一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因orf5877及其应用的制作方法

一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877及其应用
技术领域
1.本发明涉及环境微生物领域和分子生物学技术领域，特别涉及一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877及其应用。


背景技术：

2.蚊虫是我们熟悉的一种害虫，它的种类繁多，已知全世界有3200多种，其中我国已知蚊类达18个属48个亚属和371种或亚种。蚊虫不仅严重影响我们的生活，更重要的是它是传播多种疾病的媒介。目前在我国吸血并能传播疾病的蚊种有10多种。以蚊子为媒介传播的病在预防医学中占有重要地位，因为蚊类传播的转播力强、发病率高、危害性大。其传播的疾病主要有疟疾、登革热、丝虫病、流行性乙型脑炎和寨卡等，严重地危害着人民群众的身体健康。
3.近年来我国一些老的以蚊子为媒介传播的疾病不断复发，并且新的以蚊子为媒介传播不时出现，因此对蚊子的防治受到广泛关注。蚊子防控的主要策略有环境防治、化学防治和生物防治等。环境防治效率较低；化学防治效率高、见效快但污染环境，短时间内会导致抗性产生、高残，甚至直接导致人畜中毒。而生物防治既是用一种生物控制另一种生物或者利用生物本身的特点来控制，其最大的优点是比环境比较友好、成本低。
4.目前随着对杀蚊活性的菌株中晶体蛋白结构和有关分子作用机理的不断广泛而深入研究，并通过利用现代生物技术手段提高杀蚊效果。无疑，研究高效的菌株生物杀虫剂，对控制蚊虫具有非常重要的现实意义。研究杀蚊作用机理的关键是受体。pootanakit等已从埃及伊蚊(aedes aegypti)中肠中鉴定出两种晶体蛋白作用受体——氨肽酶n异构体。charles等发现以色列亚种晶体蛋白作用于伊蚊的肠道上皮细胞导致其组织病理学变化与鳞翅目昆虫中的情况相似。
5.芽孢杆菌是一类兼性厌氧或好氧，革兰氏阳性杆菌的总称，产芽孢，生理特征丰富多样，分布极其广泛，是植物体表、根际和土壤、空气的重要微生物种群。芽孢杆菌是一类产生大量的不同化学结构的多肽抗菌物质的物种。蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)是环境中常见的食源性致病菌之一，兼性好氧。生长温度范围20～45℃，10℃以下生长缓慢或不生长，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境，但目前对于蜡样芽孢杆菌的杀虫基因在杀埃及伊蚊方面中的应用未见报导。


技术实现要素：

6.鉴于此，本发明提出一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877及其应用。
7.本发明的技术方案是这样实现的：
8.本发明提供一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877，该杀虫基因orf5877的dna序列如seq id no.1所示的核苷酸序列。
9.进一步说明，所述杀虫基因orf5877的氨基酸序列如seq id no.2所示的氨基酸序
列。
10.进一步说明，所述杀虫基因orf5877的克隆方法为：以蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204的基因组为模板，采用pcr扩增方法，获得orf5877完整杀虫基因片段。
11.进一步说明，所述pcr扩增的引物序列与限制性内切酶包括：
12.orf5877引物f：taagaaggagatatacatatggttactacaaaaatgatacctag，r：gtggtggtggtggtgctcgagaatttgatccgattcgtataact，限制性内切酶xhoⅰ和ndeⅰ。
13.一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877在杀伊蚊方面中的应用。
14.一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877在制备杀蚊剂中的应用。
15.其中，所述芽孢杆菌新菌株hsy204的分类命名为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no.m2020523。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204进行筛选、鉴定、营养期杀虫蛋白的杀虫活性以及其基因的克隆表达等实验，经过生物活性测定表明，蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204菌株的杀虫蛋白基因orf5877对埃及伊蚊幼虫具有很高的毒性，对蚊子的生长具有明显影响，对小菜蛾和棉铃虫的生长没有影响，可以应用防控蚊虫，有效降低蚊媒疾病大规模传播的风险。
附图说明
17.图1为本发明蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204不同视野倍数下的光学显微镜图；
18.图2为本发明蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204培养到芽孢期时的不同视野倍数下的扫描电镜图；
19.图3为本发明蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204的sds-page分析，图中，1：hsy204；2：bti(bacillus thuringiensis israelensis)
20.图4为本发明蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204杀虫基因orf5877的pcr扩增产物琼脂糖电泳分析图；
21.图5为本发明蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204杀虫基因5877蛋白的sds-page分析图。
具体实施方式
22.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
23.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
24.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.实施例1-菌株hsy204的筛选与鉴定
26.(1)土壤样品采集：采样地点选择在海南省热带雨林，为了增加获取新菌株的概率，采样点选择植被保护完整、生态环境没有人为干预少、土壤腐殖质丰富的地方；
27.(2)菌株hsy204筛选：采用醋酸钠-温度筛选法，称取5g左右土壤放入20ml bpa培养基中，充分振荡，30℃摇床培养4-5h，75℃水浴15min，取1ml上清稀释至10-3
、10-4
和10-5
，各吸取200μl nb平板，30℃倒置培养3d，挑取形态各异的单菌落划平板。
28.(3)芽孢杆菌培养3-5天形成芽孢后，进一步利用石炭酸复红染色和光学显微镜分
离株的是否含有伴胞晶体蛋白，光学显微镜下观察到无色芽孢为芽孢杆菌，产生伴胞晶体的芽孢杆菌，命名为蜡样芽孢杆菌hsy204，然后进一步用电子显微镜观察芽孢的形状，如图1和图2所示，可以出菌和晶体的具体形状。为了明确筛选得到野生菌株的杀虫活性，以埃及伊蚊作为靶标昆虫进行生物测定，筛选一株菌株hsy204对伊蚊表现出很好的杀虫效果，命名为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204。为了进一步鉴定该菌株是否为新型芽孢菌株，通过sds-page电泳分析其伴胞晶体带型，发现菌株hsy204与标准菌株有类似的带，如图3所示。
29.实施例2-菌株hsy204的dna提取及杀虫基因鉴定
30.通过利用miseq illumina下一代测序和pacbio技术对菌株hsy204的基因组序列进行分子和生物信息学分析。
31.1.菌株hsy204基因组dna提取
32.(1)hsy204单菌落接种于2-5ml左右的lb液体培养基中，28℃，220rpm培养过夜活化；
33.(2)第二天按1％量转接到新鲜的lb液体培养基中，28℃，220rpm继续培养4～6小时至od600＝2.0左右；
34.(3)以8000rpm离心2min收集1-3ml菌体；
35.(4)1ml j buffer(0.1m tris hcl(ph 8.0)、0.1m edta(ph 8.0)、0.15m nacl)洗涤沉淀，8000rpm离心2min，弃上清；
36.(5)移液枪吹打将沉淀重新悬浮于500μl j buffer(j buffer使用前预先加入溶菌酶至20mg/ml)中，37℃温育30min，期间振荡3-5次；
37.(6)加入15μlrnase(10mg/ml)，50℃作用15min；
38.(7)再加入80μl sds(10％)，70℃处理20min，室温冷却至室温；
39.(8)等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)氯仿：异戊醇(24：1)各抽提一次(上下剧烈倒置10-30次，12,000rpm离心10min，小心吸取上清)；
40.(9)加入等体积的异丙醇混匀，12,000rpm离心10min，倾去上清；
41.(10)加入500μl的70％乙醇(勿剧烈震荡)，12,000rpm离心2min；
42.(11)风干后溶50μl te buffer中，取5μl dna溶液在1.0％的胶电泳检测。
43.2.菌株hsy204杀虫基因鉴定
44.用菌株hsy204的基因组dna片段构建了illumina pair-end文库和smrt bell文库，分别用于illumina hiseq和pacbio rsii进行全基因组测序。pacbio的原始测序数据用canu软件进行组装，软件pilon用illumina的原始测序数据对canu的组装结果进行了较正，最终得到了hsy204全基因组长度为6,035,572bp，0个gap，由一个染色体和四个质粒组成。使用glimmer软件进行基因预测，得到hsy204包含6102个cds。将这些基因在六个数据库(nr,swiss-prot,pfam,eggnog,go and kegg)中进行了注释，以进一步发掘出潜在功能。
45.rrna和trna分别用软件rnammer-1.2和trnascan-se进行预测。
46.实施例3-菌株hsy204杀虫基因克隆表达
47.通过采用碱裂解的方法提取菌株hsy204的基因组dna，根据基因orf5877的编码序列设计引物，并采用无缝克隆的技术手段将基因插入表达载体pet-30a，构建成功的重组子转入bl(de3)，进行诱导表达。
48.无缝克隆(seamless cloning)技术具体为：
49.a.采用双酶切法者pcr扩增方法将载体线性化
50.(1)酶切后线性载体进行胶回收，平末端和粘性末端均可；
51.(2)pcr扩增获得线性载体，如果是单一带，pcr产物直接纯化，否则进行胶回收纯化。
52.b.使用设计好的引物进行目的dna片段的pcr扩增；
53.表1：hsy204菌中的orf5877基因引物序列信息表
[0054][0055]
(1)引物不能磷酸化；
[0056]
(2)扩增产物为平末端的高保真dna聚合酶；
[0057]
(3)电泳检测扩增产物的完整性，有杂带，凝胶回收目的片段；
[0058]
(4)克隆引物包括目的片段特异引物序列(22nt)和载体重叠序列(15-25nt；对于3个以上片段的重组，将同源区域增加至30nt)；
[0059]
(5)对酶切位点有严格要求，选择合适的酶切位点，正向和反向引物增加缺少碱基恢复原有的酶切位点；
[0060]
(6)按照线性载体末端结构5`突出、3`突出、平末端引物设计。
[0061]
c.克隆反应体系
[0062]
component volume
[0063]
pcr product 1-4μl
[0064]
linearized vector 1-2μl
[0065]2×
assembly mix5μl
[0066]
h2o xμl
[0067]
total 10μl
[0068]
(1)将目的dna片段和线性化载体加入量为0.01-0.25pmol(估算1kb 20ng、1.5kb 30ng)，最佳摩尔比为2:1，加到离心管混匀；
[0069]
(2)50℃反应15min进行重组反应，反应结束置于冰上冷却数秒(对于3个以上片段的重组，反应时间延长至60min)；
[0070]
(3)重组产物保存-20℃或直接用于转化。
[0071]
重组产物通过快速或传统方法转化e.coli感受态细胞
[0072]
(4)将感受态细胞从-70℃冰箱取出后，置于冰浴中融化；
[0073]
(5)在50μl感受态细胞中加入5μl重组产物，轻轻弹动离心管壁混匀(禁止涡旋)后，在冰上放置30min，期间不要振动离心管；
[0074]
(6)将离心管置于42℃恒温水浴热激30-90sec，取出管后立即置于冰浴中静置2～3min；
[0075]
(7)向离心管中加入500μl 37℃预热的soc或lb培养基(不含抗生素)，200rpm、37℃振荡培养1h；
[0076]
(8)将离心管中的菌液轻弹或吸吹混匀，吸取200μl加到含相应抗生素的lb固体培养基(最好提前37℃预热)过夜培养。
[0077]
阳性克隆鉴定
[0078]
(9)菌落pcr或提取重组质粒pcr验证；
[0079]
(10)重组质粒酶切验证；
[0080]
(11)测序鉴定，初步鉴定后，将所有新构建的载体选取1～2个阳性克隆进行测序鉴定。
[0081]
实施例4-制备毒素蛋白
[0082]
通过iptg诱导蛋白表达，小量表达，超声波破碎，利用sds-page电泳分析表达蛋白。大量表达采用金属螯合镍柱进行亲和层析，利用高亲和ni-nta纯化介质把螯合剂(氮川三乙酸或nta)共价偶联到琼脂糖介质(4％交联)上，然后再螯合ni
2+
制备而成。nta能够通过四个位点牢固的螯合ni
2+
，从而减少纯化过程中ni
2+
泄露到蛋白样品中。
[0083]
菌株hsy204杀虫基因在大肠杆菌中表达方法具体如下：
[0084]
(1)构建好表达工程菌株接种到2-5ml含有对应的抗生素的lb培养基(amp100kan 30μg/ml)中过夜活化表达菌株；
[0085]
(2)第二天按1％量转接到含相对应抗生素的新鲜lb培养基中培养2h至od600为0.6左右，加入2-8μl iptg(500mm)至终浓度为0.1-0.5mm培养8-20h(其中，空载用iptg诱导作对照；表达菌株转接2份，一份加入iptg，另为一份作为阴性对照不加iptg)；
[0086]
(3)以不同的温度、iptg溶度和表达时间，优化表达体系，实现可溶性表达；
[0087]
(4)8000rpm离心，5min收集菌体，用0.5m nacl或ddh2o或pbs缓冲液洗涤1-3次；
[0088]
(5)加入800μl适量pbs缓冲液，超声波破碎处理5-20min，至液体澄清(sonics vcx750s参数：小探头功率20％，工作10s，间隔10s)；
[0089]
(6)10000rpm离心5min，分别收集上清，沉淀用1ml pbs缓冲液洗涤1-2次，然后用50μl pbs缓冲液吹打悬浮；
[0090]
(7)表达菌株和参照菌株蛋白产物上清和沉淀进行sds-page分析，结果如图5所示。
[0091]
实施例5-hsy204蛋白生物活性测定
[0092]
将制备获得的hsy204蛋白用于生物活性测定，bio-rad光密度扫描法对表达蛋白进行定量分析，蛋白样品做梯度稀释，准备2-3龄靶标昆虫，设置空白对照，进行生物测定，观察死虫的数量，利用spss13.0软件进行概率回归分析，获得lc50值和95％置信区间值，明确杀虫活性。
[0093]
1.棉铃虫、斜纹夜蛾人工生物测定
[0094]
(1)称取10g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入1000μl待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发；
[0095]
(2)分装于经消毒的24孔细胞培养板中，用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每孔一头，每处理重复3次，严格密封，防止幼虫逃逸；
[0096]
(3)放置于光照培养箱(25℃，湿度为65％，光周期为12h∶12h)中培养，第4天或6天分别调查死活虫数，计算死亡率和lc50。
[0097]
2.埃及伊蚊饲养及蚊子的生物测定
[0098]
(1)蚊幼虫采集于夏季静止小溪流；
[0099]
(2)在人工室内环境，温度为26度，相对空气湿度为80％和光照周期为14小时的条件下饲养；
[0100]
(3)蚊的生长周期为4个阶段：卵、幼虫、涌和成虫；幼虫生长在去氯自来水中，不断加入人工饲料(面粉9：酵母粉1)喂食；
[0101]
(4)成虫放置在玻璃虫笼中，放入10％蔗糖溶液(或者蜂蜜溶液)的脱脂棉球喂食成虫，放入小老鼠让蚊吸血后进入繁殖阶段；
[0102]
(5)因雌性蚊要将虫卵产在静止的水中，在成虫笼中放入一个盛水的开放容器收集虫卵；
[0103]
(6)3-4龄的幼虫用于生物测定实验，每天观察，记录其死亡数，计算死亡率和lc50；
[0104]
(7)用于蛋白毒力测定的蚊虫为实验室人工饲养的敏感品系，标定好浓度蛋白溶液由去氯自来水稀释成一定的浓度，分别置于消毒透明饮水塑料杯里；
[0105]
(8)每个塑料杯盛10ml蛋白溶液，用pasteur pipette移入10头3龄的蚊幼虫；
[0106]
(9)不加入任何蛋白的去氯自来水作为阴性对照，每个蛋白浓度设置3个重复。
[0107]
3.菌株hsy204杀虫蛋白的生物活性测定结果如下表：
[0108]
表2 hsy204杀虫蛋白的生物活性测定
[0109][0110]
(其中，nd:未检测到。》300：300μg/g时无致死作用和体重抑制。)由上表可以看出，hsy204杀虫蛋白对蚊子的生长具有明显影响，对小菜蛾和棉铃虫的生长没有影响。
[0111]
4.菌株hsy204中杀虫基因的蛋白对埃及伊蚊杀虫活性测定结果如下表：
[0112]
表3 hsy204杀虫基因orf5877对埃及伊蚊杀虫活性测定
[0113]
杀虫基因蛋白杀虫蛋白分子量杀虫蛋白溶度埃及伊蚊致死率orf587794kda≥200mg/ml33.33％
[0114]
由上表可以看出杀虫基因orf5877的蛋白对埃及伊蚊具有一定的致死率，对埃及伊蚊的致死率可达33.33％。
[0115]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877，其特征在于：杀虫基因orf5877的dna序列如seq id no.1所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877，其特征在于：所述杀虫基因orf5877的氨基酸序列如seq id no.2所示的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877，其特征在于：所述杀虫基因orf5877的克隆方法为：以蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)hsy204的基因组为模板，采用pcr扩增方法，获得orf5877完整杀虫基因片段。4.如权利要求3所述的一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877，其特征在于：所述pcr扩增的引物序列与限制性内切酶包括：orf5877引物f：taagaaggagatatacatatggttactacaaaaatgatacctag，r：gtggtggtggtggtgctcgagaatttgatccgattcgtataact，限制性内切酶xhoⅰ和ndeⅰ。5.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877的应用，其特征在于：所述应用为在杀伊蚊方面中的应用。6.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌新菌株hsy204的杀虫基因orf5877在制备杀蚊剂中的应用。

技术总结
本发明提供一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因orf5877及其应用，杀虫基因orf5877的DNA序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，经过生物活性测定表明，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204菌株的杀虫蛋白基因orf5877对埃及伊蚊幼虫具有很高的毒性，对埃及伊蚊的生长具有明显影响，可以应用防控蚊虫，有效降低蚊媒疾病大规模传播的风险。蚊媒疾病大规模传播的风险。蚊媒疾病大规模传播的风险。


技术研发人员：张文飞 吴江玉 贾璐羽 何佳利 范子钰 蔡雨辰 张旭东 王锐萍
受保护的技术使用者：海口海森元生物科技有限公司
技术研发日：2022.09.30
技术公布日：2023/7/22