一种氟马西尼中间体I的检测方法与流程

一种氟马西尼中间体i的检测方法
技术领域
1.本发明涉及药物分析检测领域，具体涉及一种氟马西尼中间体i的检测方法。


背景技术：

2.氟马西尼，化学名称为8-氟-5,6-二氢-5-甲基-6-氧代-4h-咪唑并[1,5-a][1，4]苯并二氮口-3-羧酸乙酯，能够高效结合中枢苯二氮(bdz)受体，竞争性抑制γ-氨基丁酸-苯二氮复合物(gaba-bdz)识别bdz受体药物，进而减少γ-氨基丁酸(gaba)的释放，逆转gaba释放带来的中枢抑制作用，在临床、科研上主要用于拮抗bdz受体激动产生的各类症状。
[0003]
5-氟靛红酸酐是合成氟马西尼的重要中间体(以下简称为中间体i)。但是，在合成所述氟马西尼中间体i的过程中，会产生2-氨基-5-氟苯甲酸和5-氟靛红两种杂质。因此，5-氟靛红酸酐作为重要的中间体，其纯度和含有的杂质将直接影响氟马西尼的纯度和杂质含量，从而影响该药物疗效。cn101206202a中公开了一种靛红酸酐的检测方法，技术人员研究发现通过该方法无法将中间体i完全分离检测出来，为了能准确控制中间体i的质量，需要研发出其的检测方法。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术问题，本技术提供了一种氟马西尼中间体i的检测方法，用于氟马西尼中间体i的质量控制。
[0005]
为了实现上述发明目的，本技术提供了一种氟马西尼中间体i的检测方法，所述氟马西尼中间体i为5-氟靛红酸酐，其结构式为
[0006][0007]
所述检测方法采用反相高效液相色谱法进行检测，所述反相高效液相色谱的条件包括：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，以流动相进行洗脱；其中，所述流动相为流动相a和流动相b的混合物；所述流动相a为磷酸二氢钾水溶液，所述流动相b为乙腈，所述流动相a的ph为4.0～5.0。
[0008]
在一种示例性实施例中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.01mol/l～0.03mol/l。
[0009]
在一种示例性实施例中，所述流动相a的ph采用调节剂进行调节，所述调节剂选自磷酸、乙酸、甲酸、盐酸、草酸、氨水、氢氧化钾中的一种或多种，优选地，为磷酸和/或氢氧化
钾。
[0010]
在一种示例性实施例中，其中，所述反相高效液相色谱的检测波长为220nm～240nm，优选地，为230nm。
[0011]
在一种示例性实施例中，其中，所述反相高效液相色谱的柱温为35℃～45℃，优选地，为40℃。
[0012]
在一种示例性实施例中，其中，所述流动相的流速为0.9ml/min～1.1ml/min，优选地，为0.9ml/min、1.0ml/min或1.1ml/min，更优选地，为1.0ml/min。
[0013]
在一种示例性实施例中，其中，所述色谱柱固定相的规格为4.6
×
250mm，5μm。
[0014]
在一种示例性实施例中，其中，所述检测方法包括如下步骤：
[0015]
1)取氟马西尼中间体i适量，用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为0.2mg/ml～1.2mg/ml的供试品溶液，优选地，为1.0mg/ml；
[0016]
2)设置所述反相高效液相色谱的条件为：检测波长为220nm～240nm，柱温为35～45℃，流速为0.9～1.1ml/min；所述流动相a为ph为4.0～5.0的0.01mol/l～0.03mol/l磷酸二氢钾水溶液，流动相b为乙腈；
[0017]
3)取步骤1)中的所述供试品溶液10μl注入如所述步骤2)设置的液相色谱仪中，梯度洗脱，进行氟马西尼中间体i的分析检测。
[0018]
在一种示例性实施例中，所述检测方法包括采用反相高效液相色谱法进行梯度洗脱，所述梯度洗脱设置如下：
[0019][0020]
优选地，所述梯度洗脱设置如下：
[0021][0022]
在一种示例性实施例中，所述步骤2)中，所述流速为1.0ml/min，所述检测波长为230nm，所述柱温为40℃，所述流动相a为ph4.4的0.02mol/l磷酸二氢钾水溶液，流动相b为乙腈；
[0023]
所述梯度洗脱设置如下：
[0024][0025]
本技术所述的方法，可以有效的分离氟马西尼中间体i及其杂质，而且所述方法的分离度及灵敏度高，重复性及耐用性好，分析操作简单，结果稳定可靠，可用于氟马西尼中间体i的质量控制，为最终成品提供有效保障。
[0026]
本技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本技术而了解。本技术的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
[0027]
附图用来提供对本技术技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本技术的技术方案，并不构成对本技术技术方案的限制。
[0028]
图1为本技术实施例1氟马西尼中间体i的hplc图谱；
[0029]
图2为本技术实施例2氟马西尼中间体i的hplc图谱；
[0030]
图3为本技术实施例3氟马西尼中间体i的hplc图谱；
[0031]
图4为对比例1氟马西尼中间体i的hplc图谱；
[0032]
图5为对比例2氟马西尼中间体i的hplc图谱；
[0033]
图6为本技术实验例中氟马西尼中间体i线性与范围工作曲线。
具体实施方式
[0034]
本技术描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本技术所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征可以与任何其它实施例中的任何其他特征结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征。
[0035]
本技术提供了一种氟马西尼中间体i的检测方法，所述氟马西尼中间体i为5-氟靛红酸酐，其结构式为
[0036]
所述检测方法采用反相高效液相色谱法进行检测，所述反相高效液相色谱的条件包括：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，以流动相进行洗脱；其中，所述流动相为流动相a和流动相b的混合物；所述流动相a为磷酸二氢钾水溶液，所述流动相b为乙腈，所述流动相a的ph为4.0～5.0。
[0037]
在一种示例性实施例中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.01mol/l～0.03mol/l。
[0038]
在一种示例性实施例中，所述流动相a的ph采用调节剂进行调节，所述调节剂选自磷酸、乙酸、甲酸、盐酸、草酸、氨水、氢氧化钾中的一种或多种，优选地，为磷酸和/或氢氧化钾。
[0039]
在一种示例性实施例中，其中，所述反相高效液相色谱的检测波长为220nm～240nm，优选地，为230nm；柱温为35℃～45℃，优选地，为40℃；所述流动相的流速为0.9ml/min～1.1ml/min，优选地，为0.9ml/min、1.0ml/min或1.1ml/min，更优选地，为1.0ml/min；所述色谱柱固定相的规格为4.6
×
250mm，5μm。
[0040]
在一种示例性实施例中，其中，所述检测方法包括如下步骤：
[0041]
1)取氟马西尼中间体i适量，用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为0.2mg/ml～1.2mg/ml的供试品溶液，优选地，浓度为1.0mg/ml；
[0042]
2)设置所述反相高效液相色谱的条件为：检测波长为220nm～240nm，柱温为35～45℃，流速为0.9～1.1ml/min；所述流动相a为ph为4.0～5.0的0.01mol/l～0.03mol/l磷酸
二氢钾水溶液，流动相b为乙腈；
[0043]
3)取步骤1)中的所述供试品溶液10μl注入如所述步骤2)设置的液相色谱仪中，梯度洗脱，进行氟马西尼中间体i的分析检测。
[0044]
在一种示例性实施例中，所述方法包括采用反相高效液相色谱法进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：
[0045][0046]
优选地，所述梯度洗脱设置如下：
[0047][0048]
在一种示例性实施例中，所述步骤2)中，所述流速为1.0ml/min，所述检测波长为230nm，所述柱温为40℃，所述流动相a为ph为4.4的0.02mol/l磷酸二氢钾水溶液，流动相b为乙腈；
[0049]
所述梯度洗脱设置如下：
[0050][0051]
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0052]
实施例1
[0053]
仪器与条件：dionex ultimate3000液相色谱系统，色谱柱：waters xselect csh(c18,4.6
×
250mm,5μm)，检测波长230nm，柱温40℃，流动相流速1.0ml/min，流动相a为0.02mol/l磷酸二氢钾水溶液(ph约为4.4)，流动相b为乙腈，梯度洗脱设置如下：
[0054][0055]
实验步骤：1)将所述氟马西尼中间体i用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；
[0056]
2)精密量取所述供试品溶液10μl注入上述条件的高效液相色谱仪中进行分析，记录色谱图，结果见附图1。
[0057]
根据附图1可知，在该色谱条件下，所述氟马西尼中间体i峰和杂质峰可以完全分离。其中，氟马西尼中间体i峰的分离度为3.39，保留时间在20.013min。
[0058]
实施例2
[0059]
仪器与条件：dionex ultimate 3000液相色谱系统，色谱柱：waters xselect csh(c18,4.6
×
250mm,5μm)，检测波长230nm，柱温40℃，流动相流速1.1ml/min，流动相a为ph＝5.0的0.03mol/l磷酸二氢钾水溶液，其中流动相a的ph通过0.01mol/l氢氧化钾溶液调节，流动相b为乙腈，梯度洗脱设置如下：
[0060][0061]
实验步骤：1)将所述氟马西尼中间体i用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；
[0062]
2)精密量取所述供试品溶液10μl注入上述条件的高效液相色谱仪中进行分析，记录色谱图，结果见附图2。
[0063]
根据附图2可知，在该色谱条件下，所述氟马西尼中间体i峰和杂质峰可以完全分离，所述氟马西尼中间体i峰的分离度为3.40，保留时间在14.807min。
[0064]
实施例3
[0065]
仪器与条件：dionex ultimate3000液相色谱系统，色谱柱：waters xselect csh(c18,4.6
×
250mm,5μm)，检测波长230nm，柱温40℃，流速0.9ml/min，流动相a为ph＝4.0的0.01mol/l磷酸二氢钾水溶液，其中，所述流动相a的ph通过磷酸调节，流动相b为乙腈，梯度洗脱设置如下：
[0066][0067]
实验步骤：1)将所述氟马西尼中间体i用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；
[0068]
2)精密量取所述供试品溶液10μl注入上述条件的高效液相色谱仪中进行分析，记录色谱图，结果见附图3。
[0069]
根据附图3可知，在该色谱条件下，所述氟马西尼中间体i峰和杂质峰可以完全分离，所述氟马西尼中间体i峰的分离度为3.45，保留时间在21.113min。
[0070]
对比例1:
[0071]
仪器与条件：dionex ultimate 3000液相色谱系统，色谱柱：kromasil100-5-c18，(c18,4.6
×
250mm,5μm)，检测波长230nm，柱温40℃，流速1.0ml/min，流动相a为0.01％三氟乙酸溶液(ph约为2.8)，流动相b为乙腈，梯度洗脱设置如下：
[0072][0073]
实验步骤：1)将所述氟马西尼中间体i用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；
[0074]
2)精密量取所述供试品溶液10μl注入上述条件的高效液相色谱仪中进行分析，记录色谱图，结果见附图4。
[0075]
根据附图4可知，在该色谱条件下，所述氟马西尼中间体峰i的前沿峰与杂质峰重合，无法将氟马西尼中间体i和杂质分离。
[0076]
对比例2
[0077]
采用cn101206202a中公开的检测方法检测氟马西尼中间体i。
[0078]
仪器与条件：dionex ultimate 3000液相色谱系统，色谱柱：inertsil ods-3(c18，4.6
×
250mm,5μm)，检测波长254nm，柱温30℃，流速0.6ml/min，流动相为乙酸水溶液(ph约为4.0)：甲醇＝35:65(v/v)，等度洗脱。
[0079]
实验步骤：1)将所述氟马西尼中间体i用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；
[0080]
2)精密量取所述供试品溶液10μl注入上述条件的高效液相色谱仪中进行分析，记录色谱图，结果见附图5。
[0081]
根据附图5可知，在该色谱条件下，所述氟马西尼中间体i峰与杂质峰未完全分离，峰形前延不对称，峰宽较大，无法很好地分离检测出氟马西尼中间体i，也无法判断色谱峰中是否含有其他未分离出的物质，造成分析结果不准确。
[0082]
实验例:方法学验证性
[0083]
实验例1.系统适用性实验
[0084]
1.1仪器与条件：同实施例1。
[0085]
实验步骤：精密称取中间体i，用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为1.0mg/ml的供试品溶液。取所述供试品溶液10μl注入该条件下的高效液相色谱仪中，连续进样六次，记录色谱图，进行分析。分别计算所述氟马西尼中间体i的峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表1。
[0086]
表1.氟马西尼中间体i系统适用性实验结果
[0087][0088]
由表1可知，所述氟马西尼中间体i峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均高于2500，峰面积的相对标准偏差为0.18％(限度2.0％)，保留时间的相对标准偏差为0.05％(限度1.0％)。可见，在实施例1的色谱条件下，所述氟马西尼中间体i及其杂质可以完全分离，而且相对标准偏差均在中国药典规定的限度内，所得结果稳定可靠。
[0089]
1.2仪器与条件：同实施例2。
[0090]
实验步骤：精密称取中间体i，用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为1.0mg/ml的供试品溶液。取所述供试品溶液10μl注入该条件下的高效液相色谱仪中，连续进样六次，记录色谱图，进行分析。分别计算所述氟马西尼中间体i的峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表2。
[0091]
表2.氟马西尼中间体i系统适用性实验结果
[0092][0093][0094]
由表2可知，所述氟马西尼中间体i峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均高于2500，峰面积的相对标准偏差为0.18％(限度2.0％)，保留时间的相对标准偏差为0.15％(限度1.0％)。可见，在实施例2的色谱条件下，所述氟马西尼中间体i及其杂质可以
完全分离，而且相对标准偏差均在中国药典规定的限度内，所得结果稳定可靠。
[0095]
1.3仪器与条件：同实施例3。
[0096]
实验步骤：精密称取中间体i，用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为1.0mg/ml的供试品溶液。取所述供试品溶液10μl注入该条件下的高效液相色谱仪中，连续进样六次，记录色谱图，进行分析。分别计算所述氟马西尼中间体i的峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表3。
[0097]
表3.氟马西尼中间体i系统适用性实验结果
[0098][0099]
由表3可知，所述氟马西尼中间体i峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均高于2500，峰面积的相对标准偏差为1.29％(限度2.0％)，保留时间的相对标准偏差为0.11％(限度1.0％)。可见，在实施例3的色谱条件下，所述氟马西尼中间体i及其杂质可以完全分离，而且相对标准偏差均在中国药典规定的限度内，所得结果稳定可靠。
[0100]
实验例2.重复性实验
[0101]
仪器与条件：同实施例1。
[0102]
实验步骤：精密称取氟马西尼中间体i，用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为1.0mg/ml的供试品溶液。同法配制6份供试品溶液1-6。分别将所述供试品溶液1-610μl注入上述条件的高效液相色谱仪中，并分别连续进样六次，记录色谱图，进行分析。按面积归一化法计算氟马西尼中间体i的含量，并计算其相对标准偏差，实验结果见表4。
[0103]
表4.中间体i重复性实验结果
[0104][0105]
由表4可知，各供试品溶液中氟马西尼中间体i的含量没有明显差异，相对标准偏差为0.05％，可见本分析检测方法的重复性良好。
[0106]
实验例3.耐用性实验
[0107]
仪器与条件：dionex ultimate3000液相色谱系统，色谱柱：waters xselect csh(c18,4.6
×
250mm,5μm)，流动相及梯度设置同实施例1。
[0108]
实验步骤：精密称取氟马西尼中间体i，用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为1.0mg/ml的供试品溶液。取所述供试品溶液10μl注入上述条件的高效液相色谱仪中，记录色谱图，进行分析。分别通过改变柱温和流速，记录所述氟马西尼中间体i中的有关物质及含量的变化情况(按面积归一化法计算)，实验结果见表5。
[0109]
表5.氟马西尼中间体i耐用性实验结果
[0110][0111]
由表5可知，改变柱温和流速后，所述氟马西尼中间体i的有关物质及含量的测定结果没有明显差异，可见本发明分析检测方法的耐用性良好。
[0112]
实验例4.线性与范围
[0113]
仪器与条件：同实施例1。
[0114]
实验步骤：取所述氟马西尼中间体i 100mg，精密称定，置于50ml量瓶中，加入乙腈
溶解并稀释至刻度，即得线性储备液。精密称量所述线性储备液1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml分别置10ml量瓶中，并分别加入乙腈稀释至刻度，摇匀，分别取上述浓度的所述线性储备液10μl注入上述条件的高效液相色谱仪中，记录色谱图，进行分析。
[0115]
以所述供试品溶液的浓度为横坐标，以所述氟马西尼中间体i峰的峰面积为纵坐标进行线性回归(见图6)，得线性回归方程为y＝367.77x+28.548。
[0116]
由附图6可知，趋势线的相关系数r＝0.9987，可见在该色谱条件下，所述氟马西尼中间体i在0.2000～1.2000mg/ml的浓度范围内线性关系良好。
[0117]
实验例5.检测限的测定
[0118]
仪器与条件：同实施例1
[0119]
实验步骤：精密称取氟马西尼中间体i25mg，置于25ml量瓶中，加入一定的乙腈溶解并用50％乙腈水稀释至刻度，作为检测限储备液。采用加溶剂逐步稀释法进行检测。其中，加溶剂逐步稀释法具体步骤为：精密量取储备液1ml置于10ml容量瓶中，用50％乙腈水稀释至刻度，得到浓度为0.1mg/ml溶液，再取上述溶液1ml置于10ml容量瓶中，用50％乙腈水稀释至刻度，得到浓度为0.01mg/ml的溶液，依上述方法逐步稀释；将上述各步稀释得到的溶液分别注入液相色谱仪，观察并计算峰高(s)和基线噪音(n)之间的比值。
[0120]
以信噪比s/n≈3时的浓度作为检测限浓度，此时的氟马西尼中间体i的浓度为1μg/ml，检测限为10ng。可见本方法及仪器的灵敏度较高。

技术特征：
1.一种氟马西尼中间体i的检测方法，所述氟马西尼中间体i的结构式为所述检测方法采用反相高效液相色谱法进行检测，所述反相高效液相色谱的条件包括：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，以流动相进行洗脱；其中，所述流动相为流动相a和流动相b的混合物，所述流动相a为磷酸二氢钾水溶液，所述流动相b为乙腈，所述流动相a的ph为4.0～5.0。2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.01mol/l～0.03mol/l。3.根据权利要求1所述的检测方法，所述流动相a的ph采用调节剂进行调节，所述的调节剂选自磷酸、乙酸、甲酸、盐酸、草酸、氨水、氢氧化钾中的一种或多种，优选地，为磷酸和/或氢氧化钾。4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述反相高效液相色谱的检测波长为220nm～240nm，优选地，为230nm。5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述反相高效液相色谱的柱温为35℃～45℃，优选地，为40℃。6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相的流速为0.9ml/min～1.1ml/min，优选地，为0.9ml/min、1.0ml/min或1.1ml/min，更优选地，为1.0ml/min。7.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述色谱柱的规格为4.6
×
250mm，5μm。8.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：1)取氟马西尼中间体i适量，用乙腈溶解，配制成氟马西尼中间体i的浓度为0.2mg/ml～1.2mg/ml的供试品溶液；2)设置所述反相高效液相色谱的条件为：检测波长为220nm～240nm，柱温为35～45℃，流速为0.9～1.1ml/min；所述流动相a是ph为4.0～5.0的0.01mol/l～0.03mol/l磷酸二氢钾水溶液，流动相b为乙腈；3)取步骤1)中所述供试品溶液10μl注入如步骤2)设置的液相色谱仪中，梯度洗脱，进行氟马西尼中间体i的分析检测。9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，所述检测方法包括采用反相高效液相色谱法进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：
优选地，所述梯度洗脱设置如下：优选地，所述梯度洗脱设置如下：10.根据权利要求8所述的检测方法，步骤2)中，所述流速为1.0ml/min，所述检测波长为230nm，所述柱温为40℃，所述流动相a为ph＝4.4的0.02mol/l的磷酸二氢钾水溶液，流动相b为乙腈。

技术总结
一种氟马西尼中间体I的检测方法，所述方法采用反相高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱固定相，以磷酸二氢钾水溶液和乙腈为流动相，在一定条件下进行洗脱。在本发明提供的检测方法中，所述氟马西尼中间体I与杂质2-氨基-5-氟苯甲酸、5-氟靛红的分离效果良好，并且本申请所述方法操作简便，灵敏度高，分离效能高，具有良好的专属性和重现性。具有良好的专属性和重现性。具有良好的专属性和重现性。


技术研发人员：赵露 杨权力 卢锐 林经杰 易斌 熊俊 陈雷 廖宗权 吕金良 屈钦 汪淼 李莉娥
受保护的技术使用者：宜昌人福药业有限责任公司
技术研发日：2022.01.10
技术公布日：2023/7/22