代谢标志物及其在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，是一种代谢标志物及其在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用。


背景技术：

2.扩张型心肌病是一种常见的心肌病，常常伴随严重的心力衰竭、恶性心律失常、血栓，甚至猝死。扩张型心肌病影响着全球约0.43%的人口，是成人心脏移植的首要原因。尽管过去几十年中不断优化药物以及器械治疗，但扩张型心肌病的总体预后仍然很差，平均5年生存率仅有61%至81%。各年龄阶段的人群包括成人和儿童均受到扩张型心肌病的影响，相关研究显示，病程的长短是扩张型心肌病预后的独立危险因素。因此，早期诊断对于改善扩张型心肌病预后显得尤为重要。
3.扩张型心肌病具体发病机制不明，但是报道显示其发病机制与多种因素有关，包括：遗传、免疫、感染、环境因素等。现在对于扩张型心肌病的诊断主要依赖于心脏超声、磁共振以及bnp等指标，但其准确性和适用性受到多种因素的干扰，如操作者的专业水平、设备条件等。此外，很大一部分扩张型心肌病直到出现严重的并发症如心衰、恶性心律失常甚至猝死时才被检出，这也造成dcm预后较差的原因之一。因此，寻找更为简便、特异的的扩张型心肌病相关标志物对于扩张型心肌病的早期诊断是迫切的。
4.广泛的研究致力于研究确定扩张型心肌病的血液生物标志物，以改进诊断并促进个体化治疗。已经从基因多态性、mirna、免疫细胞等方面进行了深入的研究，但往往因为检测手段复杂、实用性欠佳等原因而限制了推广运用于临床。近年来兴起的代谢组学技术给我们提供了新的思路。代谢组学是机体生物学功能的重要组成部分，是对基因组、转录组或蛋白组以及环境因素的终末反映。代谢组学主要研究生物体内包括细胞、组织、器官、体液、组织中中分子质量小于1000da的小分子化合物，主要检测方法有非靶向或靶向色谱-质谱技术、核磁共振技术等，具有高通量、高准确性、高灵敏性的特点。通过检测生物体内发生扰动的代谢产物的含量、种类等变化，来解释疾病的病例生理机制。该方法具有操作简单、经济适用以及快速的特点，在心血管相关疾病的诊断、治疗和疗效评估方面的应用已得到广泛的认可。研究血浆中的差异代谢物，探索代谢标志物，对于实现扩张型心肌病的早期诊断具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种代谢标志物及其在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用，克服了上述现有技术之不足，首次发现了arginyl-gamma-glutamate在扩张型心肌病患者中水平显著降低，arginyl-gamma-glutamate能够有效的区分健康对照和dcm群体。
6.本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种代谢标志物，所述代谢标志物为arginyl-gamma-glutamate。
7.下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述代谢标志物的样本来源为包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴液、汗液、唾液、玻璃体液、滑液、淋巴液、精液、脑脊髓液、尿液、细胞培养液、细胞或者离体的组织样本或器官样本。
8.上述代谢标志物的样本来源为血浆。
9.本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种代谢标志物在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用，所述代谢标志物为arginyl-gamma-glutamate，所述诊断指诊断区分健康人和扩张型心肌病患者。
10.下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：上述所述试剂盒包括检测样本中代谢物arginyl-gamma-glutamate的含量的试剂以及使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患扩张型心肌病的说明书。
11.上述代谢物arginyl-gamma-glutamate的样本来源为包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴液、汗液、唾液、玻璃体液、滑液、淋巴液、精液、脑脊髓液、尿液、细胞培养液、细胞或者离体的组织样本或器官样本。
12.上述代谢物arginyl-gamma-glutamate的样本来源为血浆。
13.本发明首次发现了arginyl-gamma-glutamate在扩张型心肌病患者中水平显著降低，而且代谢物具有很高的曲线下面积，该代谢物能够有效的区分健康对照和dcm群体，提示将arginyl-gamma-glutamate应用于dcm具有较高的诊断价值，对于早期扩张型心肌病的诊断和指导规范化治疗具有重大的意义；且本发明提供的诊断指标为血浆代谢物，只需要采取少量血液即可检测，基本无创。
附图说明
14.附图1为本发明实施例8中扩张型心肌病病例组与对照组pca模型图。
15.附图2本发明实施例8中扩张型心肌病病例组与对照组opls-da模型图。
16.附图3本发明实施例8中对应附图1的置换检验图。
17.附图4本发明实施例8中z-score标准化病例组和对照组arginyl-gamma-glutamate检测含量对比图。
18.附图5本发明实施例8中arginyl-gamma-glutamate用于检测扩张型心肌病的roc曲线分析图。
具体实施方式
19.本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品。
20.下面结合实施例对本发明作进一步描述：实施例1：该代谢标志物为arginyl-gamma-glutamate。
21.实施例2：作为上述实施例的优化，所述代谢标志物的样本来源为包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴液、汗液、唾液、玻璃体液、滑液、淋巴液、精液、脑脊髓液、尿液、细胞培养液、细胞或者离体的组织样本或器官样本。
22.实施例3：作为上述实施例的优化，所述代谢标志物的样本来源为血浆。
23.实施例4：该代谢标志物在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用，所述代谢标志物为arginyl-gamma-glutamate，所述诊断指诊断区分健康人和扩张型心肌病患者。
24.实施例5：作为上述实施例的优化，所述试剂盒包括检测样本中代谢物arginyl-gamma-glutamate的含量的试剂以及使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患扩张型心肌病的说明书。
25.实施例6：作为上述实施例的优化，所述代谢物arginyl-gamma-glutamate的样本来源为包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴液、汗液、唾液、玻璃体液、滑液、淋巴液、精液、脑脊髓液、尿液、细胞培养液、细胞或者离体的组织样本或器官样本。
26.实施例7：作为上述实施例的优化，所述代谢物arginyl-gamma-glutamate的样本来源为血浆。
27.实施例8：扩张型心肌病相关代谢物的筛选及效能判断一、材料与试剂试剂甲醇（cnwtechnologies）乙腈（cnwtechnologies）乙酸铵（sigma-aldrich）氨水(fisherchemical)超纯水(屈臣氏）仪器超高效液相（thermofisherscientific）高分辨质谱（thermofisherscientific）离心机（thermofisherscientific）天平（sartorius）超声仪（深圳市雷德邦电子有限公司）二、实验方法（一）样本收集收集30例扩张型心肌病患者和30例健康对照的血浆样本。
28.扩张型心肌病组纳入标准：(1)受试者已签署知情同意书；(2)符合《中国扩张型心肌病诊断和治疗指南(2018版)》扩张型心肌病诊断标准；(3)排除标准：存在严重肝肾功能损伤者，恶性肿瘤、血液系统、自身免疫性疾病患者等；妊娠、哺乳期妇女；小于18岁患者。
29.健康对照组纳入标准：(1)受试者已签署知情同意书；(2)身体健康者；(3)排除标准：存在其他疾病如心脑血管疾病、急慢性消化系统疾病、呼吸系统疾病、代谢性疾病、血液系统疾病、感染性疾病、恶性肿瘤等；妊娠或哺乳期妇女。
30.所有受试者收集空腹静脉血4ml至5ml，4℃条件下4000rpm/10min，离心结束后小心取出采血管，避免颠倒，立即分离上层血浆，备用。
31.（二）代谢物的提取(1)移取100μl样品至ep管中，加入400μl提取液（甲醇：乙腈=1：1（v/v），含同位素标记内标混合物），涡旋混匀30s；(2)超声10min（冰水浴）；(3)-40℃静置1h；(4)将样品4℃，12000rpm（离心力13800(
×
g)，半径8.6cm）离心15min；(5)取上清于进样瓶中上机检测；(6)所有样品另取等量上清混合成qc样品上机检测。
32.（三）代谢物检测本项目使用vanquish(thermofisherscientific)超高效液相色谱仪，通过watersacquityuplcbehamide(2.1mm
×
100mm,1.7μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱a相为水相，含25mmol/l乙酸铵和25mmol/l氨水，b相为乙腈。样品盘温度：4℃，进样体积：2μl。thermoqexactivehfx质谱仪能够在控制软件（xcalibur，thermo）控制下进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下：sheathgasflowrate:30arb,auxgasflowrate:25arb,capillarytemperature:350℃,fullmsresolution:120000,ms/msresolution:7500,collisionenergy:10/30/60inncemode,sprayvoltage:3.6kv(positive)或-3.2kv(negative)。
33.（四）质谱数据分析原始数据经proteowizard软件转成mzxml格式后，使用自主编写的r程序包（内核为xcms）进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与biotreedb（v2.1）自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的cutoff值设为0.3。最终输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。通过偏离值过滤（基于相对标准偏差（relativestandarddeviation,rsd))、缺失值过滤（只保留单组空值不多于50%或所有组中空值不多于50%的峰面积数据）、缺失值填补（采用最小值二分之一的数值模拟方法进行填补）以及数据标准化处理（利用内标（internalstandard,is）进行归一化）。
34.使用simca软件(v16.0.2,sartoriusstedimdataanalyticsab,umea,sweden)对数据进行对数（log）转换加uv格式化处理，使用主成分分析(pca)观察一般聚类和异常值。组间差异变量通过opls-da模型获取的vip值进行筛选，vip值大于1，非参检验p值小于0.05的变量认为是组间显著性差异变量，筛选扩张型心肌病早期潜在标志物。使用lasso回归和随机森林变量选择(rfecv)算法结合筛选出特征性差异代谢物，采用roc曲线并计算曲线下面积（auc）以评价代谢标志物对扩张型心肌病的诊断价值。
35.三、结果非监督pca得分图显示(如图1所示)扩张型心肌病组和健康对照组呈现出一定的区分度。进一步采用监督opls-da构建模型(如图2所示)，两组区分度更加明显。通过生物信息学分析，筛选出arginyl-gamma-glutamate为扩张型心肌病特征代谢标志物，发现与健康对照组相比（如图4所示），arginyl-gamma-glutamate的水平明显降低，而且使用roc曲线分析发现代谢物arginyl-gamma-glutamate具有较好的预测价值，auc值为0.94（如图5所示）。
36.综上所述，本发明首次发现了arginyl-gamma-glutamate在扩张型心肌病患者中水平显著降低，而且代谢物具有很高的曲线下面积，该代谢物能够有效的区分健康对照和
dcm群体，提示将arginyl-gamma-glutamate应用于dcm具有较高的诊断价值，对于早期扩张型心肌病的诊断和指导规范化治疗具有重大的意义；且本发明提供的诊断指标为血浆代谢物，只需要采取少量血液即可检测，基本无创。
37.以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

技术特征：
1.一种代谢标志物，其特征在于所述代谢标志物为arginyl-gamma-glutamate。2.根据权利要求1所述的代谢标志物，其特征在于所述代谢标志物的样本来源为包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴液、汗液、唾液、玻璃体液、滑液、淋巴液、精液、脑脊髓液、尿液、细胞培养液、细胞或者离体的组织样本或器官样本。3.根据权利要求1或2所述的代谢标志物，其特征在于所述代谢标志物的样本来源为血浆。4.一种根据权利要求1或2或3所述的代谢标志物在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用，其特征在于所述代谢标志物为arginyl-gamma-glutamate，所述诊断指诊断区分健康人和扩张型心肌病患者。5.根据权利要求4所述的代谢标志物在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用，其特征在于所述试剂盒包括检测样本中代谢物arginyl-gamma-glutamate的含量的试剂以及使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患扩张型心肌病的说明书。6.根据权利要求5所述的代谢标志物在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用，其特征在于所述代谢物arginyl-gamma-glutamate的样本来源为包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴液、汗液、唾液、玻璃体液、滑液、淋巴液、精液、脑脊髓液、尿液、细胞培养液、细胞或者离体的组织样本或器官样本。7.根据权利要求6所述的代谢标志物在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用，其特征在于所述代谢物arginyl-gamma-glutamate的样本来源为血浆。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，是一种代谢标志物及其在制备诊断扩张型心肌病试剂盒方面的应用，所述代谢标志物为Arginyl-Gamma-glutamate。本发明首次发现了Arginyl-Gamma-glutamate在扩张型心肌病患者中水平显著降低，而且代谢物具有很高的曲线下面积，该代谢物能够有效的区分健康对照和DCM群体，提示将Arginyl-Gamma-glutamate应用于DCM具有较高的诊断价值，对于早期扩张型心肌病的诊断和指导规范化治疗具有重大的意义；且本发明提供的诊断指标为血浆代谢物，只需要采取少量血液即可检测，基本无创。基本无创。


技术研发人员：马依彤 李小雷 迪拉热
受保护的技术使用者：新疆医科大学第一附属医院
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/22