一种拮抗皂荚枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及生防菌剂和应用

1.本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一种拮抗皂荚枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及生防菌剂和应用。


背景技术：

2.皂荚又叫皂角，是豆科皂荚属落叶乔木。皂荚在我国很多省份均有栽植，多在平原、山谷及水沟地带生长，喜光、耐旱，喜湿润的气候，在肥沃的土壤上生长较好。皂荚具有观赏、经济、药用和生态价值。皂荚树势优美，叶、花、果、枝、刺均有一定的观赏价值。皂荚木材坚硬耐腐，可作车辆、家具和工艺品。皂荚种子含有大量半乳甘露聚糖胶，可以用于稳定剂和分散剂的制作，经济价值较高。皂荚树的荚果、种子、刺、枝均可入药，有较高的药用价值。皂荚为生态经济型树种，固氮性好、抗逆性强可作为防护林、退耕林和水土保持林。
3.皂荚枯萎病是影响皂荚生长并严重影响生态环境的常见病害，由病原真菌(thyronectria austroamericana)引起，引起主干及侧枝的枯萎、溃疡、腐烂等多种症状，造成木质部变色、萎蔫、落叶等，发病严重时导致植株死亡。皂荚枯萎病自上世纪40年代在美国被发现，该病害最初报道只有3棵树发病，发生率较低，最后该病原菌在美国很多州被发现引起了人们高度重视。课题组于2019年在雄安新区首次发现该病害，并出现逐年严重的趋势。皂荚枯萎病菌严重影响皂荚的健康生长，预防和控制皂荚枯萎病的发生已经成为维护生态环境的重要任务。国内没有对皂荚枯萎病进行研究，更没有皂荚枯萎病的防治措施相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种拮抗皂荚枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及生防菌剂和应用，所述贝莱斯芽孢杆菌为从健康皂荚组织中分离筛选得到的对皂荚枯萎病具有高效拮抗作用的生防细菌菌株，能够防治皂荚枯萎病，又能促进皂荚生长。
5.本发明提供了一种拮抗皂荚枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)jkz-01，所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的保藏编号为cgmcc no.25290。
6.优选的，所述皂荚枯萎病由皂荚枯萎病菌(thyronectria austroamericana)引起。
7.本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01在制备拮抗皂荚枯萎病的生防菌剂中的应用。
8.本发明还提供了一种拮抗皂荚枯萎病的生防菌剂，所述生防菌剂的有效成分包括上述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的菌体、菌液和菌株培养物中的一种或多种。
9.优选的，所述菌液的制备方法，包括将所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01接种于lb液体培养基上，振荡培养至有效活菌数不低于1
×
108cfu/ml，得所述菌液。
10.优选的，所述振荡培养的温度为28℃，摇床转速为200r
·
min-1
。
11.本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01或上述生防菌剂在促进皂荚生长中
的应用。
12.本发明还提供了一种促进皂荚生长并拮抗皂荚枯萎病的方法，包括以下步骤：在皂荚的根部接种上述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01或上述生防菌剂。
13.优选的，所述促进皂荚生长的指标包括株高、根长、根重、鲜重和地径。
14.优选的，包括在每株皂荚的根部接种贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的有效活菌数不低于70
×
108cfu。
15.有益效果：本发明提供了一种从健康皂荚组织中分离筛选得到的对皂荚枯萎病具有高效拮抗作用的生防细菌菌株，发明人根据形态特征鉴定和16 srdna序列分析，将菌株jkz-01鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，并在实施例中证实了贝莱斯芽孢杆菌jkz-01处理植株能显著提高皂荚的长势，处理后株高增加21.85％，根长增加17.88％，鲜重提高42.43％，根重提高52.10％，且具有较好的枯萎病防治效果，防效可达59.81％。因此所述菌株jkz-01具有拮抗皂荚枯萎病的作用，能够防治皂荚枯萎病，又能促进皂荚生长。
16.生物保藏信息
17.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，菌株编号为jkz-01，于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.25290。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为贝莱斯芽孢杆菌jkz-01在lb平板培养基上的菌落形态图；
20.图2为本发明贝莱斯芽孢杆菌jkz-01基于16srdna序列的系统发育树，其中图中拉丁名后为相应菌株在genbank的编号；
21.图3为本发明贝莱斯芽孢杆菌jkz-01菌液对皂荚枯萎病菌的平板抑制效果图，a为jkz-01菌液对皂荚枯萎病菌的平板抑制效果图；b为皂荚枯萎病菌无菌的空白对照组平板培养图；
22.图4为为本发明贝莱斯芽孢杆菌jkz-01菌液对皂荚枯萎病菌的含发酵滤液平板抑制效果图，a为jkz-01菌液对皂荚枯萎病菌的平板抑制效果图；b为皂荚枯萎病菌无菌的空白对照组平板培养图；
23.图5为为贝莱斯芽孢杆菌jkz-01对皂荚枯萎病的室内防治效果图。
具体实施方式
24.本发明提供了一种拮抗皂荚枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)jkz-01，所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的保藏编号为cgmcc no.25290。
25.本发明所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01由健康皂荚组织中分离筛选得到，在lb培养基上，28℃培养24h，菌落圆形凸起呈微黄色，边缘薄且光滑，培养48h，菌落逐渐变干，表面粘稠；其16srdna序列如seq id no.1所示：tggcggggtgctataatgcagtcgagcggacagatgggagct
tgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaaggtcacagaga。
26.本发明所述皂荚枯萎病优选由皂荚枯萎病菌(thyronectria austroamericana)引起。实施例中通过初筛和复筛，证实jkz-01菌液对皂荚枯萎病菌的平板抑制率达到为79.2％，对皂荚枯萎病菌的抑制作用良好。
27.本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01在制备拮抗皂荚枯萎病的生防菌剂中的应用。
28.本发明在实施例中证实了jkz-01菌液对皂荚枯萎病菌的抑制作用，而后还验证了盆栽苗防治效果，利用贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的菌液处理植株，具有较好的枯萎病防治效果，防效可达59.81％。因此可将其应用于制备拮抗皂荚枯萎病的生防菌剂。
29.本发明还提供了一种拮抗皂荚枯萎病的生防菌剂，所述生防菌剂的有效成分包括上述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的菌体、菌液和菌株培养物中的一种或多种。
30.本发明所述菌液的制备方法，优选包括将所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01接种于lb液体培养基上，振荡培养至有效活菌数不低于1
×
108cfu/ml，得所述菌液。本发明在所述接种前，优选还包括对保存的贝莱斯芽孢杆菌jkz-01进行活化，所述活化优选包括将保存的jkz-01菌株接种到lb平板上，28℃培养2d。本发明在所述活化后，优选选择lb平板上的单菌落接种到lb液体培养基中，在温度为28℃、摇床转速为200r
·
min-1
下发酵24h，得到菌液。本发明所述lb平板和lb液体培养基除含有15g/l的琼脂粉外，其余组分完全相同：以水为溶剂，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l和琼脂粉15g。
31.本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01或上述生防菌剂在促进皂荚生长中的应用。
32.本发明实施例中证实所述jkz-01菌株的菌液不仅具有抑制皂荚枯萎病菌的效果，
还能促进皂荚生长，所述促进皂荚生长的指标包括株高、根长、根重、鲜重和地径。
33.本发明还提供了一种促进皂荚生长并拮抗皂荚枯萎病的方法，包括以下步骤：在皂荚的根部接种上述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01或上述生防菌剂。
34.本发明所述接种优选包括在每株皂荚的根部接种贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的有效活菌数不低于70
×
108cfu，实施例中以菌液为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
35.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种拮抗皂荚枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及生防菌剂和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
36.实施例1
37.1、分离筛选
38.(1)内生细菌分离培养
39.于2021年9月在河北农业大学林学院实验室采用裴淑兰等人的研究方法进行内生细菌的分离。首先将采自雄安新区千年秀林的无病虫危害的皂荚根、茎、叶新鲜组织用无菌水清洗，晾干，切成小块。依次在75％乙醇中浸泡2min，3％次氯酸钠中浸泡30s，75％乙醇中浸泡30s，每次浸泡后均用无菌水冲洗3次去除残留乙醇或次氯酸钠。经表面消毒的皂荚组织放入加有10ml无菌水的灭菌研钵中研磨。吸取匀浆液，稀释成不同浓度后涂布于lb固体培养基上。置于30℃培养箱中培养3-7d。每浓度重复4次。根据菌落特征，采用平板划线法纯化2-3次，获得菌落形态差异明显的菌株。纯化菌株转接于lb斜面培养基，4℃保存备用。
40.(2)拮抗菌的初筛
41.参照李枢妍等人研究方法，采用平板对峙培养法进行拮抗菌初筛。取100μl皂荚内生细菌菌种分别涂布于lb培养基上培养，置于28℃培养箱中培养48h。用灭菌挑针取单菌落转接至lb培养液中(28℃，200r
·
min-1
)振荡培养24h，得到细菌发酵液。使用内径为8mm打孔器打取皂荚枯萎病病原菌活化菌落边缘菌饼，转接到空白pda平板中心，在距平板中心20mm位置固定一块无菌滤纸片(6mm)，滴加10μl内生细菌发酵液。以滴加清水作为对照，水平重复4次。置于28℃恒温培养至对照平板菌落长到适当大小时，测量菌落直径，计算抑菌率，选取抑菌效果好的菌株进行拮抗菌的复筛。
42.其中皂荚枯萎病病原t.austroamericana由pda平板培养备用，具体操作：将病原菌接种于马铃薯葡萄糖培养基(pda：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000ml)平板上，30℃培养7d。
43.抑制率＝[(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/(对照病原菌菌落直径-菌饼直径)]x100％
[0044]
通过平板对峙培养法初筛，从31株细菌中筛选出了28株对皂荚枯萎病病原菌有抑制作用的拮抗菌。其中，抑制率大于65％的拮抗菌共9株。jkz-01抑菌效果最好，对皂荚枯萎病抑制率为79.20％(表1和图3)。
[0045]
表3-10拮抗菌初筛结果
[0046][0047]
注：对初筛抑制率大于65％的拮抗菌进行单因素方差分析，同列不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0048]
(3)拮抗菌的复筛
[0049]
参照豆雅楠研究方法，使用含发酵滤液平板进行拮抗菌复筛，将抑菌效果好的细菌菌株接种于lb培养液中(28℃，180r
·
min-1
)振荡培养24h。将待测发酵液12000r
·
min-1
离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜4次即得发酵滤液。将pda培养基冷却至40℃时，与制备好的发酵滤液置于250ml三角瓶中将它们混匀，制备含发酵滤液平板，培养皿中倒入适量的混液。将直径8mm的病原菌菌饼接于冷却凝固的平板中央，28℃倒置恒温培养。每处理重复4次，以加入无菌水的pda培养基为对照。待对照试验平板上的菌落长到适当大小时，采用十字交叉法测量菌落直径，按照上述中的公式计算拮抗菌抑菌率。筛选出对皂荚枯萎病病原菌抑制作用最好的菌株。
[0050]
采用含发酵滤液的平板对抑制率大于65％的9株拮抗菌进行复筛。结果显示，菌株jkz-01对皂荚枯萎病病原菌的抑菌率明显高于其他菌株，其抑制率达到72.45％，表明jkz-01菌株发酵液对皂荚枯萎病病原菌的生长有较好的抑制作用(表2，图4)。结合初筛和复筛结果，将拮抗株jkz-01用于后续研究。
[0051]
表2拮抗菌复筛结果
01的发酵液，贝莱斯芽孢杆菌的jkz-01的有效活菌数优选为1
×
108cfu/ml。
[0067]
实施例3
[0068]
贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的室内促生及防治试验
[0069]
1.试验制剂制备
[0070]
按实施例2的方法制备贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的发酵液。
[0071]
皂荚枯萎病病原菌孢子悬浮液制备：将保存的病原菌在pda培养基上培养，待其菌落长到合适大小将菌落边缘的菌丝块置于pda液体培养基中，在摇床(25℃、180r
·
min-1
)上震荡培养3-4d，配制成浓度为1
×
107cfu/ml病原菌孢悬液。
[0072]
2.试验用苗
[0073]
试验皂荚幼苗培养40d，苗高8cm左右。
[0074]
3.枯萎病病情分级标准参照表3；
[0075]
病情指数＝[σ(各级病株数
×
相对级代表数值)/(调查总株数
×
最高级)]
×
100
[0076]
防效＝[(对照病情指数-调查病情指数)/对照组病情指数]
×
100％
[0077]
表3皂荚枯萎病室内分级标准
[0078][0079]
4.试验方法
[0080]
选取健康、大小一致的皂荚盆栽实生苗，统计苗高、叶片数、新梢量。统计结束后接种贝莱斯芽孢杆菌jkz-01发酵液和病原菌孢悬液。实验分为4组，即t1、t2、t3、t4组，每组30盆，总计120盆。其中：
[0081]
t1组(ck)：清水对照组，只加清水作为空白对照；
[0082]
t2组(ta)：病原菌组，通过灌根添加70ml病原菌孢悬液，再加入等量清水；
[0083]
t3组(ta+lb)：lb组，通过灌根添加70ml病原菌孢悬液，再加入等量lb培养液；
[0084]
t4组(ta+jkz-01)：拮抗菌组，通过灌根添加70ml病原菌孢悬液，再加入等量浓度为1
×
108cfu/ml筛选到的菌株发酵液。
[0085]
接种后定期浇水、记录幼苗的生长情况。40d后调查幼苗的发病情况，测量各组植株株高、新梢、根长、鲜重、根重、地径等指标，并根据皂荚盆栽幼苗发病情况制定分级标准作为调查依据(表3)，根据公式计算病情指数和防效。
[0086]
5.试验结果
[0087]
结果如表4～5和图5所示，贝莱斯芽孢杆菌jkz-01处理植株能显著提高皂荚的长势，处理后株高增加21.85％，根长增加17.88％，鲜重提高42.43％，根重提高52.10％，且具有较好的枯萎病防治效果，防效可达59.81％。
[0088]
表4贝莱斯芽孢杆菌jkz-01对皂荚枯萎病的促生效果
[0089][0090][0091]
表5贝莱斯芽孢杆菌jkz-01对皂荚枯萎病的室内防治效果
[0092]
处理病情指数防效(％)t10-t246.60-t339.17-t415.7459.81
[0093]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种拮抗皂荚枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)jkz-01，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的保藏编号为cgmccno.25290。2.根据权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01，其特征在于，所述皂荚枯萎病由皂荚枯萎病菌(thyronectriaaustroamericana)引起。3.权利要求1或2所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01在制备拮抗皂荚枯萎病的生防菌剂中的应用。4.一种拮抗皂荚枯萎病的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的有效成分包括权利要求1或2所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的菌体、菌液和菌株培养物中的一种或多种。5.根据权利要求4所述生防菌剂，其特征在于，所述菌液的制备方法，包括将所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01接种于lb液体培养基上，振荡培养至有效活菌数不低于1
×
108cfu/ml，得所述菌液。6.根据权利要求5所述生防菌剂，其特征在于，所述振荡培养的温度为28℃，摇床转速为200r
·
min-1
。7.权利要求1或2所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01或权利要求4～6任一项所述生防菌剂在促进皂荚生长中的应用。8.一种促进皂荚生长并拮抗皂荚枯萎病的方法，其特征在于，包括以下步骤：在皂荚的根部接种权利要求1或2所述贝莱斯芽孢杆菌jkz-01或权利要求4～6任一项所述生防菌剂。9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述促进皂荚生长的指标包括株高、根长、根重、鲜重和地径。10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，包括在每株皂荚的根部接种贝莱斯芽孢杆菌jkz-01的有效活菌数不低于70
×
108cfu。

技术总结
本发明提供了一种拮抗皂荚枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及生防菌剂和应用，涉及功能微生物技术领域。本发明提供了所述贝莱斯芽孢杆菌JKZ-01已完成保藏，保藏编号为CGMCCNo.25290。本发明所述贝莱斯芽孢杆菌JKZ-01具有拮抗皂荚枯萎病的作用，能够防治皂荚枯萎病，又能促进皂荚生长，可应用于制备抗生菌剂，用以防治皂荚枯萎病，并促进皂荚生长。并促进皂荚生长。并促进皂荚生长。


技术研发人员：李会平 魏步飞 朱会营 苏筱雨 曾健勇 王华玲 孙彤蕾 张凤娟
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2023.02.15
技术公布日：2023/7/22