具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽及其制备方法和应用

1.本发明涉及多肽技术领域，具体涉及一种具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.非酒精性脂肪性肝病(nafld)是一种非常普遍的慢性肝病，可增加心血管疾病的风险，并可发展为各种慢性肝病，如脂肪性肝炎和肝硬化。在全球范围内，由于久坐不动的生活方式、西方饮食的全球化以及过去饥荒地区食品供应的改善，nafld的患病率正在上升，这些都日益威胁着人类健康。目前治疗nafld的方式主要采用保护肝细胞药物，如熊去氧胆酸等，护肝去脂药主要是针对体内脂肪的吸收、代谢起着重要作用，起到治疗脂肪肝的作用。然而该类药物具有一定的副作用，服用熊去氧胆酸胶囊后，会引起患者稀便或腹泻，当治疗原发性胆汁性肝硬化时，患者可能会发生严重的右上腹疼痛。然而食品功能性物质，例如蛋白肽对非酒精性脂肪肝的缓解或预防的应用时却未见异常反应。
3.多肽是一类化合物，其在体内与目标结合具有更强的特异性，使其生物活性更高效和更好的适用性，且其无关的副作用也更有限。然而活性肽作为营养改善剂或功能性食品，很容易在受胃肠道中快速释放而造成浪费。本专利多肽制备的技术方案采用的碱性蛋白酶与胰蛋白酶双酶体系，提高了目标多肽的生产率。此外，由于引入胰蛋白酶的筛选，目标多肽还具有胃肠道消化抵抗的优势，其原因在于贻贝蛋白的酶切位点已经预先被胰蛋白酶破坏。本专利采用羟甲基纤维素溶、麦芽糊精、三聚丙三醇、酪蛋白等成分构建了双层微胶囊结构，该结构的组分未见报道或使用，具有创新性、安全性、稳定性的优势。将目标多提包裹在该双层微胶囊结构下，有效的延长了功能肽在模拟胃肠道环境下的释放时间，显著提高了吸收利用度。


技术实现要素：

4.为开发贻贝蛋白资源，本发明的目的在于：提供具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽及其制备方法和应用，即具有非酒精性脂肪肝缓解功效的贻贝多肽以及含有贻贝多肽粉的多肽微胶囊制备方法；贻贝多肽和多肽微胶囊在制备非酒精性脂肪肝缓解口服液上的应用。
5.该功能肽易于吸收，制备方法简单；制备出来的肽通过双层包覆制得功能肽微胶囊，功能肽微胶囊可以调控肽在胃肠道中的的释放速率，达到缓释效果，实现功能肽在肠道的释放和吸收，来提升功能肽的稳定性与利用率。
6.本发明提供如下的技术方案：
7.具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽，其特征在于，所述贻贝多肽dadplvilg，其hplc-ms检测的分子量为911.0[m-h]-；
[0008]
其结构如下所示：
[0009][0010]
所述的贻贝多肽的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
(1)将贻贝去壳后取全组织，然后清洗、匀浆；
[0012]
(2)向贻贝的匀浆液中加入1.5％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶酶解和1.5％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的碱性蛋白酶双酶酶解；
[0013]
(3)将步骤(2)最终酶解液80～120℃加热5～15min(最优选100℃加热10min)灭酶处理，再采用4000～8000g/min离心10～20min后取上清液；
[0014]
(4)过滤步骤(3)所得的上清液采用超滤膜截留分子量1000da的分子，冻干后得多肽粉；
[0015]
(5)将多肽粉分离纯化后得到具有肽序列dadplvilg含量最高的组分的到贻贝多肽。
[0016]
(6)将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊。
[0017]
步骤(2)中加入胰蛋白酶酶解时，保持匀浆液的ph值为7.2～8.5，酶解时间2～4小时，酶解温度36～38℃，胰蛋白酶加入量为匀浆液中蛋白质量的2.5～3.5％，胰蛋白酶的活力10000u/mg，碱性蛋白酶活力为20000u/mg。
[0018]
步骤(6)中，所述功能肽微胶囊的制备过程为：将羟甲基纤维素溶于水中，加入麦芽糊精混合均匀，加入三聚丙三醇，继续加入酪蛋白和二月桂酸二丁基锡，升温至50-55℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌并均质，所得溶液进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用高压微射流均质机进行乳化均质处理，单层包覆微胶囊与壁材的质量比为4：1～8：1，采用喷雾干燥得到功能肽微胶囊。
[0019]
壁材组分及质量比：海藻胶、桃胶、紫苏籽油、桂花精油、番茄红素、柠檬酸钠、赤藓糖醇及水＝140～155g；195～200g；250～265g；132～135g；25～27g；20～25g；1～2g；30～40g。
[0020]
本发明的功能肽微胶囊通过内部单层与壁材共同包覆来实现其被肠道中酶系分解，且其内部的功能肽缓慢释放，有利于功能肽在肠道的充分吸收，不会单次释放过多的功能肽而造成其降解后吸收。该壁材可充分保证功能肽在口腔及胃中的稳定性，防止被胃蛋白酶等分解破环其活性结构而造成功能肽过早释放，降低靶器官吸收的利用率。
[0021]
技术方案中单层包覆微胶囊中单层壳层的作用主要是对包覆的功能肽粉起到缓释且均匀释放的作用，因为单层包覆微胶囊壳层中含有麦芽糊精及酪蛋白，而肠道中含有麦芽糊精酶与胰蛋白酶，当功能肽微胶囊服用后进入肠道，其包裹壁材在微碱性环境中降解，使得单层包覆微胶囊暴露。单层包覆微胶囊小肠液下，由于麦芽糊精的亲水性强，而酪蛋白具有疏水性，所以麦芽糊精会首先被麦芽糊精酶降解使得外壳层形成孔洞，包裹的功
能肽会释放到肠道中；当功能肽微胶囊中的部分功能肽释放之后，肠液会通过小孔进入到功能肽微胶囊内部，单层包覆微胶囊的单层壳层会受到胰蛋白酶的内外渗透并酶解，酪蛋白被酶解消化之后会形成残破的片段，由于酪蛋白在单层壳层中比例很高，当其被部分消化后，单层壳层结构空洞逐渐变大直至其结构坍塌，最后导致剩余功能肽逐渐释放殆尽。该方法构建的微胶囊结构使其包裹的功能肽得到缓释，避免了快速释放造成的为充分吸收利用，达到了高效的利用率。
[0022]
单层壳层构建的反应过程为：本发明采用含有羟基的羟甲基纤维素作为包覆层主体与三聚丙三醇混合，二者在二月桂酸二丁基锡催化作用下发生酯化反应，进一步发生聚合反应，形成单层包覆微胶囊的壳层，二者在酯化反应与聚合反应的过程中，所形成酯化产物与聚合产物同时与酪蛋白表面的氨基及麦芽糊精表面的羟基进行反应，最终羟甲基纤维素聚合产物与酪蛋白、麦芽糊精形成一个结构完整，包裹性能与均匀性好的包覆壳层。
[0023]
作为优选，壁材组分及质量比：海藻胶、桃胶、紫苏籽油、桂花精油、番茄红素、柠檬酸钠、赤藓糖醇及水＝140～155g；195～200g；250～265g；132～135g；25～27g；20～25g；1～2g；30～40g。
[0024]
因此，本发明具有如下有益效果：
[0025]
(1)本发明通过体双蛋白酶酶解工艺，提高了目标多肽的产量，同时还具有对胃肠道酶消化的抵抗作用，在功能肽的制备高效优质的基础上保证了其在改善非酒精性脂肪肝症状的功效；
[0026]
(2)本发明采用的双层壁材可在胃肠道中精准降解，并选用材料无毒副作用，是一种理想的双层易降解、可释放结构。
[0027]
(3)通过制备功能肽微胶囊，采用双层材料的包覆，来保证功能肽在肠道中缓释，使功能肽的释放时间增长，最大限度的提高功能肽能够被吸收利用度。
[0028]
本发明利用胃肠道同源蛋白酶水解贻贝蛋白，获得具有非酒精性脂肪肝缓解功效的多肽，保留了更好的原始完整性。
附图说明
[0029]
图1为多肽分离鉴定的lc-ms谱图，(a)液相图谱，(b)质谱图；
[0030]
图2为多肽结构式；
[0031]
图3为小鼠肝脏tg含量；
[0032]
图4为小鼠血清tg含量；
[0033]
图5为小鼠肝脏mda含量。
具体实施方式
[0034]
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
[0035]
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
[0036]
1.贻贝多肽的制备方法包括以下步骤
[0037]
(1)将贻贝去壳后取全组织，然后清洗、匀浆；
[0038]
(2)向贻贝的匀浆液中先加入2％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶
酶解，再加入3％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶酶解；
[0039]
(3)将步骤(2)酶解后的酶解液6000g/min离心15min后取上清液；
[0040]
(4)过滤步骤(3)所得的上清液采用超滤膜截留分子量1000da的分子，冻干后得多肽粉；
[0041]
(5)将多肽粉分离组分后得到贻贝多肽。
[0042]
上述步骤(2)中加入胰蛋白酶酶解时，保持匀浆液的ph值为7.2～8.5，酶解时间2～4小时，酶解温度36～38℃，胰蛋白酶的活力10000u/mg，碱性蛋白酶活力为20000u/mg。
[0043]
功能肽微胶囊的制备过程为：将羟甲基纤维素溶于水中，加入麦芽糊精混合均匀，三聚丙三醇，继续加入酪蛋白和二月桂酸二丁基锡，升温至50-55℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌并均质，所得溶液进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用高压微射流均质机进行乳化均质处理，单层包覆微胶囊与壁材的质量比为4：1～8：1，采用喷雾干燥得到功能肽微胶囊。
[0044]
非酒精性脂肪肝缓解的功能肽微胶囊的壁材组分及质量比为：海藻胶、桃胶、紫苏籽油、桂花精油、番茄红素、柠檬酸钠、赤藓糖醇及水＝140～155g；195～200g；250～265g；132～135g；25～27g；20～25g；1～2g；30～40g。
[0045]
实施例1
[0046]
具有非酒精性脂肪肝缓解功效的贻贝多肽，经以下过程制成：
[0047]
1.贻贝多肽的制备方法包括以下步骤
[0048]
(1)将贻贝去壳后取全组织，然后清洗、匀浆；
[0049]
(2)向贻贝的匀浆液中先加入2％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶酶解，再加入3％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶酶解；
[0050]
(3)将步骤(2)酶解后的酶解液6000g/min离心15min后取上清液；
[0051]
(4)过滤步骤(3)所得的上清液采用超滤膜截留分子量1000da的分子，冻干后得多肽粉；
[0052]
(5)将多肽粉分离组分后得到贻贝多肽。
[0053]
上述步骤(2)中加入胰蛋白酶酶解时，保持匀浆液的ph值为7.5，酶解时间2小时，酶解温度36℃，胰蛋白酶的活力10000u/mg，碱性蛋白酶活力为20000u/mg。
[0054]
功能肽微胶囊的制备过程为：将羟甲基纤维素溶于水中，加入麦芽糊精混合均匀，三聚丙三醇，继续加入酪蛋白和二月桂酸二丁基锡，升温至50℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌并均质，所得溶液进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用高压微射流均质机进行乳化均质处理，单层包覆微胶囊与壁材的质量比为6：1，采用喷雾干燥得到功能肽微胶囊。
[0055]
非酒精性脂肪肝缓解的功能肽微胶囊的壁材组分及质量比为：海藻胶、桃胶、紫苏籽油、桂花精油、番茄红素、柠檬酸钠、白砂糖及水＝148g；195g；250g；133g；25g；22g；1.5g；35g。
[0056]
实施例2
[0057]
贻贝多肽的制备方法包括以下步骤
[0058]
(1)将贻贝去壳后取全组织，然后清洗、匀浆；
[0059]
(2)向贻贝的匀浆液中先加入3％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶
酶解，再加入3％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶酶解；
[0060]
(3)将步骤(2)酶解后的酶解液6000g/min离心15min后取上清液；
[0061]
(4)过滤步骤(3)所得的上清液采用超滤膜截留分子量1000da的分子，冻干后得多肽粉；
[0062]
(5)将多肽粉分离组分后得到贻贝多肽。
[0063]
上述步骤(2)中加入胰蛋白酶酶解时，保持匀浆液的ph值为8.5，酶解时间4小时，酶解温度36～38℃，，胰蛋白酶的活力10000u/mg，碱性蛋白酶活力为20000u/mg。
[0064]
功能肽微胶囊的制备过程为：将羟甲基纤维素溶于水中，加入麦芽糊精混合均匀，三聚丙三醇，继续加入酪蛋白和二月桂酸二丁基锡，升温至50-55℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌并均质，所得溶液进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用高压微射流均质机进行乳化均质处理，单层包覆微胶囊与壁材的质量比为6：1，采用喷雾干燥得到功能肽微胶囊。
[0065]
非酒精性脂肪肝缓解的功能肽微胶囊的壁材组分及质量比为：海藻胶、桃胶、紫苏籽油、桂花精油、番茄红素、柠檬酸钠、赤藓糖醇及水＝155g；200g；250g；133g；25g；22g；1.5g；35g。
[0066]
实施例3
[0067]
1.贻贝多肽的制备方法包括以下步骤
[0068]
(1)将贻贝去壳后取全组织，然后清洗、匀浆；
[0069]
(2)向贻贝的匀浆液中先加入3％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶酶解，再加入2％质量的(蛋白酶质量：贻贝蛋白质量)的胰蛋白酶酶解；
[0070]
(3)将步骤(2)酶解后的酶解液7000g/min离心15min后取上清液；
[0071]
(4)过滤步骤(3)所得的上清液采用超滤膜截留分子量1000da的分子，冻干后得多肽粉；
[0072]
(5)将多肽粉分离组分后得到贻贝多肽。
[0073]
步骤(2)中加入胰蛋白酶酶解时，保持匀浆液的ph值为8.0，酶解时间3小时，酶解温度38℃，胰蛋白酶的活力10000u/mg，碱性蛋白酶活力为20000u/mg。
[0074]
功能肽微胶囊的制备过程为：将羟甲基纤维素溶于水中，加入麦芽糊精混合均匀，三聚丙三醇，继续加入酪蛋白和二月桂酸二丁基锡，升温至53℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌并均质，所得溶液进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用高压微射流均质机进行乳化均质处理，单层包覆微胶囊与壁材的质量比为5：1，采用喷雾干燥得到功能肽微胶囊。
[0075]
非酒精性脂肪肝缓解的功能肽微胶囊的壁材组分及质量比为：海藻胶、桃胶、紫苏籽油、桂花精油、番茄红素、柠檬酸钠、赤藓糖醇及水＝155g；200g；250g；133g；25g；22g；1.5g；35g。
[0076]
性能测试
[0077]
2、各短肽的非酒精性脂肪肝缓解功效测试。
[0078]
(1)实验动物：本实施例所用的db/db小鼠购自赛业(苏州)生物科技有限公司，所有动物采用高脂高糖高胆固醇饲料(45％脂肪，17％果糖，1.25％胆固醇，tp32003，采购自南通特洛菲饲料科技有限公司)灌胃。空白组采用200μl纯净水灌胃干预；实施例组均采用
200μl的多肽微胶囊乳液灌胃。
[0079]
(2)血清tg检测：小鼠实验毛细管眼眶取血，室温下静置20min，于3000rpm离心15min吸取上层血清，-80℃保存备用。tg试剂盒购自南京建成生物工程研究所，参照试剂盒标准方法检测tg含量。
[0080]
(3)肝脏tg检测：从-80℃取出肝脏组织块称重后，放入液氮迅速冷冻，然后置入含1ml预冷的pbs的匀浆管，自动匀浆器匀浆20s；将匀浆液转入10ml的预冷的玻璃管，2：1的氯仿/甲醇溶液4ml；旋涡混匀器剧烈涡旋充分混匀震荡30s。然后在4℃条件下2000rpm离心30min，将上层水相转移至到新的10ml试管中，重复操作一次；取下层有机相用移液枪吸尽转移到另一只10ml玻璃管中并用氮气吹干，然后加入500μl的3％triton x-100(v/v)溶液，用移液枪反复吹打使其初步溶解，置于恒温摇床55℃振荡，直至脂质完全溶解。肝脏脂质中tg含量测定方法同上。
[0081]
(4)肝脏mda检测：采用sigma公司的mda试剂盒(mo 63103)方法检测mda含量
[0082]
(5)数据分析：采用spss 16.0软件统计分析实验数据，采用t检验分析，多组比较采用单因素方差分析(one-way anova)，采用平均值
±
标准误(mean
±
sem)表示，当p《0.05时具有统计学差异。
[0083]
如图1和图2所示，从图上可以得出通过液相质谱鉴定了多肽dadplvilg的荷质比为911.0[m-h]-。
[0084]
如图3所示，从图上可以得出，三种实施例方法制备的多肽微胶囊可以可以降低小鼠肝脏tg含量。
[0085]
如图4所示，从图上可以得出，三种实施例方法制备的多肽微胶囊可以可以降低小鼠血液tg含量。
[0086]
如图5所示，从图上可以得出，三种实施例方法制备的多肽微胶囊可以可以降低小鼠肝脏mda含量。综上，三种实施例方法制备的多肽微胶囊可以有效缓解小鼠的非酒精性脂肪肝。

技术特征：
1.具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽，其特征在于，为贻贝多肽dadplvilg，其结构如下所示：2.根据权利要求1所述的具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽，其特征在于，所述的贻贝多肽dadplvilg的hplc-ms检测的荷质比为911.0[m-h]-。3.根据权利要求1或2所述的具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将贻贝去壳后取全组织，然后清洗、匀浆，得到贻贝的匀浆液；(2)向贻贝的匀浆液中加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶双酶酶解，得到酶解液；(3)将步骤(2)的酶解液灭酶处理，再采用离心后取上清液；(4)过滤步骤(3)所得的上清液采用超滤膜截留分子量1000da的分子，冻干后得多肽粉；(5)将多肽粉分离纯化后得到贻贝多肽dadplvilg。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶双酶酶解时，保持匀浆液的ph值为7.2～8.5，酶解时间2～4小时，酶解温度36～38℃。5.根据权利要求1所述的具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽在制备缓解非酒精性脂肪肝功能肽微胶囊中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：将贻贝多肽dadplvilg进行双层包覆，得到缓解非酒精性脂肪肝功能肽微胶囊。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，制备缓解非酒精性脂肪肝功能肽微胶囊具体包括：将羟甲基纤维素溶于水中，加入麦芽糊精混合均匀，加入三聚丙三醇，继续加入酪蛋白和二月桂酸二丁基锡，升温至50-55℃反应，反应完毕后加入贻贝多肽dadplvilg功能肽粉，并继续搅拌并均质，所得溶液进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；将壁材各组分混匀，加入单层包覆微胶囊混匀采用高压微射流均质机进行乳化均质处理，单层包覆微胶囊与壁材的质量比为4～8：1，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊，即缓解非酒精性脂肪肝功能肽微胶囊。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的壁材各组分及质量比：海藻胶、桃胶、紫苏籽油、桂花精油、番茄红素、柠檬酸钠、赤藓糖醇及水＝140～155g；195～200g；250～265g；132～135g；25～27g；20～25g；1～2g；30～40g。

技术总结
本发明公开了具有缓解非酒精性脂肪肝的多肽及其制备方法和应用，为贻贝多肽DADPLVILG，其HPLC-MS检测的分子量为911.0[M-H]-。本发明功能肽易于吸收，制备方法简单；制备出来的肽通过双层包覆制得功能肽微胶囊，功能肽微胶囊可以调控肽在胃肠道中的的释放速率，达到缓释效果，实现功能肽在肠道的释放和吸收，来提升功能肽的稳定性与利用率。本发明通过体双蛋白酶酶解工艺，提高了目标多肽的产量，同时还具有对胃肠道酶消化的抵抗作用，在功能肽的制备高效优质的基础上保证了其在改善非酒精性脂肪肝症状的功效。善非酒精性脂肪肝症状的功效。善非酒精性脂肪肝症状的功效。


技术研发人员：相兴伟 蒋起宏 陈慧 刘书来 周绪霞
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2022.12.27
技术公布日：2023/7/22