乳源活性肽LPPPLPSRWPL及其制备方法与应用与流程

乳源活性肽lppplpsrwpl及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明是关于一种活性肽及其制备方法与应用，具体而言，是关于一种乳源活性小肽lppplpsrwpl及其衍生物以及它们的制备方法与应用。


背景技术：

2.生物活性肽是指对生命体具有特定生理活性的肽，其中，乳蛋白是生物活性肽的重要来源之一。近年来，乳源活性肽已经成为人们耳熟能详的一个词语。一方面，乳源活性肽具有小片段、易吸收的特点；另一方面，其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。很多乳源活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，包括抗菌、抗癌、降血压、降胆固醇、抗糖尿病、抗炎、抗抑郁等特性。当前最权威的乳源活性肽数据库biopep-umw中已报告了4000多个不同的乳源活性肽。但是具有抗氧化或免疫调节功能的不同于现有多肽的新的乳源活性肽仍然是目前需要进一步研究的方向。


技术实现要素：

3.本发明的一个目的在于提供乳源活性小肽及其衍生物。
4.本发明的另一目的在于提供所述小肽及其衍生物的制备方法。
5.本发明的另一目的在于提供所述小肽及其衍生物的应用。
6.一方面，本发明提供一种小肽或其衍生物，其中所述小肽的氨基酸序列如seq id no.1所示；
7.seq id no.1：lppplpsrwpl。
8.本发明的小肽为活性肽，具有较好的抗氧化功效及调节免疫功效。
9.根据本发明的具体实施方案，所述衍生物为在seq id no.1所示氨基酸序列的侧链基团、氨基端或羧基端的基础上经羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化和/或糖基化修饰得到的衍生肽。优选地，所述衍生肽具有与seq id no.1所示氨基酸序列的小肽基本相同的生物活性(例如抗氧化和/或调节免疫功效)。
10.另一方面，本发明还提供了一种制备所述的小肽或其衍生物的方法，该方法包括：
11.通过微生物发酵的方法制备所述小肽或其衍生物；或者
12.通过基因工程的方法制备所述小肽或其衍生物(可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得)；或者
13.通过化学方法合成所述小肽或其衍生物。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明提供的一种制备所述的小肽或其衍生物的方法包括：
15.以含有乳蛋白的乳液为发酵底物，接种副干酪乳杆菌发酵，从发酵产物中分离获得本发明所述的小肽或其衍生物。
16.副干酪乳杆菌(lactobacillus.paracasei)为革兰氏阳性菌，往往进行异型发酵，具有兼性厌氧、不运动、无芽孢的特点，形态为杆菌或长杆菌，单个或成对出现，宽度为2.0
～4.0μm，长度为0.8～1.0μm。本发明中，可利用副干酪乳杆菌发酵酶解乳蛋白生产所述小肽，还可选择性地进一步通过修饰获得所述小肽的衍生物。
17.根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述的小肽或其衍生物的方法中，所述发酵底物中包括：3％～10％的牛乳浓缩蛋白以及1％～10％的乳糖。
18.根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述的小肽或其衍生物的方法中，发酵条件为：30～45℃，接种量为1％～3％，种子液中菌数1.5
×
10
11
cfu/ml以上。
19.根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述的小肽或其衍生物的方法中，所述副干酪乳杆菌包括副干酪乳杆菌k56。副干酪乳杆菌k56是cn107916236a的公开菌株，已被证明具有抗细菌、抗肥胖、抗氧化、调节血压、调节肠道菌群、调节免疫系统等功效。
20.采用副干酪乳杆菌k56菌株自然发酵生产乳源活性肽lppplpsrwpl，可提高所产生的目标小肽的浓度并降低生产成本。具体可按照以下方法进行：以牛乳浓缩蛋白为原料，使用副干酪乳杆菌发酵，然后采用膜技术进行浓缩，分离纯化，获得目标小肽。本发明中，可通过真空冷冻干燥技术或者低温喷雾干燥技术获得粉末形式的小肽成品。可通过uplc-ms检查肽的氨基酸序列。
21.在本发明的一些具体实施方案中，采用副干酪乳杆菌k56菌株自然发酵生产乳源活性肽lppplpsrwpl的方法包括：
22.将3～10％的乳浓缩蛋白与1～10％的乳糖溶于ph为7.0～8.0、温度为25～90℃的水溶液中，混匀，冷却至室温后得到乳浓缩蛋白溶液；
23.接种发酵菌种，发酵后得到发酵液；
24.对发酵液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量小于3kda的膜进行超滤过滤，得到过滤后的发酵液；
25.从过滤后的发酵液中进一步分离纯化，获得目标小肽。
26.另一方面，本发明还提供了所述的小肽或其衍生物在制备具有抗氧化和/或免疫调节功效的组合物中的应用。
27.另一方面，本发明还提供了一种组合物，其包含本发明所述的小肽和/或其衍生物，还选择性地包含辅料。
28.根据本发明的具体实施方案，所述组合物为食品组合物、药品组合物或化妆品组合物。
29.本发明的乳源活性肽lppplpsrwpl的有益效果为：一方面，具有较高的抗氧化能力；另一方面，具有较好的免疫调节活性，可提高生命的质量。本发明的小肽及其衍生物对开发具有抗氧化功能、免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
30.图1为质荷比为636.8778的片段的一级质谱图(m/z＝636.8778)。
31.图2显示质荷比为636.8778的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况。
32.图3为乳源活性肽lppplpsrwpl体外消化产物分析饼状图。
具体实施方式
33.在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下
述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
34.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
35.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecular cloning：alaboratory manual，second edition，cold spring harbor laboratory press，1989and third edition，2001；ausubel等，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，new york，1987and periodic updates；the series methods in enzymology，academic press，san diego；wolffe，chromatin structure and function，third edition，academic press，san diego，1998；methods in enzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarman and a.p.wolffe，eds.)，academic press，san diego，1999；和methods in molecular biology，vol.119，chromatin protocols(p.b.becker，ed.)humana press，totowa，1999等。
36.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
37.实施例1活性肽lppplpsrwpl的获得
38.1.乳浓缩蛋白溶液的制备
39.将10％的乳蛋白浓缩物、10％的乳糖、0.5％的nacl(均为质量分数)溶于ph为7.0～8.0的水溶液中。95℃杀菌10min，冰水浴冷却至37℃；
40.2.发酵液的制备
41.加入副干酪乳杆菌k56冻干粉，使添加量达到1％乳浓缩蛋白浓度(即1.5
×
10
11
cfu/l)，混匀后，置入温度为37℃培养箱静置发酵4h后得到发酵液。
42.3.多肽的提取
43.将发酵液经过95℃水浴加热10min灭活，使用冰水浴冷却后进行低温离心，离心条件为：8000rcf、4℃，离心10min，弃去底部沉淀，取上清液。取上清液之后将其移至超滤管内管中进行超滤，选用截留分子量为3kda超滤膜，超滤离心条件为4800rcf、4℃、30min。收集底部超滤液，将所得多肽溶液在4℃条件下低温保存。
44.4.多肽粉末的制备
45.将步骤5得到的多肽溶液喷雾干燥得到所述的牛乳浓缩蛋白肽粉末，喷雾干燥的条件为：进风温度180℃，出风温度90℃，流速25ml/min。
46.5.活性肽lppplpsrwpl的筛选
47.1)uplc分析
48.uplc条件如下：
49.仪器：waters acquity uplc超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
50.色谱柱规格：beh c18色谱柱
51.流速：0.4ml/min
52.温度：50℃
53.紫外检测波长：210nm
54.进样量：2μl
55.梯度条件：a液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，b液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
[0056][0057][0058]
2)质谱分析
[0059]
质谱条件如下：
[0060]
离子方式：es+
[0061]
质量范围(m/z)：100、1000
[0062]
毛细管电压(capillary)(kv)：3.0
[0063]
采样锥(v)：35.0
[0064]
离子源温度(℃)：115
[0065]
去溶剂温度(℃)：350
[0066]
去溶剂气流(l/hr)：700.0
[0067]
碰撞能量(ev)：4.0
[0068]
扫描时间(sec)：0.25
[0069]
内扫描时间(sec)：0.02。
[0070]
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对牛乳浓缩蛋白肽进行色谱分析和质谱分析，得到发酵液中全部多肽的氨基酸序列。
[0071]
选取平行对照组中相同的氨基酸序列，再将peptide ranker中具有生物活性可能性评分较低的氨基酸序列与已公开的氨基酸序列排除，得到活性肽lppplpsrwpl的序列。
[0072]
实施例2活性肽lppplpsrwpl的人工合成
[0073]
一、生物活性肽的合成
[0074]
1.称取rink树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(dcm)浸泡。
[0075]
2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，然后抽干，如此重
复四次，将树脂抽干后待用。
[0076]
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的dmf洗涤四次，然后抽干。
[0077]
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
[0078]
5.称取氨基酸asn适量和1-羟基-苯骈三唑(hobt)适量于50ml的离心管中，加入20ml的dmf将其溶解，然后加入3ml的n,n二异丙基碳二亚胺(dic)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
[0079]
6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:diea:dcm＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的dmf洗涤四次，抽干待用。
[0080]
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用dmf洗涤四次，然后抽干。
[0081]
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
[0082]
9.称取后面第二个氨基酸适量和hobt适量于50ml的离心管中，加入25ml的dmf将其溶解，然后加入2.5ml的dic振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
[0083]
10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
[0084]
11.待反应完全后，用dmf洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用dmf洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
[0085]
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸leu、pro、trp、arg、ser、pro、leu、pro、pro、pro和leu。
[0086]
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用dmf洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
[0087]
至此，人工合成了生物活性肽lppplpsrwpl。
[0088]
二、生物活性肽的确认
[0089]
1)uplc分析
[0090]
uplc条件如下：
[0091]
仪器：waters acquity uplc超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
[0092]
色谱柱规格：beh c18色谱柱
[0093]
流速：0.4ml/min
[0094]
温度：50℃
[0095]
紫外检测波长：210nm
[0096]
进样量：2μl
[0097]
梯度条件：a液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，b液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
[0098][0099][0100]
2)质谱分析
[0101]
质谱条件如下：
[0102]
离子方式：es+
[0103]
质量范围(m/z)：100、1000
[0104]
毛细管电压(capillary)(kv)：3.0
[0105]
采样锥(v)：35.0
[0106]
离子源温度(℃)：115
[0107]
去溶剂温度(℃)：350
[0108]
去溶剂气流(l/hr)：700.0
[0109]
碰撞能量(ev)：4.0
[0110]
扫描时间(sec)：0.25
[0111]
内扫描时间(sec)：0.02。
[0112]
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽lppplpsrwpl进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽lppplpsrwpl一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为636.8778，保留时间是52.88min。
[0113]
3)结果
[0114]
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过mascot软件分析计算，得到质荷比636.8778的片段序列为leu-pro-pro-pro-leu-pro-ser-arg-trp-pro-leu(lppplpsrwpl)，记为seq id no.1。该片段与hhip like 2蛋白第723～733位的残基序列相对应，序列见seq id no.2。
[0115]
seq id no.2：mlrrsiprggwsrwtpwlltsprifclslivllgqvgllq ghpqcldyrppfqplqhlefcsdyesfgccdqrkdhriaarywdimeyfdlkghelcggyikdilcqecspyaahlydaenprtplrnlpglcsdycsafhsnchsaialltndrrfqespgkdgtrfchllnlpdkdycfpnilrsdhlnrnlgtvaedrrgclqlclaevanrlrnpvamvhagdgthrffvaeqvgvvwvylpdgsrleqpfldlkslvlttpwigdergflglafhprfrrnrkfyiyysclgkkrvekirisemkvsradpnkadpkservileieepasnhnggqllfgldgymyiftgdggqagdp
fgkfgnaqnkssllgkvlridvngagsggkryrvpmdnpfvsepgahpaiyaygirnmwrcavdrgdpithqgrgrmfcgdvgenrfeevdiivkggnygwrakegfecydkklcqnaslddilpiyayghavgksvtggyvyrgcespnlnglyifgdfmsgrlmalqedrktkkwkkqdiclgstescafpglisthskfiisfgedeagelyflatsypsayaphgsiykfvdpsrrappgkckykpvpvktrskrvqfrplakmvldllkeqsekaarklssatlasspnrassqkdsfkkpasptssrktspgpgakkrarvwspgpqgkrkgipkrpsgiarqaaqhrragrslppplpsrwplrgpepphhveaaaepdfrcagsrgwrwepsera
[0116]
实施例3乳源活性肽的抗氧化活性实验
[0117]
一、farp法测定乳源活性肽lppplpsrwpl的体外抗氧化能力
[0118]
1.实验试剂和仪器
[0119]
牛乳浓缩蛋白(mpc)粉，恒天然商贸(上海)有限公司；副干酪乳杆菌(k56)，生合生物科技股份有限公司；中性蛋白酶(酶活力1.1
×
106u/g)，夏盛(上海)生物科技有限公司；乳糖，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，上海凌峰化学试剂有限公司；胃蛋白胨peptone，bbi生命科学有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒(ferric reducing ability of plasma frap)，上海碧云天生物科技公司。
[0120]
电子天平，sartorius德国；恒温水浴箱，上海一恒科技有限公司；3kda超滤管，millipore公司；dr-200bc酶标仪，长沙市德科仪器设备有限公司；jb-vs-1300u超净工作台，上海屹明净化设备有限公司；lrh-250f生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；gi36t高压灭菌锅，厦门致微仪器有限公司；froma 700低温冰箱，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；96孔细胞培养板，美国millipore公司；ro15纯水系统，力康生物医疗科技控股有限公司；gl-22m高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
[0121]
2.实验方法
[0122]
根据总抗氧化能力检测试剂盒，将三吡啶三吖嗪(tripyridyltriazine tptz)7.5ml稀释液、tptz 750μl溶液、检测缓冲液750μl混合均匀，并在37℃水浴中孵育，2h内用完。
[0123]
在96孔板中先加入180μlfrap工作液，按浓度梯度加入5μl feso4标准曲线溶液，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。
[0124]
在96孔板中先加入180μlfrap工作液，空白对照孔中加入5μl ddh2o，样品检测孔内加入5μl待测样品、空白对照、阳性对照，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。总抗氧化能力表示方式以feso4标准溶液的浓度来表示。
[0125][0126]
3.实验结果及分析
[0127]
测定结果见表1。
[0128]
表1乳源活性肽lppplpsrwpl的总抗氧化能力
[0129]
实验分组总抗氧化能力(mmol/g)阳性对照组植酸1mg/ml0.0025
±
0.0013lppplpsrwpl 1mg/ml0.0062
±
0.0009**lppplpsrwpl 0.5mg/ml0.0041
±
0.0013*lppplpsrwpl 0.1mg/ml0.0018
±
0.0005
[0130]
注：**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(p＜0.01)；*，与阴性对照组比较，有显著性差异(p＜0.05)。
[0131]
实验结果如表1所示，通过farp法对多肽lppplpsrwpl的体外总抗氧化活性进行了测定，发现加入乳源活性肽lppplpsrwpl的实验组相比阳性对照组其吸光值有一定程度的降低，具有较好的还原氧化物质的能力。由表1可知，发现乳源活性肽lppplpsrwpl的总抗氧化能力随着多肽浓度的升高而升高，在浓度为1mg/ml情况下，乳源活性肽lppplpsrwpl的总抗氧化水平最佳。因此，可认定发明的乳源活性多肽lppplpsrwpl具有显著的抗氧化能力。
[0132]
实施例4乳源活性肽的免疫调节活性实验
[0133]
一、乳源活性肽lppplpsrwpl对lps刺激后巨噬细胞释放细胞因子的测定
[0134]
1.实验试剂和仪器
[0135]
pbs，南京凯基生物科技有限公司；dmem不完全高糖培养液；南京凯基生物科技有限公司；胎牛血清，gibco有限公司；巨噬细胞raw264.7，上海中国科学院细胞所；脂多糖(lps，e.coli o111:b4)，sigma有限公司；小鼠白介素6(il-6)elisa试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0136]
centrifuge 5414d小型高速离心机，eppendorf有限公司；gl-22m高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；电子天平sartorius，德国；恒温水浴箱，上海一恒科技有限公司；dr-200bc酶标仪，长沙市德科仪器设备有限公司；jb-vs-1300u超净工作台，上海屹明净化设备有限公司。
[0137]
2.实验方法
[0138]
配制含10％胎牛血清的dmem不完全培养基(其中含青霉素80u/ml；链霉素0.08g/l)，用该培养基将raw264.7细胞配成2
×
105/m l的浓度，将细胞悬液接种在25cm2一次性培养瓶或96孔板中。在温度为37℃、c02浓度为5％的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。24h后更换培养基。用倒置显微镜观察培养瓶中细胞基本长满瓶底时，进行传代。传代时，小心吸出旧培养液，加入1.5ml胰蛋白酶消化液，放置在37℃培养箱中准确消化2min，加入培养基2ml终止反应。反复轻柔吹打细胞，使底部贴壁生长的细胞吹落散开。800g离心2min，收集管底细胞，加入培养基重悬至2
×
105浓度，进行培养。
[0139]
实验前期：raw264.7细胞在含有0g/l、0.1g/l、0.5g/l、1.0g/l浓度的乳源活性肽lppplpsrwpl的dmem培养基中培养24h，在第24h时每个培养瓶中加入终浓度为100μg/l的lps溶液，继续培养2h后，用elisa试剂盒测定培养基上清液中细胞因子il-6浓度。
[0140]
3.实验结果及分析
[0141]
测定结果见表2。
[0142]
表2乳源活性肽lppplpsrwpl对lps刺激后巨噬细胞释放il-6的测定
[0143]
实验分组实验结果(pg/ml)lppplpsrwpl 0mg/ml12.87
±
0.23lppplpsrwpl 1mg/ml3.84
±
0.13**lppplpsrwpl 0.5mg/ml6.12
±
0.22**lppplpsrwpl 0.1mg/ml9.83
±
0.37*
[0144]
注：**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(p＜0.01)；*，与阴性对照组比较，有显著性差异(p＜0.05)。
[0145]
当机体受到外界的lps刺激时，巨噬细胞可通过趋化作用到达病原体所在的局部组织，迅速吞噬异物，并生成大量炎症因子，如il-6。实验结果如表1所示，通过对lps刺激后巨噬细胞释放il-6的测定的对多肽lppplpsrwpl的体外免疫调节活性进行了测定，发现加入乳源活性肽lppplpsrwpl的实验组相比空白组其细胞培养上清液中il-6浓度有一定程度的降低，表明巨噬细胞促炎症因子的释放水平有所降低，炎症对机体造成的损伤从而降低。由表1可知，乳源活性肽lppplpsrwpl的免疫调节能力随着多肽浓度的升高而升高，在浓度为1mg/ml情况下，多肽lppplpsrwpl的免疫调节能力最佳。因此，可认定发明的乳源活性多肽lppplpsrwpl具有显著的免疫调节能力。
[0146]
实施例5乳源活性肽的稳定性及核心片段验证实验
[0147]
一、乳源活性肽lppplpsrwpl的体外模拟胃肠道消化实验
[0148]
1.乳源活性肽lppplpsrwpl冻干粉末体外消化
[0149]
取1.5mg样品粉末溶于1.5ml ddh2o中，在样品(浓度为1mg/ml)中加入胃蛋白酶(酶：底物＝1:50，w/w)后，将ph调至2.0，37℃水浴90min。随后，将水解产物的ph调至7.5，加入胰酶(酶：底物＝1:25，w/w)，37℃水浴150min。最后，用95℃热水浴5min使酶失活终止反应。实验中设置对照组，除不加入胃蛋白酶和胰酶，在相同时间做相同的ph和温度处理。将对照组和样品组真空冷冻干燥成粉末后，存储于-80℃用于后续分析。
[0150]
2.uplc-ms分析
[0151]
uplc条件如下：
[0152]
仪器：waters acquity uplc超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
[0153]
色谱柱规格：beh c18色谱柱
[0154]
流速：0.4ml/min
[0155]
温度：50℃
[0156]
紫外检测波长：210nm
[0157]
进样量：2μl
[0158]
梯度条件：a液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，b液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
[0159][0160]
2)质谱分析
[0161]
质谱条件如下：
[0162]
离子方式：es+
[0163]
质量范围(m/z)：100、1000
[0164]
毛细管电压(capillary)(kv)：3.0
[0165]
采样锥(v)：35.0
[0166]
离子源温度(℃)：115
[0167]
去溶剂温度(℃)：350
[0168]
去溶剂气流(l/hr)：700.0
[0169]
碰撞能量(ev)：4.0
[0170]
扫描时间(sec)：0.25
[0171]
内扫描时间(sec)：0.02。
[0172]
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对乳源活性肽lppplpsrwpl体外消化产物进行色谱分析和质谱分析。对比对照组与实验组中所存在多肽的多肽序列，以检测乳源活性肽的稳定性。
[0173]
3.实验结果及分析
[0174]
图3为乳源活性肽lppplpsrwpl体外消化产物分析饼状图。图例按含量多少排列。
[0175]
如图3所示，实验组与对照组中乳源活性肽lppplpsrwpl原始序列所占比例均在99％以上，说明胃蛋白酶与胰酶没有将其水解，体内酸性环境也无法将其水解。实验证明乳源活性肽lppplpsrwpl在胃肠道消化过程中具有稳定性。
[0176]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种小肽或其衍生物，其中所述小肽的氨基酸序列如seq id no.1所示；seq id no.1：lppplpsrwpl。2.根据权利要求1所述的小肽或其衍生物，其中，所述衍生物为在seq id no.1所示氨基酸序列的侧链基团、氨基端或羧基端的基础上经羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化和/或糖基化修饰得到的衍生肽。3.一种制备权利要求1或2所述的小肽或其衍生物的方法，该方法包括：通过微生物发酵的方法制备所述小肽或其衍生物；或者通过基因工程的方法制备所述小肽或其衍生物；或者通过化学方法合成所述小肽或其衍生物。4.一种制备权利要求1或2所述的小肽或其衍生物的方法，该方法包括：以含有乳蛋白的乳液为发酵底物，接种副干酪乳杆菌发酵，从发酵产物中分离获得权利要求1所述的小肽或其衍生物。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述发酵底物中包括：3％～10％的牛乳浓缩蛋白以及1％～10％的乳糖。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，发酵条件为：30～45℃，接种量为1％～3％，种子液中菌数1.5
×
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11
cfu/ml以上。7.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中，所述副干酪乳杆菌包括副干酪乳杆菌k56。8.权利要求1或2所述的小肽或其衍生物在制备具有抗氧化和/或免疫调节功效的组合物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述组合物为食品组合物、药品组合物或化妆品组合物。10.一种组合物，其包含权利要求1或2所述的小肽或其衍生物，还选择性地包含辅料；优选地，所述组合物为食品组合物、药品组合物或化妆品组合物。

技术总结
本发明提供了乳源活性肽LPPPLPSRWPL及其制备方法与应用。本发明首先提供一种小肽或其衍生物，其中所述小肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；SEQ IDNO.1：LPPPLPSRWPL。本发明的小肽为乳源活性肽，具有较好的抗氧化功效及调节免疫功效。节免疫功效。


技术研发人员：何剑 王彩云 张少辉 王娟 包萨日娜 韩仁娇 洪维鍊 马霞 孙婷
受保护的技术使用者：内蒙古伊利实业集团股份有限公司
技术研发日：2022.11.30
技术公布日：2023/7/22