄连、利巴韦林为阳性对照药物(10mg/ml)。
[0045]
抑制rsv实验
[0046]
将一定浓度的hep-2细胞悬浮液点在96孔板上，待细胞长成单层，将加入2倍浓度梯度稀释的阳性药物及羊栖菜多糖sf-r1，用细胞维持液从第1孔开始，2倍比稀释12个浓度，接种在96孔板上(50μl/孔)，每个稀释度重复3孔，在37℃、5％co2条件下培养，显微镜下持续观察细胞病变直至病毒对照cpe达到90％后终止培养。设细胞对照、病毒对照，双黄连、利巴韦林为阳性对照药物(10mg/ml)。cpe50％的稀释度视为药物半数有效浓度(ec
50
)。ec
50
＝[antilog(log高于50％存活率药物稀释度的值-pd)]
×c首孔药物浓度
。根据所测药物半数中毒浓度(tc
50
)及药物半数有效浓度(ec
50
)，二者相比获得抑毒指数(ti)，ti大于4者判为有效，结果如下表所示。
[0047]
样品tc
50
(g/ml)ec
50
(g/ml)ti利巴韦林8.25
×
10-3
2.00
×
10-3
4.13双黄连2.12
×
10-2
4.50
×
10-3
4.71sf-r14.12
×
10-2
9.80
×
10-5
420.41sf-r22.80
×
10-2
2.82
×
10-4
99.29sf-r32.90
×
10-2
3.82
×
10-4
75.92sf-r41.14
×
10-2
2.41
×
10-4
47.30sf-r52.23
×
10-2
3.60
×
10-4
61.94sf-r63.69
×
10-2
3.32
×
10-4
111.14
[0048]
从上表可以看出，双黄连及利巴韦林抑制rsv效果明显弱于羊栖菜多糖，羊栖菜多糖分子量的大小与其抗病毒效果有关系。sf-r1的ti值为420.41，具有较高的抗rsv活性，本技术将其命名为抗rsv羊栖菜多糖,对其结构进行研究。
[0049]
sf-r1单糖组成测定
[0050]
sf-r1水解及衍生化(pmp衍生化高效液相色谱法)
[0051]
取10mg的sf-r1加入至离心管，加入1ml浓度为4mol/l的三氟乙酸溶液，氮气保护下110℃水解2h，然后冷却至室温，加1ml浓度为4mol/l的naoh溶液中和，调节ph至中性，定容至2.5ml。
[0052]
取上述水解液200μl加至试管，加入200μl浓度为0.3mol/l的naoh溶液以及200μl浓度为0.5mol/l的1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮(pmp)溶液混匀后，在70℃条件反应2h，待反
应结束后加入200μl浓度为0.1mol/l的磷酸二氢钾缓冲溶液(加入氨水ph调为6),加入2ml氯仿萃取，收集水层，萃取三次。水层过0.45μm滤膜后上机。
[0053]
标准溶液制备(pmp衍生化高效液相色谱法)
[0054]
取d-半乳糖、d-甘露糖、d-阿拉伯糖、d-葡萄糖醛酸、l-鼠李糖、d-半乳糖醛酸、l-岩藻糖、d-葡萄糖、d-葡糖胺、d-木糖、d-甘露糖醛酸、l-古罗糖醛酸各10mg，加水溶解后定容至10ml。取200μl加至试管，进行衍生化。
[0055]
高效液相色谱条件
[0056]
色谱柱：zorbaxeclipsexdb-c18，4.6
×
250mm，5μm；
[0057]
检测器：紫外检测器；
[0058]
进样量：20μl，流速：1ml/min；
[0059]
流动相：a相：15％乙腈+85％浓度为50mmol/l磷酸盐缓冲溶液(加入naoh调节ph值为6)，b相：40％乙腈+60％浓度为50mmol/l磷酸盐缓冲溶液(加入naoh调节ph值为6)。
[0060]
梯度洗脱程序：
[0061]
时间/mina相/％b相/％010009928358020457525551000
[0062]
sf-r1单糖衍生化高效液相色谱如图2所示。通过水解后pmp衍生化，可以测得sf-r1单糖种类为古罗糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，其单糖组成摩尔比为：1.29：8.24：0.52：0.94：0.28：1.39：0.42：1.61：0.69：4.26。
[0063]
sf-r1分子量分布测定
[0064]
称取1mg各段(mw1000-50000)对照品和样品，加入流动相超声溶解，高速离心后上机检测。
[0065]
色谱条件为：
[0066]
流动相：0.1mol/l硝酸钠溶液；
[0067]
检测器：示差折光检测器；
[0068]
色谱柱：tskgel g4000pwxl，7.8mm
×
30cm；
[0069]
流速：0.5ml/min，柱温箱：40℃；
[0070]
sf-r1分子量分布如下表所示。
[0071][0072][0073]
sf-r1的场发射扫描电镜观察
[0074]
将烘干后的多糖sf-r1烘干后分散至导电胶上，贴至样品盘后喷金，将样品盘放入场发射扫描电镜。放大至1800倍下观察。
[0075]
由图4可以看出，多糖sf-r1具有明显的枝杈骨架结构，其骨架末端有明显的断面。
[0076]
sf-r1的原子力显微镜观察
[0077]
由图5可见大颗粒状多糖，大小数十纳米之间。经过分析，多糖sf-r1粗糙度为0.6288nm(方均根值)，最大高度为6nm。
[0078]
经场发射扫描电镜、原子力显微镜观察分析，多糖sf-r1具有一定的空间立体结构，并且其内部存在立体空间，立体空间能够达到1-2μm。多糖sf-r1的抗rsv活性可能和其空间架构有直接关系，甚至其形成的内部立体空间可容纳多个rsv，足以吸附大量的rsv，进
而阻止rsv感染宿主细胞。
[0079]
以上所记载，仅为利用本创作技术内容的实施例，任何熟悉本项技艺者运用本创作所做的修饰、变化，皆属本创作主张的专利范围，而不限于实施例所揭示者。

技术特征：
1.一种抗rsv羊栖菜多糖，其特征在于：包括以下单糖组分：古罗糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，各单糖组分的摩尔比为1.29：8.24：0.52：0.94：0.28：1.39：0.42：1.61：0.69：4.26。2.根据权利要求1所述的一种抗rsv羊栖菜多糖，其特征在于：所述抗rsv羊栖菜多糖的抑毒指数为420.41。3.一种如权利要求1所述的抗rsv羊栖菜多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将羊栖菜粉末与水混合，开启搅拌并进行升温，加热至沸腾后继续搅拌2～4h，取滤液经过浓缩、冷冻干燥得到羊栖菜粗多糖；(2)将羊栖菜粗多糖与水混合，搅拌20～60min后静置，待溶液澄清后，缓慢滴加无水乙醇，均匀搅拌1～3h后，静置过夜，次日进行过滤、烘干，重复以上操作四次，得到中间产物ⅰ，搅拌过程温度控制在50～70℃；(3)将中间产物ⅰ加水搅拌溶解，然后加入sevage试剂，充分搅拌混匀后离心，然后过滤除去水层和有机溶剂层交界处的蛋白质，重复以上操作五次，收集有机层，进行浓缩、冷冻干燥后得到中间产物ⅱ；(4)将中间产物ⅱ进行溶解，加入中压制备液相色谱仪的flash柱中，用2.5 mol/l氯化钠溶液进行洗脱，控制流速为6 ml/min，以紫外分光光度计进行检测，收集波长为216 nm处馏分，用1kda的再生纤维素透析袋透析，浓缩、冷冻干燥得到中间产物ⅲ；(5)将步骤(4)得到的中间产物ⅲ溶于水中，用葡聚糖凝胶g-200色谱进行分离，使用纯水进行洗脱，控制流速为0.5ml/min，采用硫酸-苯酚法跟踪检测，至无糖组分流出时，收集馏分并浓缩、减压干燥，得到抗rsv羊栖菜多糖。4.根据权利要求3所述的一种抗rsv羊栖菜多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中料液比1：100～150。5.根据权利要求3所述的一种抗rsv羊栖菜多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中料液比1：15～30。6.根据权利要求3所述的一种抗rsv羊栖菜多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中无水乙醇的添加量为羊栖菜粗多糖质量的30～40倍。7.根据权利要求3所述的一种抗rsv羊栖菜多糖的制备方法，其特征在于：步骤(4)中压制备液相色谱仪的填料选择为：de-52。

技术总结
本发明涉及一种抗RSV羊栖菜多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)羊栖菜粗多糖的制备；(2)羊栖菜粗多糖的水溶醇沉；(3)羊栖菜粗多糖Sevage法去蛋白；(4)中压制备液相色谱纯化；(5)葡聚糖凝胶G-200柱色谱分离。本发明的制备方法有助于得到高纯度多糖，更好地发挥羊栖菜多糖抗RSV作用，为羊栖菜多糖临床用于治疗病毒感染性疾病提供实验依据，对研制抗RSV病毒的药物提供了一定的指导意义，具有重要的参考价值。价值。价值。


技术研发人员：闫滨 白天凯 王尚志 章瑾 田静 高星熠 杨明睿
受保护的技术使用者：山东康众宏医药科技开发有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/22