一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体、碱基序列、构建方法及甜菊糖苷转化方法与流程

1.本发明涉及环糊精葡萄糖基转移酶技术领域，具体涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体、碱基序列、构建方法及甜菊糖苷转化方法。


背景技术：

2.葡萄糖基甜菊糖苷是以甜叶菊叶为原料，经酶法对甜叶菊叶中提取的甜菊糖苷进行葡萄糖基化，然后经蒸发浓缩、喷雾干燥而得的食品添加剂。葡萄糖基甜菊糖苷在国家标准gb2760-2014中属于香精香料类，与甜菊糖苷相比，去掉了甜菊糖苷天然带的苦味，口感好、甜味纯正，使用范围更加广泛。经过研究发现，短链葡萄糖基甜菊苷含量的增加有助于提升葡萄糖基甜菊糖苷的口感和品质。
3.目前甜菊糖苷多采用环糊精葡萄糖基转移酶转化为葡萄糖基甜菊糖苷，但是现有环糊精葡萄糖基转移酶大多底物和产物专一性不强，所产生的葡萄糖基甜菊糖苷为多种物质的混合物，“葡萄糖基化程度”难以控制(c13和c19位连接葡萄糖基的个数在很大程度上影响产物的口感)，如口感相对较好的化合物，如瑞鲍迪苷d(rebaudioside d，rebd)、瑞鲍迪苷m(rebaudioside m，rebm)等“葡萄糖基化程度”均较低。目前市场上缺少专门用于甜菊糖苷酶改的环糊精葡萄糖基转移酶，限制了葡萄糖基甜菊糖苷质量的提升，导致整体产品品质难以有质的提升。
4.中国专利申请202010253100.0“一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的突变菌株及其应用”，公开了一种突变菌株巴斯德毕赤酵母cgt-2，该菌株产生的环糊精葡萄糖基转移酶的酶活性可高达60.4ul/ml，可以提高底物的转化效率，但是未见对于产物品质提升的报告。


技术实现要素：

5.针对目前市场上缺少专门用于甜菊糖苷转化的环糊精葡萄糖基转移酶，本发明的目的在于提供一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，将其应用于甜菊糖苷的酶转化过程，所得产物中短链葡萄糖基甜菊糖苷的含量高，口感和品质得到提升。
6.本发明提供如下的技术方案：一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体为氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型环糊精葡萄糖基转移酶的第189位由酪氨酸突变为苯丙氨酸、第255位由甘氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白(a)；或者，所述突变体为蛋白(a)的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加所形成的，与蛋白(a)的氨基酸序列具有至少90％的同源性，且对应蛋白(a)的第189位、第255位位点的氨基酸与蛋白(a)相同，且具有蛋白(a)相同或相近功能的蛋白(b)。
7.本发明所用野生型环糊精葡萄糖基转移酶即cgtase-13的氨基酸序列如seq id no.1，该野生型转移酶优选来源于大岛盐碱芽孢杆菌alkalihalobacillus oshimensis，可
lys asp gln asn gly asn val ile trp gln ser gly asn asn arg thr tyr thr ser pro ala thr gly thr asp thr val ile thr asn trp。
9.氨基酸序列seq id no.2如下：met gly val thr asn lys val asn tyr ser lys asp val ile tyr gln ile val thr asp arg phe ser asp gly asn thr ala asn asn pro thr gly thr ile phe ser gln asn cys ser asp leu his lys tyr cys gly gly asp trp gln gly ile ile asn lys met asn asp gly tyr leu thr asp leu gly ile thr ala leu trp ile ser gln pro val glu asn val tyr ala leu his pro ser gly tyr thr ser tyr his gly tyr trp ala arg asp tyr lys lys thr asn pro tyr phe gly asn phe thr asp phe asp arg leu val ser thr ala his ser lys gly ile lys ile ile met asp phe thr pro asn his ser ser pro ala leu glu thr asn pro asn tyr val glu asn gly ala leu tyr asn asn gly ala met leu gly asn tyr ser asn asp arg asn lys leu phe his his asn gly gly thr asp phe ser ser tyr glu asp ser ile tyr arg asn leu phe asp leu ala asp tyr asp leu asn asn lys val ile asp gln tyr leu lys glu ser ile lys leu trp leu asp lys gly ile asp gly ile arg val asp ala val lys his met ser glu gly trp gln thr ser leu met ser asp ile tyr ser his lys pro val phe thr phe gly glu trp phe leu ala ser gly glu val asp pro gln asn his his phe ala asn glu ser gly met ser leu leu asp phe gln phe gly gln thr ile arg ser val leu lys asp arg thr ser asn trp tyr asp phe asn glu met ile lys ser thr glu lys asp tyr asp glu val ile asp gln val thr phe ile asp asn his asp met ser arg phe ser val gly ser ser ser asn arg gln thr asp ile ala leu ala val leu leu thr ser arg gly val pro thr ile tyr tyr gly thr glu gln tyr leu thr gly gly asn asp pro asp asn arg lys pro met lys thr phe asp arg ser thr asn ser tyr lys ile thr ser lys leu ala ser leu arg gln arg asn ser ala leu gly tyr gly asn thr thr glu arg trp ile asn ser asp val tyr ile tyr glu arg lys phe gly asn ser ile val leu thr ala val asn ser ser asn arg asn gln thr ile ser asn leu asn thr ser leu pro gln gly asn tyr thr asp glu leu gln gln leu leu asp gly asn ala ile thr val asn ala asn gly ser ala asn ser phe gln leu arg ala asn ser val ala val trp gln val thr lys glu ser thr ser pro leu ile gly his val gly pro met met gly lys thr gly asn thr val thr val ser gly glu gly phe gly asp lys lys gly ser val leu phe gly ser thr ser ala glu ile val thr trp ser asn thr glu ile gln val lys val pro ser val thr ala gly his tyr asn leu ser val val asn ala thr asn ala lys ser pro ala tyr glu lys phe glu val leu ser gly asn gln val ser val arg phe ala val asn asn ala thr thr asn ser gly thr asn val tyr ile val gly asn val ser glu leu gly asn trp asp pro asn lys ala ile gly pro met phe asn gln val met tyr lys tyr pro thr trp tyr tyr asp ile ser val pro ala gly lys asn leu glu tyr lys tyr ile lys lys asp gln asn gly asn val ile trp gln ser gly asn asn arg thr tyr thr ser pro ala thr gly thr asp thr val ile thr asn trp。
10.本发明还提供了编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的碱基序列。
11.本发明还提供了含有上述碱基序列的表达载体。
12.作为本发明的优选，表达载体为pgex质粒、phy300质粒、ppic3k质粒、ppic9k质粒、phy300plk质粒、pet质粒或duet质粒。优选的，pet质粒为pet-15或pet-19或pet-20或pet-24或pet-28或pet-32；优选的，duet质粒为prsfduet-1或pacycduet-1，优选的，pgex质粒为pgex-4t-2或pgex-6p。
13.本发明还提供了含有上述碱基序列或上述表达载体的宿主细胞。
14.作为本发明的优选，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。优选的，该宿主细胞为重组原核细胞或真核细胞；原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
15.作为本发明的优选，宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)细胞或毕赤酵母菌细胞。
16.本发明还提供了一种上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的构建方法，将含有编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的碱基序列的表达载体通过电击或化学转化法转入宿主细胞。
17.作为本发明方法的优选，包括如下具体步骤：将含有编码氨基酸序列seq id no.1的碱基序列的表达载体经使第189位发生突变的第一引物对定点突变，转移到克隆宿主中进行扩增，提取表达载体测序，筛选突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变的表达载体，然后经使第255位发生突变的第二引物对定点突变，转移到克隆宿主中进行扩增，提取表达载体测序，筛选突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变的表达载体，然后转移到宿主细胞中诱导表达，收集酶液；当宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)时，第一引物对的正向引物碱基序列如seq id no.3所示，反向引物碱基序列如seq id no.4所示，第二引物对的正向引物碱基序列如seq id no.5所示，反向引物碱基序列如seq id no.6所示；当宿主细胞为毕赤酵母菌细胞时，第一引物对包括两组，第一组的正向引物碱基序列如seq id no.7所示，反应引物碱基序列如seq id no.8所示，第二组的正向引物碱基序列如seq id no.9所示，反应引物碱基序列如seq id no.10所示，第二引物对包括两组，第一组的正向引物碱基序列如seq id no.11所示，反应引物碱基序列如seq id no.8所示，第二组的正向引物碱基序列如seq id no.9所示，反应引物碱基序列如seq id no.12所示。
18.一种甜菊糖苷转化为葡萄糖基甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：以可溶性淀粉和甜菊糖苷的溶液为底物，加入上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体，振荡加热反应。
19.采用本发明的环糊精葡糖糖基转移酶突变体进行甜菊糖苷的转化，所制备的葡萄糖基甜菊糖苷产物中，stevg1、rebag1、stevg2的含量相对野生型转移酶有所提升，产物的涩味和杂味有所降低，甜味提高，产物的口味和整体品质得到提升。
20.作为本发明方法的优选可溶性淀粉的浓度为15～30g/l、甜菊糖苷的浓度为15～30g/l，环糊精葡萄糖基转移酶突变体的浓度为15～30mg/l；所用甜菊糖苷可选自甜菊苷、瑞鲍迪苷a或它们的混合物；反应温度为35～50℃，反应时间18～30h。
21.本发明的有益效果如下：本发明所得到的突变体y189f/g255a将甜菊糖苷转化为葡萄糖基甜菊糖苷时，葡萄糖基甜菊糖苷中stevg1、rebag1、stevg2的含量增加，葡萄糖基甜菊糖苷的涩味明显降
低，同时杂味有所降低，甜味上升，葡萄糖基甜菊糖苷的口味和整体品质得到提升。
附图说明
22.图1是突变位点处测序峰图(左：大肠杆菌宿主；右：毕赤酵母宿主)。
23.图2是突变前后酶的sds-page检测图(上：大肠杆菌宿主，镍柱纯化；下：毕赤酵母宿主，胞外酶液)。
24.图3是突变前后短链葡萄糖基甜菊糖苷的峰面积比较。
25.图4是突变前后口感对比网状图。
具体实施方式
26.下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
27.如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
28.本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，该突变体为seq id no.1所示的野生型环糊精葡萄糖基转移酶的第189位和第255位突变后的产物，该野生型环糊精葡萄糖基转移酶cgtase-13来源于大岛盐碱芽孢杆菌alkalihalobacillus oshimensis，保藏编号为cgmcc no.23164，具体见中国专利申请cn202111292313.5。在甜菊糖苷转化为葡萄糖基甜菊糖苷时，产物中stevg1、rebag1、stevg2的含量增加，涩味明显降低，杂味有所降低，口味和整体品质得到提升。
29.在本发明提供的一些实施方案中，突变体为氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型环糊精葡萄糖基转移酶的第189位由酪氨酸突变为苯丙氨酸、第255位由甘氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白(a)，即突变体cgtase-13
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，氨基酸序列如seq id no.2所示。
30.在本发明提供的一些实施方案中，突变体为蛋白(a)的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加所形成的，与蛋白(a)的氨基酸序列具有至少90％的同源性，且对应蛋白(a)的第189位、第255位位点的氨基酸与蛋白(a)相同，且具有蛋白(a)相同或相近功能的蛋白(b)。
31.本发明还提供了编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的碱基序列。
32.本发明还提供含有上述碱基序列的表达载体。
33.在本发明提供的一些实施方案中，表达载体为pgex质粒、phy300质粒、ppic3k质粒、ppic9k质粒、phy300plk质粒、pet质粒或duet质粒；优选的，pet质粒为pet-15或pet-19或pet-20或pet-24或pet-28或pet-32；优选的，duet质粒为prsfduet-1或pacycduet-1，优选的，pgex质粒为pgex-4t-2或pgex-6p。
34.本发明还提供了含有上述碱基序列或上述表达载体的宿主细胞。
35.在本发明提供的一些实施方案中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。该宿主细胞为重组原核细胞或真核细胞；原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌；优选的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞或毕赤酵母菌细胞。
36.本发明还提供了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的构建方法，包括将含编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的碱基序列的表达载体经电击或化学转化法转入宿主细胞表达。
37.在本发明提供的一些实施方案中，可通过如下具体的方法构建：将含有编码氨基酸序列seq id no.1的碱基序列的表达载体经使第189位发生突变的第一引物对定点突变，转移到克隆宿主中进行扩增，提取宿主细胞中的表达载体测序，筛选突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变的表达载体，然后经使第255位发生突变的第二引物对定点突变，转移到克隆宿主中进行扩增，提取宿主细胞中的表达载体测序，筛选突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变的表达载体，然后转移到表达宿主中诱导表达，收集酶液；当表达宿主为大肠杆菌bl21(de3)时，第一引物对的正向引物碱基序列如seq id no.3所示，反向引物碱基序列如seq id no.4所示，第二引物对的正向引物碱基序列如seq id no.5所示，反向引物碱基序列如seq id no.6所示；当表达宿主为毕赤酵母菌时，第一引物对包括两组，第一组的正向引物碱基序列如seq id no.7所示，反应引物碱基序列如seq id no.8所示，第二组的正向引物碱基序列如seq id no.9所示，反应引物碱基序列如seq id no.10所示，第二引物对包括两组，第一组的正向引物碱基序列如seq id no.11所示，反应引物碱基序列如seq id no.8所示，第二组的正向引物碱基序列如seq id no.9所示，反应引物碱基序列如seq id no.12所示。
38.在本发明提供的一些实施方案中，大量突变体cgtase-13
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的获得可通过发酵培养的方式，具体的如：将携带上述碱基序列或上述表达载体的表达宿主接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的上清液或从菌体中分离得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体。
39.本发明还提供了一种甜菊糖苷转化为葡萄糖基甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：以可溶性淀粉和甜菊糖苷的溶液为底物，加入上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体，振荡加热反应。优选的，可溶性淀粉的浓度为15～30g/l、甜菊糖苷的浓度为15～30g/l，环糊精葡萄糖基转移酶突变体的浓度为15～30mg/l；优选的，甜菊糖苷为甜菊苷、瑞鲍迪苷a或它们的混合物；优选的，反应温度为35～50℃，反应时间18～30h。
40.下面通过具体的实施案例进一步说明实施例1构建以大肠杆菌bl21(de3)为表达宿主的突变体cgtase-13
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的表达载体(1)cgtase-13
y189f
大肠杆菌表达载体的构建以含有编码氨基酸序列seq id no.1的碱基序列的重组质粒为模板质粒，利用全式金的单点突变试剂盒(fast mutagenesis system)，利用设计的相应突变引物对，pcr扩增出cgtase的定点突变序列，具体操作步骤如下：
①
突变引物对(第一引物对)正向引物13#-e-y189-f(seq id no.3)为：5
’‑
catttatcgcaacctgtttgatctggcgg-3’，反向引物13#-e-y189f-r(seq id no.4)为：5
’‑
aacaggttgcgataaatgctatcttcata-3’。
41.②
反应体系如下：表1 pcr反应体系试剂体积
plasmid(pet-28a-cgtase-13)1μl(浓度10ng/μl)forward primer1μlreverse primer1μl2*transstart fastpfu fly pcr supermix25μlnuclease-free water22μl
③
pcr条件如下：表2 pcr条件pcr条件
④
pcr产物的消化：加1μl dmt酶于pcr产物中，混匀，37℃孵育1h。
42.⑤
转化：i)加入2-5μl dmt酶消化产物于50μl dmt感受态细胞中(在感受态刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴20-30min；ii)42℃热激45s，立即冰浴2min；iii)加250μl平衡至室温的soc或lb培养基，200rpm、37℃培养1h；iv)将适宜抗性的平板在37℃培养箱中预热(使用卡那霉素抗性，工作浓度50ng/μl，100ml培养基中加入500μl 10mg/ml的母液)；v)将菌液于平板上划线，在37℃过夜培养。
43.⑥
挑菌：第二天观察过夜的平板，发现均有菌落长出，每个平板上挑取5个单克隆，分别置于1ml lb(卡那霉素，2ml管)中37℃、220rpm培养，提质粒送测序，确定所获得的质粒在目的突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变。
44.(2)cgtase-13
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大肠杆菌表达载体的构建以pet-28a-cgtase-13
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质粒为模板质粒，利用全式金的单点突变试剂盒(fast mutagenesis system)，利用设计的相应突变引物对pcr扩增出cgtase的定点突变序列，具体的突变引物对(第二引物对)为正向引物13#-e-g255a-f(seq id no.5)为：5
’‑
tggcgagcggcgaagtggatccgcagaaccatcatt-3’，反向引物13#-e-g255a-r(seq id no.6)为：5
’‑
tgcggatccacttcgccgctcgccagaaaccattcg-3’其余步骤同上，结果如附图1所示。
45.实施例2突变体的表达和纯化，将突变质粒转化表达宿主-大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，转化步骤同上。
46.蛋白诱导表达：(1)菌株和条件
①
需要诱导表达的蛋白共2个(cgtase-13和cgtase-13
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)：
将含有相应质粒的大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞接种到4ml lb+50μg/ml卡那霉素的培养基中，30℃、220rpm过夜培养。
47.②
将过夜培养的全部菌液分别转接到400ml lb+50μg/ml卡那霉素的培养基中，30℃、220rpm培养4h。
48.③
加入iptg至终浓度为0.1mm，16℃、220rpm培养20h。
49.(2)超声破碎细胞
①
将诱导蛋白表达后的菌液于常温下，10000
×
g离心5min，收集细胞。
50.②
加入30ml 20mm pbs(含20mm咪唑)重悬细胞，置于冰水浴中。
51.③
用直径为6mm的变幅杆、强度为20％，超声2s暂停3s的条件超声破碎15min；
④
在4℃条件下22000rpm离心20min，将上清液用0.22μm滤膜过滤，存于4℃备用。
52.(3)蛋白纯化
①
将超声破碎后的上清液，用0.22μm滤膜过滤，随后上样到akta系统中。
53.②
待上样完成后，用20mm咪唑pbs缓冲液洗涤，观察紫外吸收，直到紫外吸收值降低到初始水平。
54.③
更换为40mm咪唑pbs缓冲液，继续洗涤，待出现一个吸收峰后，紫外吸收值降低到初始水平。
55.④
更换为250mm咪唑pbs缓冲液，洗脱，待紫外吸收值指数上升时，开始收集洗脱液，每2ml一管，直至紫外吸收变平。更换500mm咪唑pbs缓冲液，洗脱，待紫外吸收值指数上升时，开始收集洗脱液，每2ml一管，直至紫外吸收变平。
56.(4)sds-page
①
取20μl上述蛋白纯化收集液，加入到10μl 6
×
蛋白质上样缓冲液混匀，95℃10min。
57.②
取2块预制的分离胶浓度为12％的聚丙烯酰胺凝胶，装入电泳槽中。
58.③
按顺序上样，结果如附图2所示。
59.实施例3甜菊糖苷转化为葡糖糖基甜菊糖苷的方法(1)用水配制20g/l可溶性淀粉+20g/l甜菊糖苷(浩天sg90)溶液作为底物，定容到100％(v/v)，沸水浴10min。
60.(2)待底物冷却后，加入20mg/l酶液，该酶来源于实施例2中纯化后的蛋白；以50mm ph7.0的pbs代替酶液为对照。
61.(3)将离心管置于3l三角瓶中，三角瓶置于40℃摇床中，220rpm反应22h后，于常温下，最大转速离心2min。
62.(4)取100μl上清液，加入900μl水，用0.22μm滤膜过滤后参照标准gb2760-2014中葡萄糖基甜菊糖苷梯度hplc测定步骤进行测定。
63.所产生短链葡萄糖基甜菊糖苷的含量由高效液相色谱检测中其所对应的峰面积大小来表示，结果如附图3所示，与突变前相比，突变后产物中stevg1、rebag1、stevg2含量增加。
64.实施例4构建以毕赤酵母菌细胞为表达宿主的突变体cgtase-13
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的表达载体
(1)cgtase-13
y189f
毕赤酵母表达载体的构建以含有seq id no.1的重组质粒为模板质粒，利用全式金的多点突变试剂盒(fast multisite mutagenesis system)，利用设计的相应突变引物对，pcr扩增出cgtase的定点突变序列，具体操作步骤如下：
①
突变引物对(第一引物对)片段1(第一组)：正向引物13#-p-y189f-f(seq id no.7)为：5
’‑
tatttgatttggctgattatgacttgaacaataaag-3’，反向引物p-r(seq id no.8)为：5
’‑
agcagcacgccatagtgactggcg-3’片段2(第二组)：正向引物p-f(seq id no.9)为：5
’‑
cgccagtcactatggcgtgctgct-3’，反向引物13#-p-y189f-r(seq id no.10)为：5
’‑
aagtcataatcagccaaatcaaataagttcctataa-3’。
65.②
反应体系如下：表3 pcr反应体系试剂体积plasmid(ppic9k-cgtase-13)1μl(浓度10ng/μl)forward primer1μlreverse primer1μl2*transstart fastpfu fly pcr supermix25μlnuclease-free water22μl
③
pcr条件如下：表4 pcr条件pcr条件
④
电泳检测：取3-5μl pcr产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。
66.⑤
pcr产物的消化：加1μl dmt酶于pcr产物中，混匀，37℃孵育1h。
67.⑥
纯化片段：跑琼脂糖凝胶电泳，然后切胶，利用omega gel extraction kit回收片段，步骤如下：i)向装有胶条的1.5ml管中加入600μl的bingding buffer(xp2)，以没过胶条为宜，65℃水浴，直至胶条完全融化；ii)将dna mini column装在标配的2ml收集管中，将700μl混合液加入离心柱内，10000
×
g离心15s，用500μl的bingding buffer(xp2)洗膜一遍；
iii)加入700μl的spw wash buffer，10000
×
g离心15s，重复一遍；iv)10000
×
g空离2min；v)65℃金属浴晾干2min；vi)用去离子水30μl洗脱，重复一遍。
68.测试浓度：片段1：5.2ng/μl；片段2：28.4ng/μl。
69.⑦
突变片段组装：表5片段组装体系试剂体积2*assembly mix5μl片段14μl片段21μl混匀，50℃保持15min。反应结束后，冰浴数秒，用于转化。
70.⑧
转化：步骤同上(构建毕赤酵母宿主中表达的突变体使用的是氨苄青霉素钠抗性，工作浓度100μg/ml)。
71.⑨
挑菌：步骤同上。提质粒送测序，确定所获得的质粒在目的突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变。
72.(2)cgtase-13
y189f/g255a
毕赤酵母表达载体的构建以ppic9k-cgtase-13
y189f
质粒为模板质粒，利用全式金的多点突变试剂盒(fast multisite mutagenesis system)，利用设计的相应突变引物对，pcr扩增出cgtase的定点突变序列，具体操作步骤如下：突变引物对(第二引物对)片段1(第一组)：正向引物13#-p-g255a-f(seq id no.11)为：5
’‑
tggcttctggtgaagttgatccacaaaatcatcatt-3’，反向引物p-r(seq id no.8)为：5
’‑
agcagcacgccatagtgactggcg-3’片段2(第二组)：正向引物p-f(seq id no.9)为：5
’‑
cgccagtcactatggcgtgctgct-3’，反向引物13#-p-g255a-r(seq id no.12)为：5
’‑
tgtggatcaacttcaccagaagccaaaaaccattca-3’其余步骤同上，结果如附图1所示。
73.实施例5突变体的表达(毕赤酵母)将携带野生酶碱基序列的质粒及携带突变体碱基序列的质粒分别用saci酶切，回收线性化的dna片段，然后将其通过化转的方法转化毕赤酵母菌株gs115(购自唯地生物)，涂布md平板(13.4g/l酵母基本氮源(ynb)；0.4mg/l生物素；20g/l葡萄糖)，28℃培养3天后，获得转化子，经ypd-g418平板筛选和mm/md平板筛选后，pcr验证获得重组菌株(mut+表型)。将重组菌株接种至25ml bmgy培养基中(250ml摇瓶)，28-30℃，250rpm摇至od600＝2-6。室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用bmmy重悬细胞置od600＝1.0，进行诱导表
达(大约100-200ml)。在1l摇瓶中加入上述培养物，加盖4层灭菌纱布，放入摇床继续生长。每24h加甲醇至终浓度1％，诱导培养96h。
74.离心，收集胞外酶液，进行sds-page分析，结果如附图2所示。
75.实施例6感官实验(1)粗酶液的浓缩将实施例5中获得的酶液用超滤离心管millipore 15ml/10kd进行酶液浓缩(浓缩100倍)，并交换buffer(》1000倍)除去培养基成分，使酶处于超纯水中，避免后续反应中引入杂质。
76.(2)转糖基反应表6转糖基反应体系(3)感官样品制备经过离心、过滤、冻干获得葡萄糖基甜菊糖苷粗品粉末，将其最终配制成5度蔗糖的甜度进行感官实验。结果如图4和表7所示。
77.表7感官实验结果汇总样品cgtase-13cgtase-13
y189f/g255a
甜度5.96.0起甜速度5.25.0后甜2.72.7苦味1.21.2涩味2.52.0杂味2.12.0整体喜好74.977.8从图4和表7可以看出，采用突变体cgtase-13
y189f/g255a
制备的葡萄糖基甜菊糖苷，甜度增加，涩味明显降低，杂味有所降低，整体喜好度提升，所得葡萄糖基甜菊糖苷的口感和品质明显好于突变前。
78.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型环糊精葡萄糖基转移酶的第189位由酪氨酸突变为苯丙氨酸、第255位由甘氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白（a）；或者，所述突变体为蛋白（a）的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加所形成的，与蛋白（a）的氨基酸序列具有至少90%的同源性，且对应蛋白（a）的第189位、第255位位点的氨基酸与蛋白（a）相同，且具有蛋白（a）相同或相近功能的蛋白（b）。2.编码如权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的碱基序列。3.含有如权利要求2所述的碱基序列的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，表达载体为pgex质粒、phy300质粒、ppic3k质粒、ppic9k质粒、phy300plk质粒、pet质粒或duet质粒。5.含有如权利要求2所述的碱基序列或如权利要求3或4所述的表达载体的宿主细胞。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)细胞或毕赤酵母菌细胞。8.一种如权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的构建方法，其特征在于，将含有编码如权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的碱基序列的表达载体通过电击或化学转化法转入宿主细胞表达。9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将含有编码氨基酸序列seq id no.1的碱基序列的表达载体经使第189位发生突变的第一引物对定点突变，转移到大肠杆菌克隆宿主中进行扩增，提取表达载体测序，筛选突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变的表达载体，然后经使第255位发生突变的第二引物对定点突变，转移到大肠杆菌克隆宿主中进行扩增，提取表达载体测序，筛选突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变的表达载体，然后转移到表达宿主中诱导表达，收集酶液；当表达宿主为大肠杆菌bl21(de3)时，第一引物对的正向引物碱基序列如seq id no.3所示，反向引物碱基序列如seq id no.4所示，第二引物对的正向引物碱基序列如seq id no.5所示，反向引物碱基序列如seq id no.6所示；当表达宿主为毕赤酵母菌时，第一引物对包括两组，第一组的正向引物碱基序列如seq id no.7所示，反应引物碱基序列如seq id no.8所示，第二组的正向引物碱基序列如seq id no.9所示，反应引物碱基序列如seq id no.10所示，第二引物对包括两组，第一组的正向引物碱基序列如seq id no.11所示，反应引物碱基序列如seq id no.8所示，第二组的正向引物碱基序列如seq id no.9所示，反应引物碱基序列如seq id no.12所示。10.一种甜菊糖苷转化为葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：以可溶性淀粉和甜菊糖苷的溶液为底物，加入如权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，振荡加热反应。

技术总结
本发明涉及环糊精葡萄糖基转移酶技术领域，公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO.1的野生型环糊精葡萄糖基转移酶的第189位、第255位突变到的蛋白（a）；或者突变体为蛋白（a）的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加所形成的，与蛋白（a）的氨基酸序列具有至少90%的同源性，且对应蛋白（a）的第189位、第255位位点的氨基酸与蛋白（a）相同，且具有蛋白（a）相同或相近功能的蛋白（b）。本发明的突变体转化甜菊糖苷为葡萄糖基甜菊糖苷时，产物中StevG1、RebAG1、StevG2含量增加，葡萄糖基甜菊糖苷的口味和整体品质得到提升。口味和整体品质得到提升。


技术研发人员：张睿钦 唐瑞琪 曲茂华 毕家华 武文慧 刘冠辰 李言郡 沈珊珊 阮叶萍
受保护的技术使用者：杭州娃哈哈集团有限公司
技术研发日：2022.09.27
技术公布日：2023/7/22