喷雾纳米颗粒包裹致死基因TH的dsRNA白背飞虱防治方法及应用

喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法及应用
技术领域
1.本发明涉及白背飞虱防治技术领域，具体涉及喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法及应用。


背景技术：

2.水稻是世界上最重要的粮食作物之一，以中国为例大部分国家都以大米为主要食物来源，具有营养价值高种植面积大，经济效益高等特点。白背飞虱(white-backed planthopper，wbph,sogatellafurcifera)隶属同翅目，飞虱科，主要寄主在水稻，小麦，玉米，甘蔗等作物，是我国影响水稻稳定产量的主要害虫。白背飞虱以口针刺破水稻根茎组织吸取汁液消耗了其营养然后阻碍水稻体内水分和养分的输导，严重时造成虱烧。雌虫产卵时用剑状的产卵器划破水稻叶片，一方面破坏输导组织阻碍营养物质的输送另一方面产卵造成的伤口也有利于病原菌的侵染，并造成腐生菌滋生极易招致烟煤病的滋生。特别是白背飞虱传播的南方水稻黑条矮缩病(srbsdv)，造成了水稻产量大幅度减少产生严重的经济损失。目前对于白背飞虱的防治以施用化学杀虫剂为主，但是因白背飞虱体型小、繁殖能力强、迁飞能力强、环境适应性强等特点长期大量不合理的使用化学农药使白背飞虱产生了很高的抗药性杀虫效率低，农药残留导致环境污染造成严重的环境安全问题，防治成本大大提高。因此迫切需要提供一种新型绿色高效防治技术控制此害虫。
3.rna干扰(rna interference，rnai)是一种广泛存在于真核生物的转录后基因沉默现象，其原理是双链rna(double-stranded rna，dsrna)可引起生物体内同源序列mrna特异性地降解。rnai具有高效性和特异性，递送特定基因dsrna进入昆虫体内后会影响昆虫发育畸形甚至死亡，rnai技术在害虫管理方面显示出巨大潜力。但目前rnai技术面临两大挑战：
①
引发rnai作用的dsrna现存递送方法效率低且在自然环境中不稳定易被降解，控制害虫效率远远低于化学杀虫剂的杀虫效率制约了dsrna作为绿色杀虫剂在田间的运用；
②
dsrna生产成本高尚不能大规模应用于田间。由体外合成试剂盒合成dsrna虽然快速，方便和高效但成本较高，大规模田间使用不切实际。转基因植物表达dsrna虽然特异性强干扰效率高但是转基因食品的安全性有待商榷。设计特异性引物后构建dsrna表达载体并将其转入rnase iii缺陷的大肠杆菌ht115感受态中，经诱导可提取出大量高质量dsrna,此方法花费较低适于大规模使用但是需要保证菌液高活性和寻找出适当的载体。
4.在昆虫酪氨酸介导的黑色素合成通路中，在酪氨酸羟化酶(th)作用下将酪氨酸转化为二羟基苯丙氨酸(dopa)，然后在其他酶或基因的作用下产生多巴胺等物质使昆虫产生不同的体色，对昆虫生长、发育和生殖等有着重要作用。在其它昆虫中沉默th的表达后昆虫完全失去了黑色和黄色色素体色变为白色而且表皮角质层变得更加柔软，昆虫死亡率增加，蜕皮和翅等的发育过程均受到影响。目前还没有针对白背飞虱的防治中通过喷雾细菌表达来源的th基因dsrna并将其结合纳米材料的方法报道。
5.为此，本发明旨在提供一种喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna新型白背飞虱
防治方法及应用，以解决上述问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了解决上述问题，提供喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法及应用。
7.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
8.本发明提供了喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法，包括以下步骤：
9.s1、白背飞虱th基因全长克隆：
10.随机选取20mg白背飞虱，采用thecell/tissue total rna isolation kit(vazyme,nanjing,china)提取白背飞虱的总rna，使用反转录试剂盒one-step gdna removal and cdna synthesis supermix(transgen,beijing,china)合成cdna，根据白背飞虱转录组数据利用primer.5软件设计引物；以反转录得到的cdna第一链为模板，通过pcr扩增得到目标基因完整氨基酸片段；对pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；采用gel dna extraction mini kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒)对目标产物进行纯化回收，将回收产物连接pmd19-t载体(takara,dalian,china)后转入trans-t1感受态细胞(transgene,beijing,china)中，涂于具有100mg/mlamp抗性的培养基上过夜培养；挑取阳性单菌落送至安徽通用生物公司进行测序；将测序结果通过ncbi数据库进行比对，得到白背飞虱th基因的序列片段,然后按照plasmid mini kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒提取质粒；
11.s2、合成th的dsrna：
12.稀释10倍的质粒为模板，继续用带有t7启动子序列的引物进行pcr扩增，扩增方法和体系同步骤s1，凝胶电泳检测后对目标产物进行回收纯化方法参照步骤1其产物为dsrna合成的模板；dsrna合成使用t7 rnai transcription kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒，反应体系为：8μl ntp mix,2μl 10
×
transcription buffer，dna模板1000ng，t7enzyme mix 2μl，补足ddh2o至20μl；然后轻轻用移液器混合样品后放置在37℃条件下孵育2h；定量和2％琼脂糖凝胶电泳结果均理想后将dsrna存放于-80℃冰箱直至使用；
13.s3、显微注射法rnai：
14.选取龄期一致的白背飞虱4龄若虫，注射前用co2麻醉白背飞虱约30s，在若虫未恢复行动之前将其单独整齐排列在自制的pbs凝胶上；用显微注射器(nanoject iii,drummond,usa)往其胸部注射75nl浓度为2000ng/μl的dssfth和dsgfp做为对照；每个处理注射90只4龄若虫，10头为一个生物学重复；注射后的白背飞虱用湿润棉花包裹着的新鲜水稻苗饲养于干净无菌的玻璃管中，并用防虫网封口以免逃逸；然后将玻璃管放入条件为光照∶黑暗时间为14∶10h，光照温度为26
±
1℃，相对湿度为90％
±
5％的人工气候培养箱中培养；注射后每隔24h统计白背飞虱死亡数，突变数直到第五天结束；
15.s4、注射dssfth抑制白背飞虱体内th基因的表达：
16.在注射5天后收集存活的白背飞虱平均分为三组然后提取收集白背飞虱的rna，然后将其反转录成cdna操作同步骤1；利用primer.5软件设计qpcr引物并以18s ribosome rna作为内参基因，使用green qpcr supermix(transgene,beijing,china)试
剂盒进行qpcr检测；
17.s5、dsrna菌液表达与纯化：
18.在pet2p质粒(南京农业大学)上选择ecori酶切位点设计特异性引物，以步骤s1中稀释10倍的质粒为模板，用带有对应酶切位点pet2p-th的引物进行pcr扩增，扩增体系和程序同步骤s1；用dna限制性内切酶ecori(monad,chengdu,china)对pet2p质粒进行线性化；对目的基因扩增产物和载体线性化产物进行凝胶电泳回收纯化；
19.利用重组试剂盒ultra one step cloning kit(vazyme,nanjing,china)按照摩尔比1：3比例在50℃条件下连接纯化的目的片段与线性化的载体15min，构建重组载体转入trans-t1细胞(transgene,beijing,china)；然后用含有50mg/ml卡纳的lb平板过夜培养；
20.随后将pet2p-sfth转入到ht115感受态细胞中，用含有50mg/ml卡纳和12.5mg/ml盐酸四环素的lb平板过夜培养，验证阳性克隆获得成功表达th和gfp的ht115表达菌液；将菌液按1:50接种于含有50mg/ml卡纳和12.5mg/ml盐酸四环素的lb液体培养基中，37℃,230rpm大约摇7h至od值达到0.5-1然后加入0.8倍体积为终浓度500mm的iptg诱导表达，相同条件继续培养8h；采用苯酚-氯仿法提取dsrna；4℃，7500g离心5min收集大肠杆菌细胞，小心取出上清；然后将菌体沉淀以100：1比例悬浮在ste缓冲液(solarbio,shanghai,china)中，再加入相同体积的苯酚/氯仿rna提取液(25∶24∶1,ph《5,solarbio,shanghai,china)，剧烈涡旋3min然后在4℃下15,000g离心15min；离心结束后吸收上清液转移到新鲜离心管中加入与ste缓冲液相同体积的异丙醇，涡旋混匀沉淀后置于室温下孵育10min，然后在4℃下12，000g离心10min；取出上清液后用与ste缓冲液相同体积的75％乙醇洗涤沉淀，然后在4℃，7500g离心5min；再次重复洗涤操作；沉淀室温干燥8min以便蒸发剩余乙醇，然后按100：1比例加入rnase-free溶解沉淀，轻轻吸吸获得dsrna；dsrna样品用10：1比例的dnaseⅰ和稀释200倍rnase a(transgen,beijing,china)纯化，在37℃孵育15min然后在65℃水浴中失活10min；自然冷却到室温稀释100倍进行定量和电泳检测，纯化后dsrna放置于-80℃保存防止其降解；
21.s6、喷雾rnai：
22.取纳米材料spc、促进昆虫体壁渗透的表面活性剂以及取菌液表达获得的dssfth和dsgfp，电泳灰度定量后按纳米载体spc与dsrna质量比1.5：1配制200μl复合物配方，得到dsrna终浓度为500ng/μl，spc终浓度为750ng/μl，再加入0.6μl的表面活性剂；
23.选发育正常的4龄白背飞虱若虫为实验对象，将其置于装有12株新鲜水稻苗的7～8cm高的透明塑料杯中适应环境24h，确保所有白背飞虱均留在叶片上，然后用2ml体积的手喷雾器将200μl的混合液从4个方向直接喷向水稻幼苗和白背飞虱虫身，处理组为dssfth/spc/表面活性剂，对照组为dsgfp/spc/表面活性剂和ddh2o/spc/表面活性剂；
24.以水稻苗为食的白背飞虱直接受到纳米载体介导的dsrna复合物的影响，每个处理包含20只白背飞虱共重复11组，在喷雾48h后测定3个重复的基因mrna表达量具体操作同步骤4，剩余8个重复在11天内每隔24h测定致死效果。
25.进一步地，步骤s1中的pcr反应体系为：cdna 1μl,2
×
taq plus master mixⅱ12.5μl,1μl forward primer and 1μl reverse primer(10μm),然后补9.5μl ddh2o；pcr反应条件为:95℃ 2min,在95℃30s、62℃20s、72℃1min循环40次，最后72℃10min。
26.进一步地，步骤s3中的对照的gfp大小为400bp，且其合成方法与步骤s2中的th的合成方法一致。
27.进一步地，步骤s4中的反应体系为20μl，组分包含green qpcr supermix 10μl、2μl cdna、0.4μl正向引物、0.4μl反向引物(10μm)、其余体积为ddh2o，反应条件为94℃30s，94℃、5s，60℃、30s，55℃、60s，50个循环，反应在bio-iq5 qpcr(bio-rad,usa)仪器中进行。
28.本发明还提供了上述喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法的应用，将方法应用于防控白背飞虱。
29.与现有技术相比，本方案的有益效果：
30.1、本发明首次对白背飞虱酪氨酸介导的黑色素合成通路中的相关基因th设计引物并用试剂盒合成了dsrna，用显微注射法进行rnai探索了沉默该基因后对白背飞虱的生长发育影响，得到其具有高致死率的效果，筛选获得了一个白背飞虱高效致死靶基因-th。
31.2、并基于该基因和表达能力强的pet2p构建表达载体，pet2p已被证实较商品化的l4440载体而言能产生更多，质量更好的双链rna。重组质粒在大肠杆菌ht115中表达出大量高质量的所需的目的基因的dsrna，大肠杆菌ht115表达产生的dsrna消除了rnase iii不易被降解。通过细菌表达产生dsrna操作与现有技术采用的试剂盒体外转录和化学合成方法相比简单方便，安全性高而且成本较低。
32.3、运用纳米材料spc与dsrna,表面活性剂结合形成复合制剂喷洒在水稻幼苗上。表面活性剂可以帮助纳米载体/dsrn复合物进入白背飞虱体角质层，spc提高了dsrna在昆虫体内的稳定性和持效性从而提高了干扰效率。此外直接将dsrna/spc/表面活性剂喷淋在易受伤害的白背飞虱体表上，可以避免白背飞虱损伤而且减少dsrna的消耗。
33.4、本发明为直接喷施rnai农药来防控白背飞虱，是最接近于田间防治的方法提供了可行性，具有重要的实践意义。构造的喷雾方法简单易操作且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。
附图说明
34.图1是本发明实施例中th和gfp的dsrna凝胶电泳跑胶图，m为dl2000 plus marker，th的大小为372bp，gfp的是400bp。
35.图2是本发明实施例中白背飞虱显微注射递送dssfth后的基因相对表达量，生存率，突变率变化其中gfp表示对照组。
36.图3是本发明实施例中白背飞虱显微注射递送dssfth后的表型变化其中gfp表示对照组。
37.图4是本发明实施例中白背飞虱喷雾递送dssfth后的基因相对表达量，生存率，突变率变化其中gfp和h2o表示对照组。
38.图5是本发明实施例中；白背飞虱喷雾递送dssfth后的表型变化其中gfp和h2o表示对照组。
具体实施方式
39.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及
附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
40.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
41.实施例：
42.本实施例方案提供了如上述发明内容中所述的喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法及应用。
43.以下为本实施例方案的具体实验实施过程：
44.一、实验实施过程
45.1、白背飞虱th基因全长克隆
46.随机选取20mg白背飞虱，采用thecell/tissue total rna isolation kit(vazyme,nanjing,china)提取白背飞虱的总rna，使用反转录试剂盒one-step gdna removal and cdna synthesis supermix(transgen,beijing,china)合成cdna，根据白背飞虱转录组数据利用primer5软件设计引物。以反转录得到的cdna第一链为模板，通过pcr扩增得到目标基因完整氨基酸片段。pcr反应体系为：cdna 1μl,2
×
taq plus master mixⅱ12.5μl,1μl正向引物和1μl反向引物(10μm),然后补9.5μl ddh2o。pcr反应条件为:95℃2min,在95℃30s、62℃20s、72℃1min循环40次，最后72℃10min。对pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。采用gel dna extraction mini kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒)对目标产物进行纯化回收，将回收产物连接pmd19-t载体(takara,dalian,china)后转入trans-t1感受态细胞(transgene,beijing,china)中，涂于具有100mg/mlamp抗性的培养基上过夜培养。挑取阳性单菌落送至安徽通用生物公司进行测序。将测序结果通过ncbi数据库进行比对，得到白背飞虱th基因的序列片段,然后按照plasmid mini kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒提取质粒。
47.2、合成th的dsrna
48.稀释10倍的质粒为模板，继续用带有t7启动子序列的引物进行pcr扩增，扩增方法和体系同步骤1，凝胶电泳检测后对目标产物进行回收纯化方法参照步骤1其产物为dsrna合成的模板。dsrna合成使用t7rnai transcription kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒，反应体系为：8μlntp mix,2μl 10
×
transcription buffer，dna模板1000ng，t7 enzyme mix 2μl，补足ddh2o至20μl。然后轻轻用移液器混合样品后放置在37℃条件下孵育2h。定量和2％琼脂糖凝胶电泳结果均理想后将dsrna存放于-80℃冰箱直至使用。
49.3、显微注射法rnai
50.选取龄期一致的白背飞虱4龄若虫，注射前用co2麻醉白背飞虱约30s，在若虫未恢复行动之前将其单独整齐排列在自制的pbs凝胶上。用显微注射器(nanoject iii,drummond,usa)往其胸部注射75nl浓度为2000ng/μl的dssfth和dsgfp做为对照(gfp大小400bp，合成方法同th)。每个处理注射90只4龄若虫，10头为一个生物学重复。注射后的白背飞虱用湿润棉花包裹着的新鲜水稻苗饲养于干净无菌的玻璃管中，并用防虫网封口以免逃逸。然后将玻璃管放入条件为光照∶黑暗时间为14∶10h，光照温度为26
±
1℃，相对湿度为90％
±
5％的人工气候培养箱中培养。注射后每隔24h统计白背飞虱死亡数，突变数直到第
五天结束。
51.4、注射dssfth抑制白背飞虱体内th基因的表达
52.在注射5天后收集存活的白背飞虱平均分为三组然后提取收集白背飞虱的rna，然后将其反转录成cdna操作同步骤1。利用primer.5软件设计qpcr引物并以18s ribosome rna作为内参基因，使用green qpcr supermix(transgene,beijing,china)试剂盒进行qpcr检测。反应体系为20μl，组分包含green qpcr supermix 10μl、2μl cdna、0.4μl正向引物、0.4μl反向引物(10μm)、其余体积为ddh2o，反应条件为94℃30s，94℃、5s，60℃、30s，55℃、60s，50个循环，反应在bio-iq5 qpcr(bio-rad,usa)仪器中进行。
53.5、dsrna菌液表达与纯化
54.在pet2p质粒(南京农业大学)上选择ecori酶切位点设计特异性引物，以步骤(1)中稀释10倍的质粒为模板，用带有对应酶切位点pet2p-th的引物进行pcr扩增，扩增体系和程序同步骤1。用dna限制性内切酶ecori(monad,chengdu,china)对pet2p质粒进行线性化。对目的基因扩增产物和载体线性化产物进行凝胶电泳回收纯化，方法参照步骤1。利用重组试剂盒ultra one step cloning kit(vazyme,nanjing,china)按照摩尔比1：3比例在50℃条件下连接纯化的目的片段与线性化的载体15min，构建重组载体转入trans-t1细胞(transgene,beijing,china)然后用含有50mg/ml卡纳的lb平板过夜培养，验证阳性克隆后使用提取质粒方法同步骤(1)。随后将pet2p-sfth转入到ht115感受态细胞中，用含有50mg/ml卡纳和12.5mg/ml盐酸四环素的lb平板过夜培养，验证阳性克隆获得成功表达th和gfp的ht115表达菌液。将菌液按1:50接种于含有50mg/ml卡纳和12.5mg/ml盐酸四环素的lb液体培养基中，37℃,230rpm大约摇7h至od值达到0.5-1然后加入0.8倍体积为终浓度500mm的iptg诱导表达，相同条件继续培养8h。采用苯酚-氯仿法提取dsrna。4℃，7500g离心5min收集大肠杆菌细胞，小心取出上清。然后将菌体沉淀以100：1比例悬浮在ste缓冲液(solarbio,shanghai,china)中，再加入相同体积的苯酚/氯仿rna提取液(25∶24∶1,ph《5,solarbio,shanghai,china)，剧烈涡旋3min然后在4℃下15,000g离心15min。离心结束后吸收上清液转移到新鲜离心管中加入与ste缓冲液相同体积的异丙醇，涡旋混匀沉淀后置于室温下孵育10min，然后在4℃下12，000g离心10min。取出上清液后用与ste缓冲液相同体积的75％乙醇洗涤沉淀，然后在4℃，7500g离心5min。再次重复洗涤操作。沉淀室温干燥8min以便蒸发剩余乙醇，然后按100：1比例加入rnase-free溶解沉淀，轻轻吸吸获得dsrna。dsrna样品用10：1比例的dnaseⅰ和稀释200倍rnasea(transgen,beijing,china)纯化，在37℃孵育15min然后在65℃水浴中失活10min。自然冷却到室温稀释100倍进行定量和电泳检测，纯化后dsrna放置于-80℃保存防止其降解。
55.6、喷雾rnai
56.纳米材料spc为一种星型阳离子聚合物由中国农业大学惠赠，浓度为58.57mg/ml。促进昆虫体壁渗透的表面活性剂用量为总体积的0.3％。取菌液表达获得的dssfth和dsgfp，电泳灰度定量后按纳米载体spc与dsrna质量比1.5：1配制200μl复合物配方，得到dsrna终浓度为500ng/μl，spc终浓度为750ng/μl，再加入0.6μl的表面活性剂，具体加样体积如下表1所示；具体加样体积如下表1所示；
57.表1：复合物配方的组成
[0058][0059]
选发育正常的3龄白背飞虱若虫为实验对象，将其置于装有12株新鲜水稻苗的7～8cm高的透明塑料杯中适应环境24h，确保所有白背飞虱均留在叶片上，然后用2ml体积的手喷雾器将200μl的混合液从4个方向直接喷向水稻幼苗和白背飞虱虫身，处理组为dssfth/spc/表面活性剂，对照组为dsgfp/spc/表面活性剂和ddh2o/spc/表面活性剂。以水稻苗为食的白背飞虱直接受到纳米载体介导的dsrna复合物的影响，每个处理包含20只白背飞虱共重复11组，在喷雾48h后测定3个重复的基因mrna表达量具体操作同步骤4，剩余8个重复在11天内每隔24h测定致死效果。
[0060]
二、实验结果
[0061]
1、pcr扩增，dsrna合成，菌液表达后均得到条带清晰单一的条带，th大小为372bp而gfp大小为400bp。
[0062]
2、显微注射dssfth对白背飞虱的影响：
[0063]
注射dsgfp的白背飞虱生长发育同正常白背飞虱无突变现象，死亡率为22.22％。注射dssfth的白背飞虱死亡率显著高于对照组，五天后死亡率高达87.78％，是注射dsgfp白背飞虱的3.95倍，突变率为28.89％。注射dsgfp的白背飞虱体现出正常的体色，但注射dssfth的白背飞虱整个虫体体色苍白角质层更柔软，缺失黑色素和黄色色素。此外，沉默sfth表达后白背飞虱翅膀异常向外卷曲皱缩无法完全展开，翅斑消失。qpcr实验结果显示与对照组相比注射dssfth的白背飞虱中th基因的表达显著降低了85.97％，说明注射dssfth对白背飞虱有明显的沉默效应从而造成白背飞虱发育畸形和死亡率大幅度增加。
[0064]
3、喷雾纳米材料包裹的源自菌液表达的dsrna对白背飞虱的防治效果
[0065]
喷雾处理48h后，与h2o/spc/洗涤剂对照组相比，th基因mrna水平显著下调至25.38％，较dsgfp对照组降低76.78％，qpcr结果显示在spc的辅助下有明显的基因沉默效应。喷洒复合物11天后，spc+dssfth+表面活性剂处理组的累计死亡率为83.22％，而gfp对照组的累计死亡率为39.24％,水处理对照组的累计死亡率为27.52％，处理组的死亡率分别比h2o对照组和dsgfp对照组高3.03倍和2.12倍。喷雾dssfth+spc+表面活性剂、dsgfp+
spc+表面活性剂和h2o/spc/表面活性剂的白背飞虱在11天时的累积畸形率分别为38.13％、3.13％和2.5％，处理组的突变率显著高于对照组。处理组的累计羽化率为33.13％，而在h2o和gfp对照组的累计羽化率分别为78.13％和66.88％，表明混合物dssfth和spc导致成虫数量显著减少。突变现象为白背飞虱全身颜色变淡而且自身黑、黄色素减少，翅膀卷曲不能正常地完全伸展开。纳米载体spc可与dsrna的结合提升双链rna干扰效率，为白背飞虱基于rnai绿色防治提供了可靠的纳米材料和靶标基因位点。
[0066]
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法，其特征是：包括以下步骤：s1、白背飞虱th基因全长克隆：随机选取20mg白背飞虱，采用thecell/tissue total rna isolation kit(vazyme,nanjing,china)提取白背飞虱的总rna，使用反转录试剂盒one-step gdna removal and cdna synthesis supermix(transgen,beijing,china)合成cdna，根据白背飞虱转录组数据利用primer.5软件设计引物；以反转录得到的cdna第一链为模板，通过pcr扩增得到目标基因完整氨基酸片段；对pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；采用gel dna extraction mini kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒)对目标产物进行纯化回收，将回收产物连接pmd19-t载体(takara,dalian,china)后转入trans-t1感受态细胞(transgene,beijing,china)中，涂于具有100mg/ml amp抗性的培养基上过夜培养；挑取阳性单菌落送至安徽通用生物公司进行测序；将测序结果通过ncbi数据库进行比对，得到白背飞虱th基因的序列片段,然后按照plasmid mini kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒提取质粒；s2、合成th的dsrna：稀释10倍的质粒为模板，继续用带有t7启动子序列的引物进行pcr扩增，扩增方法和体系同步骤s1，凝胶电泳检测后对目标产物进行回收纯化方法参照步骤1其产物为dsrna合成的模板；dsrna合成使用t7 rnai transcription kit(vazyme,nanjing,china)试剂盒，反应体系为：8μl ntp mix,2μl 10
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transcription buffer，dna模板1000ng，t7 enzyme mix 2μl，补足ddh2o至20μl；然后轻轻用移液器混合样品后放置在37℃条件下孵育2h；定量和2％琼脂糖凝胶电泳结果均理想后将dsrna存放于-80℃冰箱直至使用；s3、显微注射法rnai：选取龄期一致的白背飞虱4龄若虫，注射前用co2麻醉白背飞虱约30s，在若虫未恢复行动之前将其单独整齐排列在自制的pbs凝胶上；用显微注射器(nanoject iii,drummond,usa)往其胸部注射75nl浓度为2000ng/μl的dssfth和dsgfp做为对照；每个处理注射90只四龄若虫，10头为一个生物学重复；注射后的白背飞虱用湿润棉花包裹着的新鲜水稻苗饲养于干净无菌的玻璃管中，并用防虫网封口以免逃逸；然后将玻璃管放入条件为光照∶黑暗时间为14∶10h，光照温度为26
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1℃，相对湿度为90％
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5％的人工气候培养箱中培养；注射后每隔24h统计白背飞虱死亡数，突变数直到第五天结束；s4、注射dssfth抑制白背飞虱体内th基因的表达：在注射5天后收集存活的白背飞虱平均分为三组然后提取收集白背飞虱的rna，然后将其反转录成cdna操作同步骤1；利用primer.5软件设计qpcr引物并以18s ribosome rna作为内参基因，使用green qpcr supermix(transgene,beijing,china)试剂盒进行qpcr检测；s5、dsrna菌液表达与纯化：在pet2p质粒(南京农业大学)上选择ecori酶切位点设计特异性引物，以步骤s1中稀释10倍的质粒为模板，用带有对应酶切位点pet2p-th的引物进行pcr扩增，扩增体系和程序同步骤s1；用dna限制性内切酶ecori(monad,chengdu,china)对pet2p质粒进行线性化；对目
的基因扩增产物和载体线性化产物进行凝胶电泳回收纯化；利用重组试剂盒ultraonestepcloningkit(vazyme,nanjing,china)按照摩尔比1：3比例在50℃条件下连接纯化的目的片段与线性化的载体15min，构建重组载体转入trans-t1细胞(transgene,beijing,china)；然后用含有浓度为50mg/ml卡纳抗生素的lb平板过夜培养；随后将pet2p-sfth转入到ht115感受态细胞中，用含有50mg/ml卡纳和12.5mg/ml盐酸四环素的lb平板过夜培养，验证阳性克隆获得成功表达th和gfp的ht115表达菌液；将菌液按1:50接种于含有50mg/ml卡纳和12.5mg/ml盐酸四环素的lb液体培养基中，37℃,230rpm大约摇7h至od值达到0.5-1然后加入0.8倍体积为终浓度500mm的iptg诱导表达，相同条件继续培养8h；采用苯酚-氯仿法提取dsrna；4℃，7500g离心5min收集大肠杆菌细胞，小心取出上清；然后将菌体沉淀以100：1比例悬浮在ste缓冲液(solarbio,shanghai,china)中，再加入相同体积的苯酚/氯仿rna提取液(25∶24∶1,ph<5,solarbio,shanghai,china)，剧烈涡旋3min然后在4℃下15,000g离心15min；离心结束后吸收上清液转移到新鲜离心管中加入与ste缓冲液相同体积的异丙醇，涡旋混匀沉淀后置于室温下孵育10min，然后在4℃下12，000g离心10min；取出上清液后用与ste缓冲液相同体积的75％乙醇洗涤沉淀，然后在4℃，7500g离心5min；再次重复洗涤操作；沉淀室温干燥8min以便蒸发剩余乙醇，然后按100：1比例加入rnase-free溶解沉淀，轻轻吸吸获得dsrna；dsrna样品用10：1比例的dnase
ꢀⅰ
和稀释200倍rnase a(transgen,beijing,china)纯化，在37℃孵育15min然后在65℃水浴中失活10min；自然冷却到室温稀释100倍进行定量和电泳检测，纯化后dsrna放置于-80℃保存防止其降解；s6、喷雾rnai：取纳米材料spc、促进昆虫体壁渗透的表面活性剂以及取菌液表达获得的dssfth和dsgfp，电泳灰度定量后按纳米载体spc与dsrna质量比1.5：1配制200μl复合物配方，得到dsrna终浓度为500ng/μl，spc终浓度为750ng/μl，再加入0.6μl的表面活性剂；选发育正常的4龄白背飞虱若虫为实验对象，将其置于装有12株新鲜水稻苗的7～8cm高的透明塑料杯中适应环境24h，确保所有白背飞虱均留在叶片上，然后用2ml体积的手喷雾器将200μl的混合液从4个方向直接喷向水稻幼苗和白背飞虱虫身，处理组为dssfth/spc/表面活性剂，对照组为dsgfp/spc/表面活性剂和ddh2o/spc/表面活性剂；以水稻苗为食的白背飞虱直接受到纳米载体介导的dsrna复合物的影响，每个处理包含20只白背飞虱共重复11组，在喷雾48h后测定3个重复的基因mrna表达量具体操作同步骤4，剩余8个重复在11天内每隔24h测定致死效果。2.如权利要求1所述的喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法，其特征是：步骤s1中的pcr反应体系为：cdna 1μl,12.5μl 2
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taq plus master mixⅱ,1μl上下游引物(10μm),然后补9.5μl ddh2o；pcr反应条件为:95℃2min,在95℃30s、62℃20s、72℃1min循环40次，最后72℃10min。3.如权利要求1所述的喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法，其特征是：步骤s3中的对照的gfp大小为400bp，且其合成方法与步骤s2中的th的合成方法一致。4.如权利要求1所述的喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法，其特征是：步骤s4中的反应体系为20μl，组分包含greenqpcrsupermix10μl、2μ
lcdna、0.4μl正向引物、0.4μl反向引物(10μm)、其余体积为ddh2o，反应条件为94℃30s，94℃、5s，60℃、30s，55℃、60s，50个循环，反应在bio-iq5qpcr(bio-rad,usa)仪器中进行。5.如权利要求1-4所述的喷雾纳米颗粒包裹致死基因th的dsrna白背飞虱防治方法，其特征是：所述方法应用于防控白背飞虱。

技术总结
本发明公开了喷雾纳米颗粒包裹致死基因TH的dsRNA白背飞虱防治方法及应用，涉及白背飞虱防治技术领域，其技术要点为：包括以下步骤：S1、白背飞虱TH基因全长克隆；S2、合成TH的dsRNA；S3、显微注射法RNAi；S4、注射dsSfTH抑制白背飞虱体内TH基因的表达；S5、dsRNA菌液表达与纯化；S6、喷雾RNAi。本发明直接将dsRNA/SPc/表面活性剂喷淋在易受伤害的白背飞虱体表上，可以避免白背飞虱损伤而且减少dsRNA的消耗。本发明为直接喷施RNAi农药来防控白背飞虱，是最接近于田间防治的方法提供了可行性，具有重要的实践意义。构造的喷雾方法简单易操作且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。有很好的应用前景。有很好的应用前景。


技术研发人员：贺鹏 郭欢 闫硕 沈杰
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.03.08
技术公布日：2023/7/22