枸杞与番茄水平基因转移体系建立及转化根获得的方法

1.本发明涉及一种通过改良嫁接技术快速实现枸杞遗传物质水平转移至番茄并获得番茄再生的不定根的方法。通过生物信息学定位，特异性的在番茄中筛选出枸杞的dna片段，明确了番茄嫁接区域再生的不定根为转化根。具有转化根的番茄植物根系活力好，生长势强，长季节生长，实现了木本与草本不同物种间的优势互补，对提升番茄等蔬菜作物的产量、品质、抗性等都具有重要的意义。


背景技术：

2.水平基因转移可以定义为通过受精以外的方式进行的跨物种遗传物质传递，随着测序水平和生物信息学分析水平的进步，在植物基因组中发现水平基因转移的频率越来越高。对植物而言，水平基因转移通过相互接触的介导载体，包括共生、内共生、寄生、嫁接、附生等，直接进行遗传物质的交流；还涉及到病毒、细菌、真菌、昆虫(蚜虫)、线虫、花粉粒、转座元件等间接接触的中间载体。嫁接介导的水平基因转移现象最早是在烟草中观察到的，近年来，嫁接介导的水平基因转移事件会密切在相关物种之间发生，例如茄科植物烟草种内在嫁接结合部位存在着线粒体基因组片段、完整的叶绿体基因组以及整个核基因组水平基因转移的现象。水平基因的转移为农作物人工定向改良提供了一条崭新的途径。
3.茄科植物番茄(solanum lycopersicum)为世界第一大果实类蔬菜，植株顶端具有不断向上生长和开花结果的能力，营养生长和生殖生长同时进行，适合高效高产的长季节栽培。而番茄的地下根却容易受冬春季低温弱光/夏秋季高温高湿、土传病害危害、连作障碍等因素影响，引起根系活力下降和早衰，严重制约地上部分产量和品质的提升。因此，针对当前番茄植株抗逆性差、根系早衰以及改善设施栽培环境成本高等问题，番茄根系性状的改良迫在眉睫。
4.同属茄科植物的枸杞(lycium chinense miller.)与草本植物番茄相比，枸杞根系发达，为多年生，由于生长于干旱荒漠地带，根系具有抗旱、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠等极强的抗逆性，同时枸杞果实营养极其丰富，因此是改善番茄植株抗逆性差、根系早衰等问题合适的亲本材料。然而，枸杞与番茄亲缘关系较远，远缘杂交、细胞融合等都很困难。因此，通过降低枸杞细胞木质素含量建立高效嫁接体系的基础上，建立枸杞与番茄细胞间水平基因转移的技术体系，通过研究番茄不定根的诱导方法，获得枸杞遗传物质发生转化的番茄转化根，是解决当前番茄强根生物育种的一条有效途径。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，建立一种高效的枸杞与番茄细胞之间的水平基因转移体及其转化根获得的方法，首先需要通过降低枸杞细胞木质素含量，消除远缘嫁接细胞之间隔离层，使两个物种嫁接细胞连通，并通过对番茄接穗进行不同生长素处理，在番茄嫁接区域诱导出不定根。通过形态学与分子生物学分析，证明了嫁接介导的枸杞与番茄细胞之间发生了水平基因转移，诱导的不定根为枸杞水平基因转移到番茄的转化
根。本发明建立了枸杞基因向番茄高效转移的技术体系并获得了转化根，实现了草本植物与木本植物遗传资源的优势互补。具有转化根系的番茄植株根系的活力好，植株生长势强，生长周期长，番茄的产量、品质、抗性等都得到了提升。
6.本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：
7.一种枸杞与番茄水平基因转移体系建立及转化根获得的方法，包括如下步骤：
8.(1)选取木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗作为砧木；木质素含量低于500s/g；
9.(2)选取生长至3叶1心番茄苗，将番茄苗距子叶0.5cm处的上胚轴切下，利用外源生长素进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与枸杞砧木进行嫁接建立枸杞与番茄高效嫁接体系，诱导番茄嫁接区域再生不定根。
10.(3)观察番茄嫁接区域不定根的起源、出根后的形态，并提取番茄嫁接区域不定根的基因组dna，若再生的不定根的根系分级明显且检测到枸杞的dna片段则说明获得转化根。
11.进一步地，番茄苗、木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗培育的方法为：将培养基内无菌枸杞苗移至基质内进行培养10-20天，前3d保持100％的湿度，后与播种后的番茄同于温度22℃～26℃，光照强度100～120μmol
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，光照时间14h/d，相对湿度85％环境培养。
12.进一步地，枸杞木质素含量的测定方法为：选取在基质内培养一定天数长势一致的枸杞，截取从底端向上7.5cm-8.5cm的位置，总共1cm的茎段，并除去叶片，将茎段放入15ml离心管，并开盖于85℃过夜烘干，至恒重后研磨成粉末，于40目过滤网过筛，采用乙酰溴法测定枸杞茎段中木质素含量，用分光光度计在波长280nm测定样品吸光度，通过回归曲线计算木质素含量。
13.进一步地，所述步骤(1)中，砧木的建立方法具体为：将木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗从顶端向下5cm位置平切，沿平切后横截面的中心线向下切0.5-1.0cm，得到砧木。
14.进一步地，嫁接的方法具体为：将切好的番茄接穗插入枸杞0.5-1.0cm的劈口中进行嫁接，使番茄接穗与砧木充分接触，从而建立枸杞与番茄高效嫁接体系。
15.进一步地，所述步骤(2)中，利用的外源生长素为2.0mg/l naa。
16.进一步地，所述步骤(3)中，提取番茄嫁接区域不定根基因组dna的方法为：改良ctab法。
17.进一步地，所述步骤(3)中，判断番茄嫁接区域不定根是否检测到枸杞的dna片段的方法为：
18.提取番茄嫁接区域不定根基因组dna，进行基因组重测序；进行生物信息学分析，利用linux cat命令将枸杞基因组与番茄基因组进行连接，将与番茄比对上的reads去除，得到剩余reads与枸杞基因组进行映射，将有读序映射区间的序列提取出来，得到多条相应的dna片段；根据映射到的序列设计引物，进行pcr验证；从而确定番茄嫁接组织部位不定根中含有此段枸杞dna片段；将番茄基因组与映射到的序列混合作为参考基因组，寻找一端比对到番茄基因组一端比对到目标序列的reads；将其中没比对上枸杞的一段截下来形成短片段，blast到参考基因组，并保留blast结果显示只能匹配上番茄的短片段，进行筛选；若筛选得到则说明再生的不定根检测到枸杞的dna片段。
19.进一步地，不定根的基因组重测序的方法为：按照常规基因组二代测序技术进行基因组的重测序，dna建库长度200-300bp，每个reads长度150bp，至少得到24g的数据(番茄基因组总量为800m左右，24g为基因组总量的30倍)。
20.本发明利用的技术涉及rna提取、转录组测序、dna提取、pcr反应、基因组重测序，都是目前分子生物学的成熟技术；同时，bwa、blast等软件的应用可以较为快速方便的得到想要的分析结果。
21.与现有技术相比，本发明至少有以下技术优势：
22.(1)本发明的创新之处首先通过降低木质素的含量，消除远缘细胞之间的隔离层，第一次实现了远缘嫁接属间的，草本与木本植物之间的高效嫁接；
23.(2)本发明通过对番茄接穗进行不同生长素处理，番茄嫁接区域诱导出不定根，通过pcr鉴定，不定根为枸杞基因水平转移的番茄的转化根。
24.(3)本发明的物种枸杞与番茄均为茄科植物，两个物种间存在一些同源序列，后续分析时可能存在一定的困难；本发明的巧妙之处在于将枸杞基因组与番茄基因组利用linux cat命令进行合并，将重测序数据中只要含有番茄的reads就被去除，巧妙的将枸杞与番茄的同源序列去除，剩余数据中只含有枸杞的特异reads及一些比对不上枸杞基因组的reads，将剩余数据与枸杞基因组进行映射，找到与枸杞基因组完全映射到的多条序列；后续定位将多条序列文件与番茄基因组文件合并作为新的参考基因组，并且利用bwa软件寻找一端比对到番茄基因组一端比对到目标reads的重测序序列，并用blast软件进一步筛选，只保留短序列比对上番茄的，此方法具有较强的创新性，对于存在同源序列的物种具有广泛的适用性，属于生物信息学中的个性化分析。
25.综上所述，本发明通过降低枸杞细胞的木质素含量，消除远缘细胞之间隔离层使两个物种嫁接细胞连通，并对番茄接穗进行不同生长素处理，在番茄嫁接组织部位诱导出不定根。通过形态学与分子生物学研究分析，证明了嫁接介导的枸杞与番茄细胞之间发生了水平基因转移，诱导的不定根为枸杞水平基因转移到番茄的转化根。本发明建立了枸杞基因向番茄高效转移的技术体系并获得了转化根，实现了草本植物与木本植物遗传资源的优势互补。
附图说明
26.下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。
27.图1枸杞与番茄水平基因转移体系建立及转化根获得的示意图，其中：a是番茄实生苗；b是番茄接穗；c是基质培养的枸杞苗；d是枸杞砧木；e是番茄与枸杞嫁接后获得的转化植株；f是转化根系的获得。
28.图2是番茄嫁接区域再生不定根的起源图，其中，sc为番茄接穗，st为枸杞砧木。
29.图3是枸杞、番茄嫁接区域再生的不定根和番茄扦插后再生的不定根根系的形态对比，其中：a是枸杞不定根；b是番茄嫁接区域再生的不定根；c是番茄扦插后再生的不定根。
30.图4是嫁接后3个半月的植株生长势，其中：a是嫁接植株；b是转化植株；c是自嫁接植株。
31.图5是3个转化植株样品dna提取后电泳图。
32.表过滤后的重测序数据中与枸杞基因组映射到的216条序列信息。
33.图6是216条序列的pcr验证；其中：goji代表枸杞，cr代表番茄，编号
“‑”
前面的1，2，3代表的是三个转化根样品，
“‑”
后面的1，2，3代表的是三个生物学重复。
34.图7分析得到的nc_015444.3号染色体插入位点信息。
35.图8插入位点pcr验证；其中：a代表番茄cr，b代表转化根样品。
36.图9是枸杞嫁接番茄之后嫁接结合部位的徒手切片，其中：a是10d的枸杞作为砧木、b是20d的枸杞作为砧木、c是30d的枸杞作为砧木。
具体实施方式
37.本发明提供了一种枸杞与番茄水平基因转移体系建立及转化根获得的方法，如图1所示，包括以下步骤：
38.(1)选取木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗作为砧木；
39.(2)选取生长至3叶1心番茄苗，将番茄苗距子叶0.5cm处的上胚轴切下，利用外源生长素进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与枸杞砧木进行嫁接建立枸杞与番茄高效嫁接体系，诱导番茄嫁接区域再生不定根。
40.(3)观察番茄嫁接区域不定根的起源、出根后的形态，并提取观察番茄嫁接区域不定根基因组dna，若再生的不定根的根系分级明显且检测到枸杞的dna片段则说明获得转化根。
41.下面结合实施例对本发明进一步说明。
42.实施例1
43.(1)培育黑果枸杞与番茄cr细胞：通过调控黑果枸杞细胞状态，将培养基内无菌黑果枸杞苗移至基质内进行培养10d，前3d保持100％的湿度，后与播种后的番茄cr同于温度22℃～26℃，光照强度100～120μmol
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，光照时间14h/d，相对湿度85％环境培养。
44.(2)测定黑果枸杞茎段木质素含量：选取在基质内培养10d长势一致的黑果枸杞，并截取从底端向上7.5cm-8.5cm的位置，总共1cm的茎段，并除去叶片，将茎段放入15ml离心管，并开盖于85℃过夜烘干，至恒重后研磨成粉末，于40目过滤网过筛，采用乙酰溴法测定枸杞茎段中木质素含量，用分光光度计在波长280nm测定样品吸光度，通过回归曲线计算木质素含量。
45.(3)获取黑果枸杞茎段转录组数据：利用trizol试剂提取枸杞10d相应茎段的总rna，通过oligo(dt)磁珠富集带有polya尾的mrna，以片段化的mrna为模板，随机寡核苷酸为引物合成第一链cdna，后以dntps为原料合成cdna第二条链；纯化后的双链cdna经过末端修复、加a尾并连接测序接头，用ampure xp beads筛选250-300bp左右的cdna，进行pcr扩增并再次使用ampure xp beads纯化pcr产物，最终获得文库；文库构建完成后，先使用qubit2.0 fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/μl，随后使用agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，qrt-pcr对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nm)，以保证文库质量。
46.(4)建立黑果枸杞与番茄cr高效嫁接体系：选取10d的枸杞苗从顶端向下5cm位置平切，沿平切后横截面的中心线向下切0.5
ꢀ‑
1.0cm，作为嫁接砧木。待番茄cr生长至3叶1
心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄cr上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗；将切好的番茄cr接穗插入枸杞0.5-1.0cm的劈口中进行嫁接，使番茄接穗与砧木充分接触，从而建立黑果枸杞与番茄cr高效嫁接体系。
47.实施例2
48.该实施例不一样的地方在于：将培养基内无菌黑果枸杞苗移至基质内进行培养20d，木质素测定及转录组测定选取的枸杞茎段均为20d，其他操作步骤均与所述实施例1相同，具体为：
49.(1)培育黑果枸杞与番茄cr细胞：通过调控黑果枸杞细胞状态，将培养基内无菌黑果枸杞苗移至基质内进行培养10d，前3d保持100％的湿度，后与播种后的番茄cr同于温度22℃～26℃，光照强度100～120μmol
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，光照时间14h/d，相对湿度85％环境培养。
50.(2)测定黑果枸杞茎段木质素含量：选取在基质内培养20d长势一致的黑果枸杞，并截取从底端向上7.5cm-8.5cm的位置，总共1cm的茎段，并除去叶片，将茎段放入15ml离心管，并开盖于85℃过夜烘干，至恒重后研磨成粉末，于40目过滤网过筛，采用乙酰溴法测定枸杞茎段中木质素含量，用分光光度计在波长280nm测定样品吸光度，通过回归曲线计算木质素含量。
51.(3)获取黑果枸杞茎段转录组数据：利用trizol试剂提取枸杞20d相应茎段的总rna，通过oligo(dt)磁珠富集带有polya尾的mrna，以片段化的mrna为模板，随机寡核苷酸为引物合成第一链cdna，后以dntps为原料合成cdna第二条链；纯化后的双链cdna经过末端修复、加a尾并连接测序接头，用ampure xp beads筛选250-300bp左右的cdna，进行pcr扩增并再次使用ampure xp beads纯化pcr产物，最终获得文库；文库构建完成后，先使用qubit2.0 fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/μl，随后使用agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，qrt-pcr对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nm)，以保证文库质量。
52.(4)建立黑果枸杞与番茄cr高效嫁接体系：选取20d的枸杞苗从顶端向下5cm位置平切，沿平切后横截面的中心线向下切0.5
ꢀ‑
1.0cm，作为嫁接砧木。待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄cr上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗；将切好的番茄cr接穗插入枸杞0.5-1.0cm的劈口中进行嫁接，使番茄接穗与砧木充分接触，从而建立黑果枸杞与番茄cr高效嫁接体系。
53.实施例3
54.该实施例不一样的地方在于：将培养基内无菌黑果枸杞苗移至基质内进行培养30d，木质素测定及转录组测定选取的枸杞茎段均为30d，其他操作步骤均与所述实施例1相同，具体为：
55.(1)培育黑果枸杞与番茄cr细胞：通过调控黑果枸杞细胞状态，将培养基内无菌黑果枸杞苗移至基质内进行培养10d，前3d保持100％的湿度，后与播种后的番茄cr同于温度22℃～26℃，光照强度100～120μmol
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，光照时间14h/d，相对湿度85％环境培养。
56.(2)测定黑果枸杞茎段木质素含量：选取在基质内培养30d长势一致的黑果枸杞，并截取从底端向上7.5cm-8.5cm的位置，总共1cm的茎段，并除去叶片，将茎段放入15ml离心管，并开盖于85℃过夜烘干，至恒重后研磨成粉末，于40目过滤网过筛，采用乙酰溴法测定枸杞茎段中木质素含量，用分光光度计在波长280nm测定样品吸光度，通过回归曲线计算木
质素含量。
57.(3)获取黑果枸杞茎段转录组数据：利用trizol试剂提取枸杞30d相应茎段的总rna，通过oligo(dt)磁珠富集带有polya尾的mrna，以片段化的mrna为模板，随机寡核苷酸为引物合成第一链cdna，后以dntps为原料合成cdna第二条链；纯化后的双链cdna经过末端修复、加a尾并连接测序接头，用ampure xp beads筛选250-300bp左右的cdna，进行pcr扩增并再次使用ampure xp beads纯化pcr产物，最终获得文库；文库构建完成后，先使用qubit2.0 fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/μl，随后使用agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，qrt-pcr对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nm)，以保证文库质量。
58.(4)建立黑果枸杞与番茄cr高效嫁接体系：选取30d的枸杞苗从顶端向下5cm位置平切，沿平切后横截面的中心线向下切0.5
ꢀ‑
1.0cm，作为嫁接砧木。待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄cr上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗；将切好的番茄cr接穗插入枸杞0.5-1.0cm的劈口中进行嫁接，使番茄接穗与砧木充分接触，从而建立黑果枸杞与番茄cr高效嫁接体系。
59.以上实施例1-3中均为3个黑果枸杞茎段混样，3次生物学重复，分析并观察木质素含
60.量、嫁接10d后新叶展开的频率以及转录组数据，统计结果如下：
61.表1木质素含量
[0062][0063]
表2嫁接10d后新叶展开的频率
[0064][0065]
表3转录组数据
[0066][0067]
[0068]
由上表1、表2、表3可知，黑果枸杞茎段的木质素含量对嫁接体的愈合影响很大。由上表可知，通过对10d、20d和30d黑果枸杞茎段木质素含量、嫁接后10d嫁接体新叶展开的频率及细胞壁厚度分析，筛选到了细胞壁较薄、木质素含量低且适于嫁接的黑果枸杞砧木培养天数为10d，同时由于20d的黑果枸杞作为砧木进行嫁接时在嫁接后10d嫁接体也有部分新叶展开，因此，进一步分析了枸杞10d和20d的黑果茎段转录组数据，筛选到4个与细胞壁合成相关的4个基因，其中这4个基因的序列为：》transcript_hq_goji_transcript39652/f3p0/1243、》transcript_hq_goji_transcript9772/f5p0/3864、》transcript_hq_goji_transcript37980/f2p0/1623、》transcript_hq_goji_transcript38631/f2p0/1531。发现20d时这4个基因显著下调，10d时细胞壁合成基因大量表达，有助于嫁接愈合的发生，与嫁接成活率密切相关，因此选择以10d的黑果枸杞为砧木、番茄cr为接穗进行嫁接，建立了黑果枸杞与番茄cr高效嫁接体系。图9分别是10d、20d和30d的枸杞嫁接番茄之后嫁接结合部位的徒手切片，10d基本没有隔离层、20d隔离层不明显，30d有一条明显褐黄色的隔离层，进一步说明了10d枸杞细胞更有助于嫁接愈合的发生，消除了两个远缘细胞之间的隔离层。
[0069]
实施例4
[0070]
待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用外源生长素naa 2.0mg/l进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的黑果枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0071]
实施例5
[0072]
该实施例不一样的地方在于：利用的外源生长素naa浓度为0mg/l，其他操作步骤均与所述实施例4相同，具体为：
[0073]
待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用0mg/l naa(ddh2o)进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的黑果枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0074]
实施例6
[0075]
该实施例不一样的地方在于：利用的外源生长素naa浓度为0.5mg/l，其他操作步骤均与所述实施例4相同，具体为：
[0076]
待番茄cr黑果生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用0.5mg/l naa进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0077]
实施例7
[0078]
该实施例不一样的地方在于：利用的外源生长素naa浓度为1.0mg/l，其他操作步骤均与所述实施例4相同，具体为：
[0079]
待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用1.0mg/l naa进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的黑果枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0080]
实施例8
[0081]
该实施例不一样的地方在于：利用的外源生长素naa浓度为5.0mg/l，其他操作步骤均与所述实施例4相同，具体为：
[0082]
待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用5.0mg/l naa进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的黑果枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0083]
实施例9
[0084]
该实施例不一样的地方在于：利用的外源生长素iba浓度为0.5mg/l，其他操作步骤均与所述实施例4相同，具体为：
[0085]
待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用0.5mg/l iba进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的黑果枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0086]
实施例10
[0087]
该实施例不一样的地方在于：利用的外源生长素iba浓度为1.0mg/l，其他操作步骤均与所述实施例4相同，具体为：
[0088]
待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用1.0mg/l iba进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的黑果枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0089]
实施例11
[0090]
该实施例不一样的地方在于：利用的外源生长素iba浓度为2.0mg/l，其他操作步骤均与所述实施例4相同，具体为：
[0091]
待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用2.0mg/l iba进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的黑果枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0092]
实施例12
[0093]
该实施例不一样的地方在于：利用的外源生长素iba浓度为5.0mg/l，其他操作步骤均与所述实施例4相同，具体为：
[0094]
待番茄cr生长至3叶1心，距子叶0.5cm处将上胚轴切下，利用5.0mg/l iba进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与实施例1获得的黑果枸杞砧木进行嫁接，在番茄嫁接区域诱导出不定根。
[0095]
以上实施例4-12中均为12株，分别观察再生不定根的根数及最大根长并统计如下：
[0096]
表4
[0097][0098]
表5
[0099][0100]
由上表4、表5可知，外源施加生长素对不定根再生有一定的影响，不同浓度、不同种类的生长素对于不定根再生影响不同，实施例4，嫁接后14d再生不定根的个数以及最大根长与实施例5-12相比均为最优。由上表可知，适量外源生长素的施加对于不定根的获得有一定的促进作用。
[0101]
实施例13
[0102]
a、不定根的起源及表型
[0103]
观察番茄cr嫁接区域诱导出不定根的起源(图2)及表型，黑果枸杞不定根、实施例4获得的番茄cr嫁接区域诱导出不定根和番茄cr扦插后再生的不定根根系的形态对比(图3)，可以发现番茄cr嫁接区域诱导出不定根根系分级明显，而黑果枸杞不定根和番茄cr扦插后再生的不定根分级较弱，尤其是番茄cr扦插后再生的不定根各根的粗细近似，丛生如须；而番茄cr嫁接区域诱导出不定根，根系明显粗壮于黑果枸杞和番茄cr扦插后再生的不定根，从表型上看番茄cr嫁接区域诱导出不定根与黑果枸杞不定根、番茄cr扦插后再生的不定根相比具有明显的优势。
[0104]
b、提取基因组dna
[0105]
随机选取实施例4获得的9个植株的番茄cr嫁接区域诱导出不定根，3株混样，三次生物学重复，在嫁接后30d左右，各取100mg根系，经液氮碾磨后，加入含1000μl 2vol％提前配置的65℃预热的ctab提取液和2μlβ-巯基乙醇于2ml的离心管中；65℃水浴30min，每5min摇匀一次；冷却至室温，加入900μl的氯仿：异戊醇＝24：1混合溶液，上下缓慢颠倒离心管100次，使离心管内溶液充分混匀；20℃12000rpm离心10min；取上清，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置30min；4℃13000rpm离心15min，弃去上清；用预冷的75vol％的乙醇洗涤2次dna沉淀，再用无水乙醇清洗1次，晾干沉淀，加入200μl的ddh2o，溶解dna；加入2μl 10mg/ml rnase，37℃水浴30min；加入400μl预冷的无水乙醇，-20℃放置1h；4℃12000rpm离心15min，用预冷的75vol％的乙醇洗涤2次，再用无水乙醇清洗1次，吹干，加入30μl的ddh2o溶解，备用。dna使用nanodrop测定浓度。dna提取结果见图4，根据图4，可知提取的dna结构完好，没有降解，也没有rna污染。
[0106]
c、不定根的基因组重测序：
[0107]
不定根的基因组重测序的方法为：按照常规基因组二代测序技术进行基因组的重测序，dna建库长度200-300bp，每个reads长度150bp，至少得到24g的数据(番茄基因组总量为800m左右，24g为基因组总量的30倍)；
[0108]
d、进行生物信息学分析：
[0109]
利用linux cat命令将枸杞基因组与番茄基因组合并为一个文件作为参考基因
组，将与番茄比对上的reads去除，得到剩余reads与枸杞基因组进行映射，将有读序映射区间的序列提取出来，得到216条相应的dna片段，见表6，序列比对分析软件为bwa(version：0.7.17-r1188)；根据映射到的序列设计引物，进行pcr验证，pcr验证方法为常规pcr方法。根据216条序列中的与番茄基因组弱比对的序列设计引物619-f：cttcctagcgacacagtccc(seq id no.5)，619-r：tggtgcaagggatcgtgaaa(seq id no.6)；426-f：tggcctccaatatgggcatt(seq id no.7)，426-r：gaggaccacactcatggcaa(seq id no.8)；341-f：atacccgtgtgaaatggcct(seq id no.9)，341-r：aatggttgaggtcgctgtcc(seq id no.10)；3个转化植株混样基因组dna为模板，进行pcr，pcr体系为；
[0110]
dna模板1μl上游引物1μl下游引物1μlgreen taq mix12.5μlddh2o9.5μl总体积25μl
[0111]
pcr反应条件为：95℃预变性3min，95℃15s，55℃15s，72℃30s，30个循环，72℃延伸5min。
[0112]
表6 216条序列
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118][0119]
pcr结果见图6，根据该图6可得知枸杞和番茄cr嫁接区域再生的不定根中均含有枸杞的dna片段，而番茄cr中没有，由此证明重测序数据的准确性。
[0120]
将与枸杞基因组映射到的216条序列与番茄基因组利用linux cat命令进行合并作为新的参考基因组，利用bwa软件(version：0.7.17-r1188)寻找一端比对到番茄一端比对到目标序列的reads，选取一端定位到番茄一端定位到目标序列的reads，共预测到枸杞dna片段插入番茄基因组的42936个插入位点，其中，插入基因区有2240个插入位点，位于基因间区共有40696个，插入到启动子区域共有2387个插入位点。利用blast软件进一步筛选共得到44298条一半来源于枸杞一半来源于番茄的reads。
[0121]
根据预测到的枸杞dna片段在番茄基因组上的插入位点，通过筛选，在番茄基因组和转化植株根系基因组上进行pcr验证，验证发现重测序的一条序列》e100041715l1c002r00300424975(seq id no.11)
[0122]
aaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccccatctccattttgtactgagaacttatgagtcaaaaagcttcaaactcaccgttaatggcg，前91bp来源于枸杞，后59bp来源于番茄，定位到了番茄nc_015444.3上的67495142bp-67495200bp处，枸杞的dna片段插入到了番茄的loc101248594基因的外显子区域，并发现在枸杞番茄中可以克隆出该片段，而在番茄中没有番茄基因组上的插入位点信息，结果见图7、图8。
[0123]
步骤4：转化植株模拟寒冷地区环境进行栽培
[0124]
在浙江省杭州市紫金港校区西区人工气候室内模拟夏季寒冷地区的环境条件，选取长势一致的9株有番茄嫁接组织部位不定根的转化植株、9株嫁接的植株以及9株番茄cr自嫁接植株移入人工气候室内进行栽培管理，在嫁接后3个半月，对比转化植株、嫁接植株和自嫁接植株的表型及长势，发现转化植株和自嫁接植株生长势旺盛，显著高于嫁接植株，统计产量发现转化植株的单株产量要高于自嫁接植株，并且显著高于嫁接植株(表7)，并且后续观察到转化植株生长可达10个月有余，生长周期明显长于自嫁接植株(图4)，说明转化植株集合了番茄根系和枸杞根系的优势，具有抗性强、延长根系生长周期等优点。
[0125]
表7产量统计表
[0126][0127]
最后需要说明的是以上举例的番茄与枸杞采用劈接法进行细胞嫁接发生水平基因转移并获得转化根系的这种方式仅仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有其他变形，包括其他茄科植物如辣椒、马铃薯等。

技术特征：
1.枸杞与番茄水平基因转移体系建立及转化根获得的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗作为砧木；(2)选取生长至3叶1心番茄苗，将番茄苗距子叶0.5cm处的上胚轴切下，利用外源生长素进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与枸杞砧木进行嫁接建立枸杞与番茄高效嫁接体系，诱导番茄嫁接区域再生不定根。(3)观察番茄嫁接区域不定根的起源、出根后的形态，并提取番茄嫁接区域不定根的基因组dna，若再生的不定根的根系分级明显且检测到枸杞的dna片段则说明获得转化根。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：番茄苗、木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗培育的方法为：将培养基内无菌枸杞苗移至基质内进行培养10-20天，前3d保持100％的湿度，后与播种后的番茄同于温度22℃～26℃，光照强度100～120μmol
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m-2
·
s-1
，光照时间14h/d，相对湿度85％环境培养。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：枸杞木质素含量的测定方法为：选取在基质内培养一定天数长势一致的枸杞，截取从底端向上7.5cm-8.5cm的位置，总共1cm的茎段，并除去叶片，将茎段放入15ml离心管，并开盖于85℃过夜烘干，至恒重后研磨成粉末，于40目过滤网过筛，采用乙酰溴法测定枸杞茎段中木质素含量，用分光光度计在波长280nm测定样品吸光度，通过回归曲线计算木质素含量。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，砧木的建立方法具体为：将木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗从顶端向下5cm位置平切，沿平切后横截面的中心线向下切0.5-1.0cm，得到砧木。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：嫁接的方法具体为：将切好的番茄接穗插入枸杞0.5-1.0cm的劈口中进行嫁接，使番茄接穗与砧木充分接触，从而建立枸杞与番茄高效嫁接体系。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，利用的外源生长素为2.0mg/l naa。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，提取番茄嫁接区域不定根基因组dna的方法为：改良ctab法。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，判断番茄嫁接区域不定根是否检测到枸杞的dna片段的方法为：提取番茄嫁接区域不定根基因组dna，进行基因组重测序；进行生物信息学分析，利用linux cat命令将枸杞基因组与番茄基因组进行连接，将与番茄比对上的reads去除，得到剩余reads与枸杞基因组进行映射，将有读序映射区间的序列提取出来，得到多条相应的dna片段；根据映射到的序列设计引物，进行pcr验证；从而确定番茄嫁接组织部位不定根中含有此段枸杞dna片段；将番茄基因组与映射到的序列混合作为参考基因组，寻找一端比对到番茄基因组一端比对到目标序列的reads；将其中没比对上枸杞的一段截下来形成短片段，blast到参考基因组，并保留blast结果显示只能匹配上番茄的短片段，进行筛选；若筛选得到则说明再生的不定根检测到枸杞的dna片段。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：不定根的基因组重测序的方法为：按照常
规基因组二代测序技术进行基因组的重测序，dna建库长度200-300bp，每个reads长度150bp，至少得到24g的数据。

技术总结
本发明公开了枸杞与番茄水平基因转移体系建立及转化根获得的方法，以茄科植物番茄和枸杞等为起始材料，通过降低枸杞细胞的木质素含量，消除远缘嫁接细胞之间隔离层，使两个物种嫁接细胞连通，并通过对番茄接穗进行不同生长素处理，在番茄嫁接组织部位诱导出不定根。通过形态学与分子生物学研究分析，证明了嫁接介导的枸杞与番茄细胞之间发生了水平基因转移，诱导的不定根为枸杞水平基因转移到番茄的转化根。本发明建立了枸杞基因向番茄高效转移的技术体系并获得了转化根，实现了草本植物与木本植物遗传资源的优势互补。具有转化根系的番茄植株根系的活力好，植株生长势强，生长周期长。转化根的获得对提升番茄产量、品质、抗性等都具有重要意义。等都具有重要意义。等都具有重要意义。


技术研发人员：陈利萍 张爱珺 袁璐 王挺进 刘柯 杨洋 王瑞婷
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.02.20
技术公布日：2023/7/22