纳米材料及其使用方法

纳米材料及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年10月13日提交的美国临时申请第63/090,832号的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
3.政府支持的声明
4.本发明是在由国立卫生研究院(national institutes of health)授予的7r01ar072024和ar069383以及由国家科学基金会授予的cbet-1905785和cmmi-2025362的政府资助下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
5.背景
6.生物材料例如水凝胶由于其生物相容性和模拟细胞外基质(extracellular matrix，ecm)的能力而被用作用于干细胞的三维基质。虽然水凝胶可以支持细胞生长，但是水凝胶是均匀的果冻状材料，而不是固体支架。对于某些应用，非常需要固体支架，特别是可注射固体支架。


技术实现要素：

7.在一个方面中，本文公开了自组装纳米材料，所述自组装纳米材料包含其上非共价地粘附有生物学活性分子的詹纳斯碱基纳米管(janus base nanotube，jbnt)，其中生物学活性分子包括细胞外基质(ecm)分子、生物活性分子、或其组合。
8.本文还公开了可注射组合物，所述可注射组合物包括上述自组装纳米材料和可药用载体。
9.还公开了组织芯片，所述组织芯片包含微流控细胞和上述自组装纳米材料。
10.在另一个方面中，本文公开了组织工程的方法，所述方法包括将上述可注射组合物注射到组织中。
11.本领域技术人员将根据以下详细描述、附图和所附权利要求认识和理解上述特征和其他特征。
附图说明
12.图1示出了jbnt/胞外基质蛋白3(matn3)纳米材料基质(nanomaterial matrix，nm)的制剂开发和相机图像。
13.图2示出了jbnt/matn3 nm的表征。
14.图3示出了nm的透射电子显微术(tem)图像。
15.图4示出了nm的宽视野图像。
16.图5为示出nm上的细胞黏附和密度的图。
17.图6a和图6b示出了来自jbnt、matn3和tgfβ的双层nm的荧光显微术图像。
18.图7a至图7c示出了来自jbnt、matn3和tgfβ的双层nm的ζ电位(图7a)、uv-vis(图7b)和tem分析(图7c)。
19.图8a至图8c示出了来自jbnt、matn3和tgfβ的双层nm的细胞黏附图像(图8a至图
8b)和细胞黏附数(每mm2)(图8c)。
20.图9示出了来自jbnt、matn3和tgfβ的双层nm的细胞形态分析。
21.图10a至图10c示出了jbnt的化学结构(图10a)；通过自组装进行的j/t/m nm形成过程(图10b)；以及与间质干细胞共培养的j/t/m nm的生物学活性(图10c)。
22.图11a至图11c示出了j/t/m nm的形成和表征。图11a示出了胞外基质蛋白-3、胞外基质蛋白-3/tgf-β1混合物和j/t/m nm的ζ电位。图11b示出了胞外基质蛋白-3、tgf-β1、jbnt、胞外基质蛋白3/jbnt复合物、tgf-β1/jbnt复合物和j/t/m nm的紫外可见(uv-vis)吸收光谱。图11c示出了jbnt的透射电子显微术(tem)图像和j/t/m nm在两个不同放大倍数下的透射电子显微术(tem)图像。
23.图12a至图12c示出了用jbnt和荧光标记蛋白形成的j/t/m nm的荧光光谱和共聚焦图像。图12a示出了jbnt/tgf-β1-alex fluor 488/胞外基质蛋白-3-alex fluor 555nm的3d共聚焦图像。图12b示出了不同通道中的jbnt/tgf-β1-alex fluor 488/胞外基质蛋白-3-alex fluor 555nm的2d共聚焦图像。图12c示出了通过荧光光谱表征荧光染料标记的蛋白质之间的fret过程。
24.图13a至图13d示出了hmsc粘附行为测试和分析。图13a示出了在预涂覆琼脂糖凝胶的表面上培养的hmsc的光学显微镜图像。图13b示出了在涂覆有不同材料的腔室盖玻片上培养的hmsc的共聚焦图像。图13c示出了细胞黏附数的统计分析。图13d示出了细胞形态的统计分析。n≥3。与阴性对照(negative control，nc)相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
25.图14示出了不同组的hmsc中的细胞形状参数的统计分析图。n≥3。*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。
26.图15示出了细胞增殖的统计分析。hmsc在用不同材料孵育1天、3天、或5天之后的细胞数统计。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。n＝6。
27.图16a至图16b示出了软骨组织构建体的爱茜蓝染色和经染色的hmsc在15天的分化之后的定量分析。图16a示出了包含经爱茜蓝染色的hmsc的软骨组织构建体的光显微术图像。图16b示出了软骨组织构建体中的hmsc的总数和锚定百分比分析。比例尺：50μtm。
28.图17a至图17e示出了由通过实时pcr和免疫染色评估的3d培养系统中的由j/t/m nm引起的软骨形成的促进和过度生长的防止。对15天时收获的样品进行实时pcr以评估软骨形成标记物(聚集蛋白聚糖(图17a)；col2a1(图17b))和过度生长标记物(col10a1(图17c)；ihh(图17d))的基因表达。通过管家基因gapdh的表达来将目标基因的表达归一化。*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.0001。n＝3。图17e示出了x型胶原蛋白免疫染色的共聚焦图像。
29.图18a至图18c示出了j/t/m nm稳定性测试。图18a示出了15天中测试的j/t/m nm的紫外可见(uv-vis)吸收光谱。图18b示出了第0天、第9天和第15天测试的j/t/m nm和不同对照组(包括jbnt、胞外基质蛋白-3、tgf-β1和jbnt/胞外基质蛋白-3复合物)的uv-vis吸收光谱。图18c示出了15天之后j/t/m nm中剩余的tgf-β1的百分比(通过酶联免疫测定(elisa)试剂盒确定)。
30.图19示出了在水中的固体和柔性j/t/m nm纤维的证明。
31.图20a至图20b示出了使用jbnt溶液进行的体外细胞毒性测定。用不同浓度的jbnt
溶液孵育之后的hmsc(图20a)和人软骨细胞(c28/i2细胞系；(图20b))的相对生存力。
32.图21a至图21c示出了人软骨细胞黏附行为测试和分析。图21a示出了在预涂覆有不同材料的腔室盖玻片上培养的人软骨细胞的共聚焦图像。比例尺：50μm。图21b示出了细胞黏附数的统计分析。图21c示出了细胞形态的统计分析。n≥3。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
33.图22示出了不同组的软骨细胞中的细胞形状参数的统计分析图。n≥3。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
34.图23示出了用cck-8试样测试的hmsc的吸收强度的标准曲线。
35.图24示出了软骨组织构建体的爱茜蓝染色。比例尺：50μm。
36.图25a至图25c示出了用jbnt和荧光标记蛋白形成的j/t/m nm的荧光光谱和共聚焦图像。图25a示出了jbnt/tgf-β1-alex fluor 488/胞外基质蛋白-3-a1ex fluor 555nm的3d共聚焦图像。图25b示出了不同通道中的jbnt/tgf-β1-alex fluor 488/胞外基质蛋白-3-alex fluor 555nm的2d共聚焦图像。图25c示出了通过荧光光谱表征荧光染料标记的蛋白质之间的fret过程。
具体实施方式
37.骨质疏松症是一种常见且多发的疾病，并且患有骨质疏松症的患者中出现的骨折不仅导致大的疼痛且恢复缓慢，而且还给患者带来巨大的经济负担。间质干细胞(msc)的激活和迁移已经显示出在骨折愈合中发挥重要的作用，然而，其具有促进和引导内源msc至骨折部位以及促进在目标位置处的粘附和功能的挑战。由于吸引msc以迁移到骨折部位中并粘附在骨折部位内是骨再生的第一步，因此成功的组织工程支架应能够增强干细胞锚定，这包括支持迁移和粘附。这对细胞分化和功能是重要的。在没有生物材料或生化暗示引导msc的情况下，仅一小部分注射的msc到达目标组织并停留在期望的位置处，尤其是在全身施用的情况下。虽然各种工程支架已被用于促进msc迁移和粘附，但一些骨折位置(例如长骨中间的生长板骨折)不容易到达并且不容易容纳预制的常规移植材料或支架。此外，预制支架可能无法完美地适应不规则形状的骨折。因此，需要的是这样的纳米材料：其不仅是仿生的，而且还可以原位自组装，从而可直接注射到目标区域中。
38.本文公开了可以创建对干细胞分化或组织细胞功能定制的微环境的可注射纳米材料基质(nm)的家族。这些纳米材料可以用于“难以到达”的位置例如深部组织损伤(作为组织修复治疗)或者用于组织芯片的微通道(用于疾病建模和药物筛选)。与现有技术的可注射材料例如可注射水凝胶-其为均质果冻状材料-不同，本文描述的nm为多孔固体网状物。特别地，本文所描述的nm可用于深部组织损伤的组织再生(例如生长板骨折修复和中风后的脑再生)并且还可以用于组织芯片以用于药物筛选。
39.定义
40.在整个本说明书和所附权利要求中，词语“包含”、“包括”和“具有”、及其变体应被包括性地解释。即，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传递可能包含未具体列举的其他要素或整数。说明书中的语言不应被解释为指示本发明的实践所必需的任何未要求保护的要素。
41.除非在本文中另外指出或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中
(尤其是在所附权利要求的上下文中)中使用的没有数量词修饰的术语及其类似对象应被解释为涵盖单数和复数二者。
42.如本文所使用的术语第一、第二等不意指表示任何特定的顺序，而是仅为了方便表示复数个例如层。
43.除非在本文中另外指出，否则本文中值的范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简化方法，每个单独值被并入说明书中，就好像其在本文中单独引用一样。本文中范围可以表示为从“约”(或“大约”)一个特定值和/或至“约”(或“大约”)另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”或“大约”将值表示为近似值时，将理解，特定值形成另一个实施方案。将进一步理解，各范围的端点既关于其他端点公开，又独立于其他端点公开。
44.除非在本文中另外指出或者以其他方式与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。此外，本文描述的并且具有多于一个步骤的所有方法可以由多于一个人或实体进行。因此，一个人或一个实体可以进行方法的步骤(a)，另一个人或另一个实体可以进行该方法的步骤(b)，以及又一个人或又一个实体可以进行该方法的步骤(c)等。使用本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)仅旨在更好地阐明本发明并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。
45.单位、前缀和符号以其国际单位制(si)接受的形式表示。
46.本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应被解释为限制性的。每个组成员可以被单独地提及并要求保护或者可以以与本文中发现的组的其他成员或其他要素的任意组合来提及并要求保护。出于便利性和/或可专利性的原因，预期可以在组中包括组的一个或更多个成员或者从组中删除组的一个或更多个成员。当发生任何这样的包括或删除时，认为本文的说明书包含如修改，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述的组。
47.本文使用的标题仅出于组织的目的并且不意指用于限制描述或权利要求的可以通过参照作为整体的说明书而具有的范围。因此，以下紧接着定义的术语通过以整体来参照说明书而被更充分地限定。
48.图示出于描述本发明的一个优选实施方案的目的并且不旨在将本发明限于此。
49.如本文所使用的“约”或“大约”包括所述值并且意指在如由本领域普通技术人员考虑到所讨论的测量和与特定量的测量有关的误差(即，测量系统的限制)所确定的特定值的偏差的可接受范围内。例如，“约”可以意指在所述值的一个或更多个标准偏差内或者
±
10％或
±
5％内。
50.如本文所使用的，术语“施用”意指将组合物实际物理引入到(如适当的)宿主或细胞之中或之上。根据本发明细致考虑将组合物引入到宿主或细胞中的任何方法和所有方法；该方法不依赖于任何特定的引入方式并且不应被如此解释。引入的方式对本领域技术人员而言是公知的，并且在本文中也进行了例示。
51.如本文所使用的，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生或者可以不发生，并且意指该描述包括所述事件或情况发生的实例和所述事件或情况不发生的实例。
52.如本文所使用的，术语“可药用的”是指生理上可接受的并且当施用至对象(优选地人类对象)时不典型地产生过敏的不良反应或类似的不良反应的组合物。优选地，如本文所使用的，术语“可药用的”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，并且更特别地用于人。
53.如本文所使用的，术语“治疗”及其变体包括抑制病理状况、失调或疾病，例如阻止或减少病理状况、失调或疾病或者其临床症状的发展；或者缓解病理状况、失调或疾病，例如引起病理状况、失调或疾病或者其临床症状的消退。这些术语也涵盖治疗和治愈。治疗意指改善或以其他方式有益地改变病理状况、失调或疾病的症状的任何方式。优选地，需要这样的治疗的对象为哺乳动物，优选为人。
54.化学定义
55.术语“氨基酸”是指包含氨基和羧基二者的分子。示例性氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸以及通过有机合成或其他代谢途径制备的非天然存在的氨基酸的d-异构体和l-异构体二者。如本文所使用的，术语氨基酸包括但不限于α-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。
56.术语“α-氨基酸”是指包含键合至指定为α-碳的碳的氨基和羧基二者的分子。
57.术语“β-氨基酸”是指呈β构型的包含氨基和羧基二者的分子。
58.术语“天然存在的氨基酸”是指自然中合成的肽中常见的并且通过一个字母缩写a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y和v所知晓的二十种氨基酸中的任一者。
59.下表示出了天然氨基酸的特性的汇总：
60.[0061][0062]“疏水氨基酸”包括小的疏水氨基酸和大的疏水氨基酸。“小的疏水氨基酸”为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、及其类似物，“大的疏水氨基酸”为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、及其类似物。“极性氨基酸”为丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸、及其类似物。“带电氨基酸”是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、及其类似物。
[0063]
术语“氨基酸类似物”是指在结构上类似于氨基酸并且可以在肽模拟物大环的形成中取代氨基酸的分子。氨基酸类似物包括而不限于3-氨基酸，以及其中氨基或羧基被类似的反应性基团取代(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺或者用酯取代羧基)的氨基酸。
[0064]
术语“非天然氨基酸”是指不是自然中合成的肽中常见的并且通过一个字母缩写a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y和v所知晓的二十种氨基酸中的一者的氨基酸。非天然氨基酸或氨基酸类似物包括而不限于根据以下的结构：
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071][0072]
氨基酸类似物包括β-氨基酸类似物。β-氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：环状β-氨基酸类似物；β-丙氨酸；(r)-β-苯丙氨酸；(r)-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(r)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2，4-二氯苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氯
苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3，4-二氯苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(3，4-二氟苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(r)-3-氨基-5-己烯酸；(r)-3-氨基-5-己炔酸；(r)-3-氨基-5-苯基戊酸；(r)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；(s)-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(s)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(s)-3-氨基-4.-(2，4-二氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3，4-二氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(3，4-二氟苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(s)-3-氨基-5-己烯酸；(s)-3-氨基-5-己炔酸；(s)-3-氨基-5-苯基戊酸；(s)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸；1，2，5，6-四氢吡啶-4-羧酸；3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(2-噻吩基)-丙酸；3-氨基-3-(3-溴苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸；3-氨基-4，4，4-三氟-丁酸；3-氨基己二酸；d-β-苯丙氨酸；β-亮氨酸；l-β-高丙氨酸；l-β-高天冬氨酸γ-苄酯；l-β-高谷氨酸δ-苄酯；l-β-高异亮氨酸；l-β-高亮氨酸；l-β-高甲硫氨酸；l-β-高苯丙氨酸；l-β-高脯氨酸；l-β-高色氨酸；l-β-高缬氨酸；l-nω-苄氧基羰基-β-高赖氨酸；nω-l-β-高精氨酸；o-苄基-l-β-高羟基脯氨酸；o-苄基-l-β-高丝氨酸；o-苄基-l-β-高苏氨酸；o-苄基-l-β-高酪氨酸；γ-三苯甲基-l-β-高天冬酰胺；(r)-β-苯丙氨酸；l-β-高天冬氨酸γ-叔丁酯；l-β-高谷氨酸δ-叔丁酯；l-nω-β-高赖氨酸；nδ-三苯甲基-l-β-高谷氨酰胺；nω-2，2，4，6，7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基-l-β-高精氨酸；o-叔丁基-l-β-高羟基-脯氨酸；o-叔丁基-l-β-高丝氨酸；o-叔丁基-l-β-高苏氨酸；o-叔丁基-l-β-高酪氨酸；2-氨基环戊烷羧酸；和2-氨基环己烷羧酸。
[0073]
氨基酸类似物包括丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物。丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和亮氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲氧基甘氨酸；α-烯丙基-l-丙
氨酸；α-氨基异丁酸；α-甲基-亮氨酸；β-(1-萘基)-d-丙氨酸；β-(1-萘基)-l-丙氨酸；β-(2-萘基)-d-丙氨酸；β-(2-萘基)-l-丙氨酸；1-(2-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-l-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-d-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-l-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-d-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-l-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-l-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-l-丙氨酸；1.氯-l-丙氨酸；1-氰基-l-丙氨酸；3-环己基-d-丙氨酸；3-环己基-l-丙氨酸；3-环戊烯-1-基-丙氨酸；3-环戊基-丙氨酸；3-环丙基-l-ala-oh.二环己基铵盐；β-叔丁基-d-丙氨酸；β-叔丁基-l-丙氨酸；γ-氨基丁酸；l-α，β-二氨基丙酸；2，4-二硝基-苯基甘氨酸；2，5-二氢-d-苯基甘氨酸；2-氨基-4，4，4-三氟丁酸；2-氟-苯基甘氨酸；3-氨基-4，4，4-三氟-丁酸；3-氟-缬氨酸；4，4，4-三氟-缬氨酸；4，5-脱氢-l-leu-oh.二环己基铵盐；4-氟-d-苯基甘氨酸；4-氟-l-苯基甘氨酸；4-羟基-d-苯基甘氨酸；5，5，5-三氟-亮氨酸；6-氨基己酸；环戊基-d-gly-oh.二环己基铵盐；环戊基-gly-oh.二环己基铵盐；d-α，β-二氨基丙酸；d-α-氨基丁酸；d-α-叔丁基甘氨酸；d-(2-噻吩基)甘氨酸；d-(3-噻吩基)甘氨酸；d-2-氨基己酸；d-2-茚满基甘氨酸；d-烯丙基甘氨酸.二环己基铵盐；d-环己基甘氨酸；d-戊氨酸；d-苯基甘氨酸；β-氨基丁酸；β-氨基异丁酸；(2-溴苯基)甘氨酸；(2-甲氧基苯基)甘氨酸；(2-甲基苯基)甘氨酸；(2-噻唑基)甘氨酸；(2-噻吩基)甘氨酸；2-氨基-β-(二甲基氨基)-丙酸；l-α，β-二氨基丙酸；l-α-氨基丁酸；l-α-叔丁基甘氨酸；l-β-噻吩基)甘氨酸；l-2-氨基-β-(二甲基氨基)-丙酸；l-2-氨基己酸二环己基-铵盐；l-2-茚满基甘氨酸；l-烯丙基甘氨酸.二环己基铵盐；l-环己基甘氨酸；l-苯基甘氨酸；l-炔丙基甘氨酸；l-戊氨酸；n-α-氨基甲基-l-丙氨酸；d-α，γ-二氨基丁酸；l-α，γ-二氨基丁酸；β-环丙基-l-丙氨酸；(n-β-(2，4-二硝基苯基))-l-α，β-二氨基丙酸；(n-β-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-d-α，β-二氨基丙酸；(n-β-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-l-α，β-二氨基丙酸；(n-β-4-甲基三苯甲基)-l-α，β-二氨基丙酸；(n-β-烯丙氧基羰基)-l-α，β-二氨基丙酸；(n-γ-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-d-α，γ-二氨基丁酸；(n-γ-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-l-α，γ-二氨基丁酸；(n-γ-4-甲基三苯甲基)-d-α，γ-二氨基丁酸；(n-γ-4-甲基三苯甲基)-l-α，γ-二氨基丁酸；(n-γ-烯丙氧基羰基)-l-α，γ-二氨基丁酸；d-α，γ-二氨基丁酸；4，5-脱氢-l-亮氨酸；环戊基-d-gly-oh；环戊基-gly-oh；d-烯丙基甘氨酸；d-高环己基丙氨酸；l-1-芘基丙氨酸；l-2-氨基己酸；l-烯丙基甘氨酸；l-高环己基丙氨酸；和n-(2-羟基-4-甲氧基-bzl)-gly-oh。
[0074]
氨基酸类似物包括精氨酸或赖氨酸的类似物。精氨酸和赖氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：瓜氨酸；l-2-氨基-3-胍基丙酸；l-2-氨基-3-脲基丙酸；l-瓜氨酸；lys(me)
2-oh；lys(n3)-oh；nδ-苄氧基羰基-l-乌氨酸；nω-硝基-d-精氨酸；nω-硝基-l-精氨酸；α-甲基-乌氨酸；2，6-二氨基庚二酸；l-乌氨酸；(nδ-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-环己-1-亚基)乙基)-d-乌氨酸；(nδ-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-环己-1-亚基)乙基)-l-乌氨酸；(nδ-4-甲基三苯甲基)-d-乌氨酸；(nδ-4-甲基三苯甲基)-l-乌氨酸；d-乌氨酸；l-乌氨酸；arg(me)(pbf)-oh；arg(me)2-oh(非对称的)；arg(me)2-oh(对称的)；lys(ivdde)-oh；lys(me)2-oh.hcl；lys(me3)-oh氯化物；nω-硝基-d-精氨酸；和nω-硝基-l-精氨酸。
[0075]
氨基酸类似物包括天冬氨酸或谷氨酸的类似物。天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-d-天冬氨酸；α-甲基-谷氨酸；α-甲基-l-天冬氨酸；
γ-亚甲基-谷氨酸；(n-γ-乙基)-l-谷氨酰胺；[n-α-(4-氨基苯甲酰基)]-l-谷氨酸；2，6-二氨基庚二酸；l-α-氨基辛二酸；d-2-氨基己二酸；d-α-氨基辛二酸；α-氨基庚二酸；亚氨基二乙酸；l-2-氨基己二酸；苏型-β-甲基-天冬氨酸；γ-羧基-d-谷氨酸γ，γ-二叔丁酯；γ-羧基-l-谷氨酸γ，γ-二叔丁酯；glu(oall)-oh；l-asu(otbu)-oh；和焦谷氨酸。
[0076]
氨基酸类似物包括半胱氨酸和甲硫氨酸的类似物。半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于cys(法呢基)-oh、cys(法呢基)-ome、α-甲基-甲硫氨酸、cys(2-羟乙基)-oh、cys(3-氨基丙基)-oh、2-氨基-4-(乙基硫基)丁酸、丁硫氨酸、丁硫氨酸亚砜亚胺、乙硫氨酸、甲硫氨酸甲基锍氯化物、硒代甲硫氨酸、半胱氨酸、[2-(4-吡啶基)乙基]-dl-青霉胺、[2-(4-吡啶基)乙基]-l-半胱氨酸、4-甲氧基苄基-d-青霉胺、4-甲氧基苄基-l-青霉胺、4-甲基苄基-d-青霉胺、4-甲基苄基-l-青霉胺、苄基-d-半胱氨酸、苄基-l-半胱氨酸、苄基-dl-高半胱氨酸、氨基甲酰基-l-半胱氨酸、羧乙基-l-半胱氨酸、羧甲基-l-半胱氨酸、二苯基甲基-l-半胱氨酸、乙基-l-半胱氨酸、甲基-l-半胱氨酸、叔丁基-d-半胱氨酸、三苯甲基-l-高半胱氨酸、三苯甲基-d-青霉胺、胱硫醚、高胱氨酸、l-高胱氨酸、(2-氨基乙基)-l-半胱氨酸、硒代-l-胱氨酸、胱硫醚、cys(stbu)-oh、和乙酰氨基甲基-d-青霉胺。
[0077]
氨基酸类似物包括苯丙氨酸和酪氨酸的类似物。苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸类似物的实例包括3-甲基-苯丙氨酸、3-羟基苯丙氨酸、α-甲基-3-甲氧基-dl-苯丙氨酸、α-甲基-d-苯丙氨酸、α-甲基-l-苯丙氨酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、2，4-二氯-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、2-溴-d-苯丙氨酸、2-溴-l-苯丙氨酸、2-氯-d-苯丙氨酸、2-氯-l-苯丙氨酸、2-氰基-d-苯丙氨酸、2-氰基-l-苯丙氨酸、2-氟-d-苯丙氨酸、2-氟-l-苯丙氨酸、2-甲基-d-苯丙氨酸、2-甲基-l-苯丙氨酸、2-硝基-d-苯丙氨酸、2-硝基-l-苯丙氨酸、2；4；5-三羟基-苯丙氨酸、3，4，5-三氟-d-苯丙氨酸、3，4，5-三氟-l-苯丙氨酸、3，4-二氯-d-苯丙氨酸、3，4-二氯-l-苯丙氨酸、3，4-二氟-d-苯丙氨酸、3，4-二氟-l-苯丙氨酸、3，4-二羟基-l-苯丙氨酸、3，4-二甲氧基-l-苯丙氨酸、3，5，3
′‑
三碘-l-甲状腺原氨酸、3，5-二碘-d-酪氨酸、3，5-二碘-l-酪氨酸、3，5-二碘-l-甲状腺原氨酸、3-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、3-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、3-氨基-l-酪氨酸、3-溴-d-苯丙氨酸、3-溴-l-苯丙氨酸、3-氯-d-苯丙氨酸、3-氯-l-苯丙氨酸、3-氯-l-酪氨酸、3-氰基-d-苯丙氨酸、3-氰基-l-苯丙氨酸、3-氟-d-苯丙氨酸、3-氟-l-苯丙氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-d-苯丙氨酸、3-碘-l-苯丙氨酸、3-碘-l-酪氨酸、3-甲氧基-l-酪氨酸、3-甲基-d-苯丙氨酸、3-甲基-l-苯丙氨酸、3-硝基-d-苯丙氨酸、3-硝基-l-苯丙氨酸、3-硝基-l-酪氨酸、4-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、4-氨基-d-苯丙氨酸、4-氨基-l-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-d-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-l-苯丙氨酸、4-双(2-氯乙基)氨基-l-苯丙氨酸、4-溴-d-苯丙氨酸、4-溴-l-苯丙氨酸、4-氯-d-苯丙氨酸、4-氯-l-苯丙氨酸、4-氰基-d-苯丙氨酸、4-氰基-l-苯丙氨酸、4-氟-d-苯丙氨酸、4-氟-l-苯丙氨酸、4-碘-d-苯丙氨酸、4-碘-l-苯丙氨酸、高苯丙氨酸、甲状腺素、3，3-二苯丙氨酸、甲状腺原氨酸、乙基-酪氨酸、和甲基-酪氨酸。
[0078]
氨基酸类似物包括脯氨酸的类似物。脯氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于3，4-脱氢-脯氨酸、4-氟-脯氨酸、顺式-4-羟基-脯氨酸、噻唑烷-2-羧酸、和反式-4-氟-脯氨酸。
[0079]
氨基酸类似物包括丝氨酸和苏氨酸的类似物。丝氨酸和苏氨酸的氨基酸类似物的
实例包括但不限于3-氨基-2-羟基-5-甲基己酸、2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、2-氨基-3-乙氧基丁酸、2-氨基-3-甲氧基丁酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-氨基-3-苄氧基丙酸、2-氨基-3-苄氧基丙酸、2-氨基-3-乙氧基丙酸、4-氨基-3-羟基丁酸、和α-甲基丝氨酸。
[0080]
氨基酸类似物包括色氨酸的类似物。色氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-色氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-d-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-l-丙氨酸；1-甲基-色氨酸；4-甲基-色氨酸；5-苄氧基-色氨酸；5-溴-色氨酸；5-氯-色氨酸；5-氟-色氨酸；5-羟基-色氨酸；5-羟基-l-色氨酸；5-甲氧基-色氨酸；5-甲氧基-l-色氨酸；5-甲基-色氨酸；6-溴-色氨酸；6-氯-d-色氨酸；6-氯-色氨酸；6-氟-色氨酸；6-甲基-色氨酸；7-苄氧基-色氨酸；7-溴-色氨酸；7-甲基-色氨酸；d-1，2，3，4-四氢-去甲基哈尔明碱-3-羧酸；6-甲氧基-1，2，3，4-四氢去甲基哈尔明碱-1-羧酸；7-氮杂色氨酸；l-1，2，3，4-四氢-去甲基哈尔明碱-3-羧酸；5-甲氧基-2-甲基-色氨酸；和6-氯-l-色氨酸。
[0081]
在一些实施方案中，氨基酸类似物是外消旋的。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的d异构体。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的l异构体。在另一些实施方案中，氨基酸类似物包含呈r或s构型的手性中心。在又一些实施方案中，β-氨基酸类似物的氨基经保护基团(例如，叔丁氧基羰基(boc基)、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)、对甲苯磺酰基等)取代。在又一些实施方案中，β-氨基酸类似物的羧基官能团被保护例如作为其酯衍生物。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的盐。
[0082]“非必需”氨基酸残基为可以从多肽的野生型序列改变而不消除或基本上不消除其必需的生物学活性或生化活性(例如，受体结合或激活)的残基。“必需”氨基酸残基为当从多肽的野生型序列中改变时导致消除或基本上消除多肽的必需的生物学活性或生化活性的残基。
[0083]“保守性氨基酸替换”是其中氨基酸残基经具有相似侧链的氨基酸残基替代的一类。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如k、r、h)、酸性侧链(例如d、e)、不带电的极性侧链(例如g、n、q、s、t、y、c)、非极性侧链(例如a、v、l、i、p、f、m、w)、β-支化侧链(例如t、v、i)和芳族侧链(例如y、f、w、h)的氨基酸。因此，多肽中的预测的非必需氨基酸残基例如经来自相同侧链家族的另外的氨基酸残基替代。可接受的取代基的其他实例为基于等电子排列考虑(例如正亮氨酸替代甲硫氨酸)或其他特性(例如2-噻吩基丙氨酸替代苯丙氨酸)的取代基。
[0084]
术语“多肽”是指由链中键合在一起的大量氨基酸残基组成，从而形成蛋白质分子的一部分(或全部)的线性有机聚合物。
[0085]
术语“α-多肽”是指衍生自α-氨基酸的多肽。
[0086]
术语“β-多肽”是指衍生自β-氨基酸的多肽。
[0087]
术语“脂族”或“脂族基团”是指这样的烃部分：其可以为直链(即非支化的)、支化的或环状的(包括稠合的、桥接的和螺环稠合的多环的)并且可以为完全饱和的或者可以包含一个或更多个不饱和的单元。适合的脂族基团包括但不限于线性的或支化的烷基、烯基和炔基、及其混合物。如本文所使用的，术语“脂族”或“脂族基团”还涵盖这些部分的其中脂族基团的氢原子中的至少一者被不是碳或氢的原子替代的经部分取代的类似物。
[0088]
术语“连接基团”是指经由至少一个共价键连接一个或更多个其他化学基团的化学基团。
[0089]
虽然已参照一个示例性实施方案描述了本发明，但本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种变化并且可以用等同方案替换其要素。此外，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可以进行许多修改以使特定情况或材料适应本发明的教导。因此，本发明旨在不限于作为用于实施本发明仔细考虑的最佳方式而公开的特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求的范围内的所有实施方案。除非本文另外指出或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变体中的所描述的要素的任何组合。
[0090]
詹纳斯碱基纳米管
[0091]
本公开内容的自组装纳米材料包含詹纳斯碱基纳米管。
[0092]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(i)的化合物：
[0093][0094]
或者其可药用盐，其中：
[0095]
n为1、2、3、4、5、或6；
[0096]
r1、r5、r
11
和r
15
各自独立地选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，
[0097]
r2、r6和r7各自独立地选自h、ch3和nhrz；以及
[0098]rz
、r
13
和r
16
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。
[0099]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(iii)的化合物：
[0100][0101]
或者其可药用盐，其中：
[0102]
n为1、2、3、4、5、或6；
[0103]
r1、r5、r
11
和r
15
各自独立地选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，
[0104]
r2、r6和r7各自独立地选自h、ch3和nhrz；以及
[0105]rz
、r
12
和r
16
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。
[0106]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(v)的化合物：
[0107][0108]
或者其可药用盐或酯，其中：
[0109]
n为1、2、3、4、5、或6；
[0110]
r1、r5、r
11
和r
15
各自独立地选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，
[0111]
r2、r6和r7各自独立地选自h、ch3和nhrz；以及
[0112]rz
、r
12
和r
16
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。
[0113]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(vii)的化合物：
[0114][0115]
或者其可药用盐或酯，其中：
[0116]
n为1、2、3、4、5、或6；
[0117]
r1、r5、r
11
和r
15
各自独立地选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，
[0118]
r2、r6和r7各自独立地选自h、ch3和nhrz；以及
[0119]rz
、r
12
和r
16
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。
[0120]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(ii)的化合物：
[0121][0122]
或者其可药用盐，其中：
[0123]
n为1、2、3、4、5、或6；
[0124]
r3、r8、r
13
和r
17
各自独立地选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽；
[0125]
r4、r9和r
10
各自独立地为h、ch3或nhrz；以及
[0126]rz
、r
14
和r
18
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。
[0127]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(iv)的化合物：
[0128][0129]
或者其可药用盐，其中：
[0130]
n为1、2、3、4、5、或6；
[0131]
r3、r8、r
13
和r
17
各自独立地选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽；
[0132]
r4、r9和r
10
各自独立地为h、ch3或nhrz；以及
[0133]rz
、r
14
和r
18
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。
[0134]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(vi)的化合物：
[0135][0136]
或者其可药用盐，其中：
[0137]
n为1、2、3、4、5、或6；
[0138]
r3、r8、r
13
和r
17
各自独立地选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽；
[0139]
r4、r9和r
10
各自独立地为h、ch3或nhrz；以及
[0140]rz
、r
14
和r
18
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。
[0141]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(viii)的化合物：
[0142][0143]
或者其可药用盐，其中：
[0144]
n为1、2、3、4、5、或6；
[0145]
r3、r8、r
13
和r
17
各自独立地选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，
[0146]
r4、r9和r
10
各自独立地为h、ch3或nhrz；以及
[0147]rz
、r
14
和r
18
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。
[0148]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(ix)的化合物：
[0149][0150]
或者其可药用盐，其中：
[0151]
x为ch或氮；
[0152]
r2为氢或c1至c
20
连接基团；
[0153]
y在r2为氢时不存在，或者为氨基酸或多肽，其具有与该氨基酸的α-碳共价键合的氨基，并且该氨基与连接基团r2共价键合；以及
[0154]
r1为氢或c1至c
20
脂族部分，例如烷基，直链或支链的、饱和或不饱和的烷基。
[0155]
在一些实施方案中，詹纳斯碱基纳米管包含式(xi)的化合物：
[0156][0157]
或者其可药用盐，其中：
[0158]
x为ch或氮；
[0159]
r2为氢或c1至c
20
连接基团；
[0160]
y在r2为氢时不存在，或者为氨基酸或多肽，其具有与该氨基酸的α-碳共价键合的氨基，并且该氨基与连接基团r2共价键合；以及
[0161]
r1为氢或c1至c20脂族部分，例如烷基，直链或支链的、饱和或不饱和的。
[0162]
自组装纳米材料
[0163]
本文公开了自组装纳米材料，所述自组装纳米材料包含非共价地粘附有生物学活性分子的詹纳斯碱基纳米管，其中生物学活性分子包括细胞外基质(ecm)分子、生物活性分子、或其组合。在一个方面中，nm呈具有50nm至2mm的平均直径和100nm至100mm的平均长度的原纤维的形式。在一个优选的方面中，ecm分子非共价地自组装。
[0164]
虽然不限于该方面，但是jbnt与ecm分子的比率为1000：1至1：1。
[0165]
如本文所使用的，单隔室纳米材料包括自组装纳米材料的单一群，即，单一类型的jbnt和粘附于jbnt的一个或更多个ecm分子。
[0166]
如本文所使用的，多隔室纳米材料包括例如通过静电叠层组装形成多隔室结构的自组装纳米材料的两个或更多个群。在一个实例中，例如，jbnt与tgf-β的第一群可以在jbnt与matn3的第二群内制备。jbnt的第一群和第二群上的相反静电电荷可以驱动多隔室纳米材料的组装。通过按顺序组装第一群和第二群，一个群将形成内部隔室并且第二个群将形成外部隔室。
[0167]
如本文所使用的，可注射的可以意指可通过直径为0.1nm至10mm的针注射。在一个方面中，注射组装的纳米材料。在另一个方面中，注射用于纳米材料的前体并使其在体内自组装。
[0168]
可以在所公开的纳米材料中使用的示例性ecm分子包括羟基磷灰石、纤连蛋白、matn1、matn3、层粘连蛋白、胶原蛋白(例如，i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白)、弹性蛋白、玻连蛋白、原纤维蛋白、串珠蛋白聚糖、纤维蛋白原、骨粘连蛋白、生腱蛋白、血小板应答蛋白、细胞间黏附分子(icam1-5)、整联蛋白、蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖)、糖胺聚糖(例如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素(dermatin sulfate)、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素)、糖蛋白、及其组合。
[0169]
可以在所公开的纳米材料中使用的示例性生物活性分子包括tgfβ、vegf、igf、egf、pdgf、bmp、fgf、gdnf、hgf、pgf、ngf、tnf-α、sdf-1、地塞米松、sirna、mirna、生长因子、
小分子药物、及其组合。
[0170]
细胞生长和组织再生
[0171]
有利地，本文所描述的材料为包含詹纳斯碱基纳米管和细胞外基质分子(ecm)的可调节材料。jbnt可以与不同的ecm组装以形成用于不同细胞/组织的不同nm。此外，nm可以用多功能层或隔室制备以实现比支持细胞生长更多的多种功能(例如药物释放)。
[0172]
对于组织再生，nm可以包含matn3用于生长板骨折修复。然而，其他ecm分子可以用于脑再生生长板修复和其他应用。
[0173]
药物递送
[0174]
已经针对干细胞锚定和功能开发了各种生物材料支架以产生用于体外和体内用途的组织构建体。通常将生长因子应用于支架以介导细胞分化。常规地，生长因子无法严格地定位在支架中；因此，生长因子可能泄漏到周围环境中，从而导致对组织或细胞不期望的副作用。因此，需要基于高度定位的药物递送和稳态微环境的改善的组织构建体策略。
[0175]
本文公开了可注射纳米基质(nm)支架，基于分子水平上的受控自组装的在其支架的纳米尺寸纤维内部具有叠层结构。nm由詹纳斯碱基纳米管(jbnt)、胞外基质蛋白-3和转化生长因子β-1(tgf-β1)经由生物亲和性进行分层组装。形成nm骨架的jbnt为模拟胶原蛋白的天然螺旋纳米结构的新型dna激发的纳米材料。将软骨形成因子tgf-β 1包裹在nm纤维内的内层中以防止其释放。将胞外基质蛋白-3并入外层中以创建模拟软骨的微环境并保持组织稳态。在一些实施方案中，人间质干细胞(hmsc)具有沿nm纤维锚定的强烈偏好并形成定位的稳态微环境。在优选的实施方案中，该nm经由分子自组装产生高度组织化的结构，并实现了用于稳态组织构建体的定位的药物递送和干细胞锚定。
[0176]
药物组合物
[0177]
可注射组合物包含上述自组装纳米材料和可药用载体。自组装纳米材料可以在无菌培养基中以无菌可注射的水性悬浮液和油质性悬浮液的形式皮下、或静脉内、或肌内、或胸骨内、或通过输注技术来肠胃外施用。有利地，可以将佐剂例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解在运载剂中。
[0178]
组织工程
[0179]
组织工程的方法包括将本文公开的可注射组合物注射到组织中。示例性组织选自软骨、骨、脑、脊椎、关节、神经、韧带和肌腱、骨髓、心脏、眼睛、肝、肾和肺。
[0180]
示例
[0181]
实施例1：基于jbnt和matn1的nm的制剂
[0182]
该实施例说明了基于jbnt和matn1的nm的制剂的开发。
[0183]
在10：1的比率下，可以在不添加化学引发剂或uv光的情况下将jbnt和matn1在水中组装成固体支架。在图1中，相机图像表明示出了nm的宏观结构。
[0184]
进行uv-vis和ζ电位以表明jbnt和matn1的合并(图2)。
[0185]
在图3中，tem图像示出了nm的纳米结构。
[0186]
在图4中，宽视野图像示出了nm的微结构。
[0187]
还开发了具有多个层和多隔室的nm。例如，还制造了来自jbnt、matn3和tgfβ的双层nm。(tgfβ为可以促进软骨形成的生长因子药物)。具有tgfβ的层(绿色)被制造在jbnt/matn3层(红色)的内部(图6)。ζ电位、uv-vis和tem分析证明了jbnt、matn3和tgfβ的合并(图
7)。细胞黏附结果证明了多层nm可以进一步改善细胞功能(图8和图9)。
[0188]
实施例2：模拟dna的纳米管的受控自组装以形成用于稳态组织构建体的叠层支架
[0189]
在该实施例中，开发了基于分子水平上的受控自组装在支架的其纳米尺寸纤维内具有叠层结构的可注射纳米基质(nm)支架。该nm经由分子自组装成功地产生了高度组织化的结构并实现了用于稳态组织构建体的定位的药物递送和干细胞锚定。
[0190]
结果和讨论
[0191]
由于jbnt与静电纺丝或3d打印生产的常规材料纤维不同。各jbnt纤维具有直径为3.5nm的固定分子结构。在jbnt之间并入了蛋白质(例如tgf-β1和胞外基质蛋白3)。换言之，多个jbnt将tgf-β1或胞外基质蛋白3“夹在”其束内(如图10b中所示)。当jbnt、tgf-β1和胞外基质蛋白3形成叠层nm时，内层为包裹tgf-β1的jbnt束，以及外层为包裹胞外基质蛋白3的jbnt束。这样的叠层结构可以通过以下实验来表征和确定。
[0192]
在生理条件下，胞外基质蛋白-3基于其等电点带负电荷。如图11a中所示，胞外基质蛋白-3的ζ电位为约-15mv。当与tgf-β1混合时，溶液的ζ电位增大至近似中性值，表明两种蛋白质经由电荷相互作用而组合。如图25b中所示，胞外基质蛋白-3与tgf-β1之间的荧光共振能量转移(fret)也证实了这种结合。由于赖氨酸的等电点为9.74，因此jbnt在生理环境中是带正电荷的。如图11a中所示，tgf-β1/胞外基质蛋白-3复合物可以进一步与jbnt结合，从而引起从tgf-β1/胞外基质蛋白-3复合物的负电荷/中性电荷到用于j/t/m复合物的正电荷的电荷反转。该结果证明了jbnt、tgf-β1和胞外基质蛋白-3有序地组装成由所有三种组分组成的j/t/m nm。
[0193]
此外，uv-vis光谱表征了jbnt、tgf-β1和胞外基质蛋白-3之间的组装并阐明了j/t/m nm的分层的叠层内部结构的形成。jbnt在其纤维状形态和赖氨酸表面化学性质方面模拟胶原蛋白。虽然tgf-β1和胞外基质蛋白-3二者可以与jbnt相互作用(类似于它们与胶原蛋白的天然结合)，但是jbnt与这两种蛋白质之间的结合亲和性是不同的。jbnt具有在220nm和280nm处的两个吸收峰，认为该两个吸收峰分别由赖氨酸侧链和詹纳斯碱基的芳族环产生。当jbnt与tgf-β1混合时，两个jbnt峰减小，表明tgf-β1与jbnt之间的结合(图11b)。当jbnt与胞外基质蛋白-3混合时，出现吸收峰的更明显的减小，表明胞外基质蛋白-3与jbnt之间更显著的结合(图11b)。添加jbnt以与tgf-β1/胞外基质蛋白-3复合物合并。对于组装的j/t/m nm，吸收曲线位于tgf-β1/jbnt混合物与胞外基质蛋白-3/jbnt混合物的吸收曲线之间，证明jbnt与各个蛋白质之间的这两种类型的键的共存(图11b)。此外，j/t/m nm曲线比tgf-β1/jbnt曲线更接近胞外基质蛋白-3/jbnt曲线；因此，j/t/m nm中的主要相互作用发生在jbnt与胞外基质蛋白-3之间。由于在tgf-β1和胞外基质蛋白-3的组装之后将大量的jbnt添加至nm中，因此明显的是，jbnt优先与胞外基质蛋白-3结合并形成具有外层中的胞外基质蛋白-3和内层中的tgf-β1的叠层结构。这种叠层结构通过tem(图11c)和荧光显微术(图25a至图25b)来证实。
[0194]
进行tem以表征jbnt和j/t/m nm的形态。如图11c中所示，jbnt由直径为约3.5nm的薄的单个纳米管组成。当将jbnt与蛋白质结合时，jbnt的厚束和蛋白质形成支架结构。支架在形态学和生物学上模拟软骨ecm，其可以为原软骨形成的抗过度生长的微环境提供锚定位点和生物活性分子。重要的是，j/t/m nm不是三种组分的简单混合物。相反，nm由两个层(外层和内层)组成并且各层由jbnt的束组成(图11c，j/t/m nm)。图25a显示了nm的截面。包
裹在jbnt束中的红色-荧光-标记的胞外基质蛋白-3(通过uv-vis和tem结果确定)形成外层，因此由于jbnt的增强的干细胞锚定和胞外基质蛋白-3的抗过度生长特性而为软骨提供了最佳的微环境。此外，包裹在jbnt束中的绿色-荧光-标记的tgf-β1(通过uv-vis和tem结果确定)形成内层，从而产生储存生长因子的内层并允许tgf-β 1定位在nm中，而不是泄漏到周围环境或不期望的位置中。以这种方式，如以下通过细胞功能实验证明的，当细胞在nm上生长时，tgf-β1是生物活性的。
[0195]
为了进一步验证j/t/m nm的结构，进行了荧光光谱分析。如上所述，分别用荧光染料alexa488和alexa555标记tgf-β1和胞外基质蛋白-3。用488nm激光激发所有样品组。如图25c中所示，对于jbnt或对照组，没有出现发射峰。对于tgf-β1-alexa488和胞外基质蛋白-3-alexa555组，发射峰分别在约520nm和570nm处出现。当将tgf-β1-alexa488和胞外基质蛋白-3-alexa555组合时，出现在两种荧光染料之间的fret。tgf-β1-alexa488组用作供体，而胞外基质蛋白-3-alexa555组用作受体，这降低了520nm处的发射峰并增强了570nm处的发射峰。fret现象表明胞外基质蛋白-3和tgf-β1足够接近(《10nm)，因为其为距离依赖性物理过程。这些结果提供了证明在形成j/t/m nm期间，tgf-β1和胞外基质蛋白-3的组装的有力的另外的证据。
[0196]
j/t/m nm的结构稳定性以及叠层结构是否可以防止tgf-β1的泄漏。如图18a至图18b中所示，j/t/m nm在水中至少15天的uv-vis吸收曲线没有变化。这样的结果证明了j/t/m nm在水中具有优异的结构稳定性并且在至少两周内不会分解(如果j/t/m nm分解，则其uv-vis吸收将显著地增加)。此外，与以上结果一致，还证明了在磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中15天之后存在tgf-β1从nm中的极少泄漏。因此，j/t/m nm可以非常好地保持其叠层结构并防止tgf-β1的泄漏。
[0197]
j/t/m nm为其形成经历快速的仿生过程的可注射固体支架。如图19中所示，在生理环境(水溶液、无紫外线、无化学添加剂、以及无加热)中，将jbnt移液到蛋白质溶液中。在少于30秒内，形成了固体的白色网状nm支架。如下发生组装：1)带正电荷的jbnt呈现出对带负电荷的胞外基质蛋白-3的静电吸引；2)jbnt模拟胶原蛋白并且与tgf-β1自然地结合。由于组装的支架在结构上是柔性的(可能是由于其模拟dna的纳米管骨架)，因此其可以通过移液管尖端。因此，j/t/m nm具有病灶内注射到不规则形状缺陷中的大潜力。应注意，常规的可注射水凝胶与所公开的nm支架不同，因为常规的水凝胶为均质的半固体材料。相比之下，所公开的nm支架为具有原纤维结构的多孔固体材料。因此，迄今为止开发了非常少的可注射支架。
[0198]
利用细胞计数试剂盒-8(cck-8)试样来评估jbnt的细胞毒性。将hmsc和人软骨细胞用jbnt培养24小时。将jbnt溶液的浓度设定为5μg ml-1
、1μg ml-1
、0.5μg ml-1
和0μg ml-1
下的梯度。即使在最高的浓度下，jbnt也呈现出优异的细胞生存力(》88％)(图20)。jbnt的优异的细胞相容性可能是由其模拟dna的化学性质和非共价结构产生的。因此，jbnt用于软骨组织构建是安全的。
[0199]
为了确定j/t/m nm的细胞锚定和粘附能力，将nm涂覆在琼脂糖凝胶(生物相容但不是生物活性的材料)和腔室盖玻片的表面上。评估了在这两个表面上的细胞黏附。对于琼
脂糖表面，光显微术表明hmsc接种在琼脂糖表面上的程度。如图13a中所示，许多hmsc沿j/t/m nm簇集。在jbnt组中，也存在锚定在jbnt纤维上的少量细胞。然而，对于其他组，hmsc均匀地分布而没有明显的排列。hmsc的不同行为提供了j/t/m nm显著地增强在其支架纤维上的细胞锚定的直接证据。对于腔室盖玻片表面，hmsc和人软骨细胞的共聚焦图像表明细胞黏附的水平和形态。用j/t/m nm培养的细胞似乎比其他组更加被拉伸，表明这些细胞具有优异的与j/t/m nm表面的亲和性(图13b、图21a)。还分析了共聚焦图像中的粘附的细胞数和细胞长轴长度。如图13c和图21b中所示，在用不同的生物材料培养4小时之后，j/t/m nm组表现出比其他组显著更高的细胞黏附密度。j/t/m nm组中的细胞的平均长轴长度显著地大于jbnt、tgf-β1和阴性对照组中的细胞的平均长轴长度(图13d、图21c)。此外，进行了全面的细胞形态学分析以阐明各种材料中的差异。经由细胞廓线仪(cell profiler)对二十个细胞形状参数进行量化，并进行统计分析以评估各材料的效果。所获得的统计分析图表明在用于hmsc和人软骨细胞二者的所有组中，j/t/m nm表面组具有最高的生物活性并产生最明显的效果(图14、图22)。j/t/m nm的生物活性是jbnt、tgf-β1和胞外基质蛋白-3的协同作用，但不是来自它们作用的简单叠加的结果。
[0200]
还探索了nm增加细胞增殖的能力。在用不同材料进行细胞培养一天之后，j/t/m nm和tgf-β1组显示出比胞外基质蛋白-3、jbnt和阴极对照组显著更高的细胞数。当将细胞培养时间增加至3天或5天时，与其他三组相比，j/t/m nm和tgf-β1组显示出更加明显的与细胞增殖的促进有关的效果。促进细胞增殖的生物活性主要归因于tgf-β1的贡献，因为tgf-β1为可以增加细胞增殖和分化的生长因子。另外地，胞外基质蛋白-3为软骨特异性蛋白，以及jbnt模拟ecm。在hmsc孵育3天或5天之后，这些蛋白质中的二者可以适度地增加细胞增殖(图15、图23)。
[0201]
作为长期功能研究，在三维软骨组织构建体中，用j/t/m nm或其他材料培养干细胞。阳性对照组供应有新鲜tgf-β1，每次更换培养基。每三天更换培养基。将j/t/m nm中供应的相同剂量的tgf-β1、胞外基质蛋白-3和jbnt封装在琼脂糖中以形成分别表示为tgf-β1、胞外基质蛋白-3、jbnt和j/t/m nm组的组织构建体。在15天之后，评估hmsc的软骨形成分化中的蛋白质标记物。应用爱茜蓝染色以确定软骨组织构建体中的软骨特异性蛋白聚糖表达。图16a(i)表明j/t/m nm组中的细胞被染成蓝色，从而提供用于在用j/t/m nm培养之后hmsc的增强软骨形成的另外的证据。重要的是，hmsc簇集在j/t/m nm束的旁边并通过软骨形成分化来进行。根据粘附研究和我们的材料设计，叠层nm不仅为干细胞提供理想的锚定位点，而且还实现了tgf-β1的定位生物活性以诱导沿j/t/m nm的软骨形成分化。相比之下，阳性对照组显示出一些软骨形成，但是没有细胞排列(图16a(ii))。重要的是注意tgf-β1需要结合至细胞表面受体，从而为生物活性的。当细胞黏附nm并且沿nm生长时，细胞可以使jbnt容易地消化/降解。由于模拟dna的结构，jbnt可以分解成通过低ph或酶触发(例如被细胞吸收)的小分子单元。因此，当细胞沿nm生长时，细胞可以使jbnt逐渐地降解并使包裹的tgf-β1暴露。这可能是hmsc优选地生长长nm的另一个原因(图7a)。令人感兴趣的是，天然ecm具有保留tgf-β1的相似机理。此外，如通过爱茜蓝的阴性染色或非常弱的染色证明的，其他组呈现出没有软骨形成分化或低的软骨形成分化(图16a(iii)至图16a(vi))。令人感兴趣的是，虽然将相同剂量的tgf-β1添加至仅tgf-β1的组和j/t/m nm组中，但是只有j/t/m nm组对软骨形成的促进表现出显著的效果(图7a(i)、图7a(iv))。这个结果证实了封装在叠
层结构中的tgf-β1呈现出了更高的长期生物活性。观察到了仅jbnt的组的另一个有趣的发现：虽然单独的jbnt不诱导软骨形成，但是hmsc优选地粘附在jbnt纤维上，从而确定jbnt显著地促进干细胞锚定(图16a(vi))。这种发现对软骨组织工程而言是重要的，因为成功的组织支架应能够将干细胞或软骨细胞保留在期望位置(例如软骨缺陷)处用于再生。基于光显微术图像分析了jbnt纤维上锚定的hmsc的百分比和细胞密度。在j/t/m nm组中，87.4％的hmsc细胞簇集在j/t/m nm束的旁边，这高于单独的jbnt组(77.2％)。与其他组相比，j/t/m nm组的细胞密度明显地提高，这是j/t/m nm具有优异的关于促进细胞黏附和增殖的能力的另一个有力的证据(图16b、图24)。
[0202]
研究了软骨形成分化标记物和过度生长标记物。如图17a至图17b中所示，j/t/m nm组具有比阴性对照显著更高的聚集蛋白聚糖和ii型胶原蛋白(col2a1)基因表达，证明j/t/m nm可以显著地促进干细胞软骨形成分化。此外，爱茜蓝染色(图16)证明了j/t/m nm组中的聚集蛋白聚糖的蛋白质水平显著地高于其他组，与基因表达结果一致。重要的是，与恒定地供应有新鲜软骨形成培养基和tgf-β1的阳性对照相比，j/t/mnm组产生相似的软骨形成能力，可能是因为nm的叠层结构使tgf-β1稳定并且随后产生tgf-β1的持久生物活性。该发现对于软骨组织工程而言是重要的，因为游离的tgf-β1具有短的血浆半衰期(《100分钟)。此外，虽然阳性对照组促进软骨形成，但是其呈现出差的稳态，如通过分化细胞中的过度生长标记物(x型胶原蛋白和印度刺猬因子(ihh))的增加的基因表达水平证明的(图17c至图17d)。此外，软骨构建体的免疫染色确定了阳性对照组表达出显著量的x型胶原蛋白，而j/t/m nm组具有最少的x型胶原蛋白染色(图17e)。相比之下，j/t/m nm组织构建体(具有由jbnt/胞外基质蛋白-3微环境提供的抗过度生长特性)表现出强的防止过度生长的能力，其为软骨组织构建体的另一个重要的特性，因为成功的软骨组织构建体应长期保持稳态。
[0203]
在本文中，开发了用于软骨组织构建体的可注射叠层j/t/m nm。这种创新的叠层结构通过受控的自组装使得这种高度组织化的支架由分子水平(其在比常规3d打印和静电纺丝技术更小的尺度下)形成来实现。将tgf-β1限制在基体纤维的内层中以防止其泄漏至不期望的位置并且促进定位的软骨形成。此外，将胞外基质蛋白-3定位在基质纤维的外层中以创建抗过度生长的微环境。jbnt不仅用作支架结构骨架，而且还增强了干细胞锚定和粘附以将细胞沿支架纤维定位。以这种方式，干细胞和生长因子(tgf-β1)二者均沿nm纤维定位。因此，nm实现了用于在限定位置处的软骨组织再生的稳态微环境。此外，叠层j/t/m nm是可注射的。虽然nm为固体支架，但是其在水性环境中呈现出优异的结构柔性(由于模拟dna的jbnt骨架)并且可以通过移液管尖端注射，这可以广泛地用于不同的情况(例如难以到达的位置和不规则形状的骨折或腔)。在未来，由于证明了jbnt能够合并许多不同类型的蛋白质或治疗剂，因此可以定制基于jbnt的nm的叠层设计用于各种组织中的应用。总之，开发了为用于先进软骨组织构建体的有前途的平台的nm。
[0204]
实验部分
[0205]
材料。通过先前发表的并表明是有效的方法来合成jbnt。从lonza获得hmsc干细胞生长培养基bullet试剂盒。从millipore sigma购买c28/i2人软骨细胞细胞系。
[0206]
从lonza购买hmsc软骨形成分化培养基bulletkit
tm
(目录号pt-3003)。从r&d systems购买重组人胞外基质蛋白-3蛋白质。从peprotech购买重组人tgf-β1(cho衍生的)。从fisher scientific购买dmem、高葡萄糖细胞培养基(gibco)、胰蛋白酶-edta溶液
(0.25％，gibco)、乙醇(70％溶液)、1x磷酸盐缓冲盐水(pbs，gibco)、胎牛血清(fbs，gibco)、青霉素-链霉素(gibco，10,000u ml-1
)和爱茜蓝染色试剂盒(ph 2.5，vector)。从thermo fisher scientific购买triton x-100(invitrogen，1.0％)、固定剂溶液(在pbs中制备的4％甲醛)、蒸馏水、dapi核酸染料(invitrogen)、罗丹明毒伞素(invitrogen)、alexa488微量蛋白质标记试剂盒、alexa fluor 555微量蛋白质标记试剂盒、人tgf β1 elisa试剂盒(目录号bms249-4)、胶原蛋白x抗体(目录号pa5-97603)、山羊抗兔igg(h+l)高度交叉吸收的二次抗体、alexaplus 488(目录号a32731)、10％标准山羊血清(目录号50062z)、fluoromount-g
tm
封片剂(目录号00-4958-02)和trizol
tm
试剂。从millipore sigma购买cck-8试样。从sigma-aldrich购买琼脂糖(凝胶点36℃)(目录号a9539)。从qiagen购买plant mini kit。从bio-rad购买itaq
tm
通用sybr绿色一步试剂盒。
[0207]
从fisher scientific获得24孔和96孔平底细胞培养板(corning)(目录号分别为07-200-740和07-200-91)。从thermo fischer scientific购买未经处理的96孔板(目录号260887)，以及从corning购买384孔测定板(产品号3575)。从thermo fisher scientific购买1.5号玻璃盖玻片(目录号152250)。从thermo fisher scientific购买8孔腔室盖玻片系统(目录号155409pk)。从fisher scientific购买一次性比色皿(目录号14-955-128)。
[0208]
使用多模式微量培养板读取仪(m3)测量吸收值和荧光光谱。使用nanodrop分光光度计(nanodrop
tm one/one
c uv-vis)测量吸收光谱。应用lab6 20-120kv tem获得样品的高分辨率图像。使用leica sp8光谱共聚焦显微镜获得荧光染料标记的nm的图像。使用nikon a1r光谱共聚焦显微镜获得细胞的荧光图像。使用zetasizer nano zs(malvern panalytical)测量样品的ζ电位。使用pcr仪器(bio-rad)进行实时pcr。
[0209]
ζ电位测试。制备三个样品组。对于胞外基质蛋白-3组，将160μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3分散在640μl h2o中以获得800μl测试溶液。对于混合的胞外基质蛋白-3/tgf-β1组，将160μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3与40μl的10μg ml-1
tgf-β1混合并移液数次。然后将混合物分散在600μl h2o中以获得800μl测试溶液。对于j/t/m nm组，将160μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3与40μl的10μg ml-1
tgf-β1混合并移液数次。然后，将20μl的1mg ml-1 jbnt添加至溶液中并移液数次。最后，将j/t/m nm溶液分散在580μl h2o中以获得800μl测试溶液。用zetasizer nano zs测试三组样品的ζ电位值。
[0210]
uv-vis吸收光谱测量。制备四个样品组。对于jbnt组，将5μl的1mg ml-1 jbnt添加至50μl h2o中以获得100μg ml-1
jbnt溶液。对于胞外基质蛋白-3组，将40μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3添加至15μl h2o中以获得7.3μg ml-1
胞外基质蛋白-3溶液。对于tgf-β1组，将10μl的10μg ml-1 tgf-β1添加至45μl h2o中以获得1.8μg ml-1 tgf-β1溶液。对于j/t/m nm组，将40μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3与10μl的10μg ml-1 tgf-β1混合。然后，将5μl的1mg ml-1 jbnt添加至混合物溶液中并移液数次。jbnt、胞外基质蛋白-3和tgf-β1样品的最终浓度分别为100μg ml-1
、7.3μg ml-1
和1.8μg ml-1
。用nanodrop分光光度计测量各样品组的吸收光谱。
[0211]
tem表征。首先，将10μl的1mg ml-1 jbnt用40μl蒸馏水稀释以获得200μg ml-1 jbnt溶液。接着，将30μl的100μg ml-1
胞外基质蛋白-3与20μl的100μg ml-1 tgf-β1混合并移液数次。最后，将10μl的1mg ml-1 jbnt添加至混合物溶液中以制备j/t/m nm样品。在进行
阴性染色之前，将两片载网用等离子清洗机harrick plasma pdc-32g进行清洗。如下对试样进行阴性染色过程：将3μl jbnt溶液(200μg ml-1
)和3μl j/t/m nm溶液各自滴在单独的载网上并静置2分钟。然后，将100μl乙酸铀酰溶液(0.5％)移液到溶液上以冲洗各载网。将过量的溶液用滤纸从载网中除去并将载网空气干燥。最后，用lab620-120kv tem进行试样表征。
[0212]
j/t/m nm制备的录像记录。首先，将8μl的1mg ml-1
水溶液中的tgf-β1添加至32μl的1mg ml-1
胞外基质蛋白-3水溶液中并移液数次。然后，将80μl的1mg ml-1
水溶液中的jbnt添加至tgf-β1/胞外基质蛋白-3混合溶液中并移液数次。在添加jbnt之后立即产生白色絮凝物。使用2μl至200μl移液管尖端(具有与19号针相同的尖端直径)用于nm注射。录像记录捕捉自组装的过程。
[0213]
荧光光谱测量。使用alexa488微量蛋白质标记试剂盒来标记tgf-β1。荧光染料标记的tgf-β1(tgf-β1-alexa488)的最终浓度为20μg ml-1
。使用alexa fluor 555微量蛋白质标记试剂盒来标记胞外基质蛋白-3。荧光染料标记的胞外基质蛋白-3(胞外基质蛋白-3-alexa555)的最终浓度为80μg ml-1
。
[0214]
制备五个样品组。对于jbnt组，将5μl的1mg ml-1 jbnt添加至40μl h2o中以获得111μg ml-1
jbnt溶液。对于tgf-β1-alexa488组，将20μl的20μg ml-1 tgf-β1-alexa488分散在25μl h2o中以获得8.9μg ml-1
测试溶液。对于胞外基质蛋白-3-555组，将20μl的80μg ml-1
胞外基质蛋白-3分散在25μl h2o中以获得36μg ml-1
测试溶液。对于tgf-β-alexa488/胞外基质蛋白-3-alexa555混合组，将20μl的80μg ml-1
胞外基质蛋白-3-alexa555与20μl的20μg ml-1 tgf-β1-alexa488以及5μl h2o混合。然后，将混合物溶液移液数次。对于tgf-β-alexa488/胞外基质蛋白-3-alexa fluor 555/jbnt nm组，将20μl的20μg ml-1 tgf-β1-alexa488与20μl的80μg ml-1
胞外基质蛋白-3-alexa555混合并移液数次。然后，将5μl的1mg ml-1 jbnt添加至溶液中并移液数次。jbnt、tgf-β1-alexa488和胞外基质蛋白-3-alexa555样品的最终浓度分别为111μg ml-1
、8.9μg ml-1
和36μg ml-1
。
[0215]
将各样品组添加至黑色的384孔板的一个孔中。用多模式微量培养板读取仪测量样品的荧光光谱。用于测量的激发波长为488nm。
[0216]
用于荧光染料标记的nm的共聚焦成像。对于共聚焦成像。将10μl的20μg ml-1 tgf-β1-alexa488与10μl的80μg ml-1
胞外基质蛋白-3-alexa555混合并移液数次。然后，将5μl的1mg ml-1 jbnt添加至混合溶液中并移液数次以形成tgf-β-alexa488/胞外基质蛋白-3-alexa555/jbnt nm。由于聚集的nm，可以在溶液中看到一些红色絮凝物。然后，将10μl的包含红色絮凝物的nm溶液放置在1.5号玻璃盖玻片上。将过量的溶液用滤纸除去，同时红色絮凝物保留在盖玻片上。用leica sp8光谱共聚焦显微镜拍摄共聚焦图像。
[0217]
j/t/m nm稳定性测试。使用人tgf β1 elisa试剂盒测试tgf-β1从琼脂糖水凝胶中
的j/t/m nm中的释放百分比。如下制备琼脂糖水凝胶中的j/t/m nm。将10μl的10μg ml-1 tgf-β1与40μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3、5μl的1mg ml-1
jbnt和195μl pbs混合以制备j/t/m nm溶液。然后将j/t/m nm溶液与250μl 2％琼脂糖混合以得到j/t/m nm琼脂糖水凝胶。使用500μl pbs作为释放溶液并将其每3天进行更换。在15天之后，用elisa试剂盒测试所有收集的释放溶液。每3天测试j/t/m nm溶液的uv-vis吸收光谱以探索其稳定性。使用jbnt溶液、胞外基质蛋白-3溶液、tgf-β1溶液和jbnt+胞外基质蛋白-3溶液作为对照组。
[0218]
细胞毒性测定。将hmsc和人软骨细胞接种在两个单独的96孔板上。板的每个孔接收100μl包含5,000个细胞的细胞悬浮液。将两个板在细胞培养孵育箱中孵育24小时(37℃，5％co2)。然后每个孔接收100μl不同浓度的在蒸馏水中稀释的jbnt。将jbnt浓度梯度设定为5μg ml-1
、1μg ml-1
、0.5μg ml-1
和0μg ml-1
。对于各组，使用6个孔用于测试。在24小时孵育之后，每个孔接收10μl cck-8溶液并将其孵育另外的2小时。用多模式微量培养板读取仪在450nm下测量板的吸收值。
[0219]
对预涂覆琼脂糖的粘附测试。制备五个样品组。对于jbnt组，将10μl的1mg ml-1 jbnt添加至230μl蒸馏水中以获得240μl jbnt溶液。对于tgf-β1组，将20μl的100μg ml-1 tgf-β1分散在220μl蒸馏水中。对于胞外基质蛋白-3组，将80μl的100μg ml-1
胞外基质蛋白-3分散在160μl蒸馏水中。对于j/t/m nm组，将20μl的100μg ml-1 tgf-β1与80μl的100μg ml-1
胞外基质蛋白-3混合并移液数次。然后，将10μl的1mg ml-1 jbnt添加至溶液中。在将溶液移液数次之后，将其用130μl蒸馏水稀释。作为对照组，使用240μl蒸馏水。为了涂覆96孔板，制备1.0重量％的琼脂糖溶液。在将板用琼脂糖涂覆10分钟之后，针对每个组指定6个孔。每个孔接收40μl样品和70μl琼脂糖。将板放置在生物安全柜中并空气干燥5小时。然后，将100μl包含8,000个细胞的hmsc悬浮液添加至具有样品的每个孔中。将细胞孵育40分钟(37℃，5％co2)。更换细胞培养基以除去未附着的细胞。使用光显微镜对每个组拍摄附着的细胞的图片。
[0220]
对预涂覆盖玻片室的粘附测试。准备两个腔室盖玻片用于粘附实验。每个腔室盖玻片包括五个样品组。对于jbnt组，将1.25μl的1mg ml-1 jbnt用198.75μl蒸馏水稀释以获得200μl溶液。jbnt溶液的浓度为6.25μg ml-1
。对于胞外基质蛋白-3组，将10μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3用190μl蒸馏水稀释以获得0.5μg ml-1
溶液。对于tgf-β1组，将2.5μl的10μg ml-1 tgf-β1用197.5μg ml-1
蒸馏水稀释以获得0.125μg ml-1
溶液。对于j/t/m nm组，将10μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3与2.5μl的10μg ml-1 tgf-β1混合并移液数次。接着，将1.25μl的1mg ml-1 jbnt添加至混合物溶液中并移液。然后，添加186.25μl蒸馏水以获得200μl nm溶液。作为对照组，使用200μl蒸馏水。将每个样品组添加至1.5号腔室盖玻片的一个孔中。将腔室盖玻片放置在-80℃冷藏箱中一个小时，然后用冻干仪器冷冻干燥。
[0221]
将hmsc和人软骨细胞(10,000个细胞/每个孔)接种在单独的腔室盖玻片上。将两个腔室盖玻片在37℃孵育箱中孵育4小时。然后，将细胞培养基用滴管移出并将细胞用pbs冲洗两次。将细胞用4％多聚甲醛固定5分钟。将固定剂溶液除去。将细胞用pβs冲洗两次，并将细胞用100μl 0.1％triton
tm-x孵育10分钟。在用pbs两次冲洗之后，将100μl的0.165μm罗丹明-毒伞素添加至每个孔中持续30分钟。接着，使用0.1μg ml-1 dapi将细胞核染色。在5分钟孵育之后，将dapi用滴管移出。最后，将细胞用pbs冲洗两次。
[0222]
使用nikon a1r光谱共聚焦显微镜来观察形态并获得细胞的荧光图像。用细胞廓
线仪、matlab和image j进行细胞的数目和形态的分析。
[0223]
细胞增殖。将五个样品组添加至未经处理的96孔板中用于细胞增殖实验。对于jbnt组，将3.75μl的1mg ml-1 jbnt添加至596.25μl蒸馏水中以获得600μl jbnt溶液。溶液的浓度为6.25μg ml-1
。对于tgf-β1组，将7.5μl的10μg ml-1 tgf-β1分散在592.5μl蒸馏水中以获得0.125μg ml-1
测试溶液。对于胞外基质蛋白-3组，将30μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3分散在570μl蒸馏水中以获得0.5μg ml-1
测试溶液。对于j/t/m nm组，将7.5μl的10μg ml-1 tgf-β1与30μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3混合并移液数次。然后，将3.75μl的1mg ml-1
jbnt添加至溶液中并移液。将j/t/m nm溶液用558.75μl蒸馏水稀释。jbnt、tgf-β1和胞外基质蛋白-3样品的最终浓度分别为6.25μg ml-1
、0.125μg ml-1
和0.5μg ml-1
。作为对照组，使用600μl蒸馏水。将每个样品组分为6个孔，其中每个孔接收100μl样品。将三个板放置在-80℃冷藏箱中一个小时，然后用冻干仪器冷冻干燥。
[0224]
将hmsc接种在这些板上。每个孔接收100μl包含5,000个细胞的细胞悬浮液。将三个板在37℃下孵育1天、3天、或5天(5％co2)。在孵育之后，将10μl cck-8溶液添加至每个具有细胞的孔中。然后，将每个板在37℃下孵育另外的2小时。用多模式微量培养板读取仪在450nm下测量板的吸收值。将一系列已知数量的hmsc接种在96孔板上。在孵育4小时之后，用cck-8试样测量细胞的吸收值。根据hmsc的吸收值和数目生成标准曲线。用吸收标准曲线计算细胞增殖。
[0225]
用实时pcr进行细胞分化测试。制备七个样品组。对于每个组，将20μl细胞悬浮液(4
×
104个细胞)与30μl溶液/pbs以及50μl 2.0重量％琼脂糖混合以制备一个琼脂糖组织构建体。如下制备溶液。对于tgf-β1组，将5μl的10μg ml-1 tgf-β1用25μl pbs稀释以获得1.6μg ml-1
溶液。对于胞外基质蛋白-3组，将20μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3用10μl pbs稀释以获得6.7μg ml-1
溶液。对于jbnt组，将2.5μl的1mg ml-1 jbnt用27.5μl pbs稀释以获得83.3μg ml-1
溶液。对于j/t/m nm组，将20μl的10μg ml-1
胞外基质蛋白-3与5μl的10μg ml-1 tgf-β1混合并将混合物移液数次。然后，将2.5μl的1mg ml-1 jbnt添加至混合物溶液中并移液，然后用2.5μl pbs稀释。最后，对于各对照组，使用30μlpbs代替样品。
[0226]
对于每个孔，添加0.5ml细胞培养基并将培养基每三天进行更换。对于阳性对照组，使用具有另外的tgf-β1的商业hmsc软骨形成培养基用于细胞培养。对于阳性对照和tgf-β1以及j/t/m nm组，使用相同剂量的tgf-β1。对于一个阴性对照组，应用不具有tgf-β1的商业hmsc软骨形成分化细胞培养基。对于第二阴性对照组，应用具有10％fbs的dmem细胞培养基。对于其他测试组，使用不具有tgf-β1的商业hmsc软骨形成细胞培养基。在15天之后，收获组织构建体。用trizol
tm
试剂和plant mini kit提取总的rna。进行qpcr以分析分化。
[0227]
用免疫染色进行x型胶原蛋白表达测定。制备琼脂糖组织构建体并将其以与在“用实时pcr进行细胞分化测试”部分中所作的相同的方式培养。在15天之后，收获组织构建体并将其用于免疫染色和爱茜蓝染色。将组织构建体用4％甲醛固定一天，然后浸渍在30％蔗糖溶液中过夜。使用最佳切割温度复合试剂包埋这些组织构建体。制备20μm冷冻部分用于免疫染色。将冷冻部分用col x抗体和alexa fluor 488标记的二次抗体染色，然后用共聚焦显微术进行观察。
[0228]
用爱茜蓝染色进行细胞分化测试。从每个孔中用滴管移出细胞培养基。将每个组
织构建体用pbs冲洗三次，然后将组织构建体用4％甲醛固定30分钟。将固定剂溶液除去并将组织构建体用pbs冲洗三次。将乙酸溶液施加至组织构建体15分钟。在将过量的溶液除去之后，在37℃下施加爱茜蓝溶液45分钟。然后将组织构建体用乙酸溶液冲洗三次以除去大部分的过量爱茜蓝溶液。在37℃下将乙酸溶液施加至组织构建体一天，并将溶液用滴管移出数次以除去剩余的游离染料。使用显微术对hmsc进行成像。
[0229]
统计。将数据表达为平均值+/-平均值的标准误差。使用用于参数数据的学生t-测试和anova，然后是用于非参数数据的dunn事后分析来进行统计，其中认为p＜0.05在统计学上是显著的。

技术特征：
1.一种自组装纳米材料，包含其上非共价地粘附有生物学活性分子的詹纳斯碱基纳米管，其中所述生物学活性分子包括细胞外基质(ecm)分子、生物活性分子、或其组合。2.根据权利要求1所述的纳米材料，其中所述ecm分子包括羟基磷灰石、纤连蛋白、matn1、matn3、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、原纤维蛋白、串珠蛋白聚糖、纤维蛋白原、骨粘连蛋白、生腱蛋白、血小板应答蛋白、细胞间黏附分子、整联蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、或其组合。3.根据权利要求1或2所述的纳米材料，其中所述ecm分子包括i型胶原蛋白或ii型胶原蛋白。4.根据权利要求1或2所述的纳米材料，其中所述ecm分子包括icam1-5。5.根据权利要求1或2所述的纳米材料，其中所述ecm分子包括聚集蛋白聚糖或糖胺聚糖。6.根据权利要求1或2所述的纳米材料，其中所述ecm分子包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、或硫酸肝素。7.根据权利要求1至6中任一项所述的纳米材料，其中所述生物活性分子包括tgfβ、vegf、igf、egf、pdgf、bmp、fgf、gdnf、hgf、pgf、ngf、tnf-α、sdf-1、地塞米松、sirna、mirna、生长因子、小分子药物、或其组合。8.根据权利要求1至7中任一项所述的纳米材料，其中所述纳米材料包含仅一种类型的詹纳斯碱基纳米管和仅一种生物学活性分子，以及所述生物学活性分子不是羟基磷灰石或matn3。9.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(i)的化合物：或其可药用盐，其中：n为1、2、3、4、5、或6；r1选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽；以及r2选自h、ch3和nhr
z
，其中r
z
为h或c1至c
20
脂族基团。10.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(iii)的化合物：或其可药用盐，其中：n为1、2、3、4、5、或6；
r5选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，r6和r7各自独立地选自h、ch3和nhr
z
；以及r
z
为h或c1至c
20
脂族基团。11.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(v)的化合物：或者其可药用盐或酯，其中：n为1、2、3、4、5、或6；r
11
选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，r2、r6和r7各自独立地选自h、ch3和nhr
z
；以及r
z
、r
12
和r
16
各自独立地为h或c1至c
20
脂族基团。12.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(vii)的化合物：或者其可药用盐或酯，其中：n为1、2、3、4、5、或6；r
15
选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，以及r
16
为h或c1至c
20
脂族基团。13.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(ii)的化合物：或其可药用盐，其中：n为1、2、3、4、5、或6；r3选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽，r4为h、ch3、或nhr
z
；以及r
z
为h或c1至c
20
脂族基团。14.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(iv)的化合物：
或其可药用盐，其中：n为1、2、3、4、5、或6；r8选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽；r9和r
10
各自独立地为h、ch3、或nhr
z
；以及r
z
为h或c1至c
20
脂族基团。15.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(vi)的化合物：或其可药用盐，其中：n为1、2、3、4、5、或6；r
13
选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽；以及r
14
为h或c1至c
20
脂族基团。16.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(viii)的化合物：或其可药用盐，其中：n为1、2、3、4、5、或6；r
17
选自α-氨基酸、β-氨基酸、α-多肽和β-多肽；以及r
18
为h或c1至c
20
脂族基团。17.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(ix)的化合物：
或其可药用盐，其中：x为ch或氮；r2为氢或c1至c
20
连接基团；y在r2为氢时不存在，或者为氨基酸或多肽，其具有与所述氨基酸的α-碳共价键合的氨基，并且所述氨基与连接基团r2共价键合；以及r1为氢或c1至c
20
脂族部分，例如烷基，直链或支链的、饱和或不饱和的烷基。18.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米材料，其中所述詹纳斯碱基纳米管包含式(xi)的化合物：或其可药用盐，其中：x为ch或氮；r2为氢或c1至c
20
连接基团；y在r2为氢时不存在，或者为氨基酸或多肽，其具有与所述氨基酸的α-碳共价键合的氨基，并且所述氨基与连接基团r2共价键合；以及r1为氢或c1至c
20
脂族部分，例如烷基，直链或支链的、饱和或不饱和的。19.根据权利要求1至18中任一项所述的纳米材料，呈单隔室纳米材料的形式。20.根据权利要求1至18中任一项所述的纳米材料，呈多隔室纳米材料的形式。21.根据权利要求20所述的纳米材料，其中所述多隔室纳米材料为双隔室纳米材料。22.一种可注射组合物，包含根据权利要求1至21中任一项所述的纳米材料和可药用载体。23.一种组织芯片，包含微流控细胞和根据权利要求1至21中任一项所述的纳米材料。24.一种组织工程的方法，包括将根据权利要求22所述的可注射组合物注射到组织中。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述组织选自软骨、骨、脑、脊椎、关节、神经、韧带和肌腱、骨髓、心脏、眼睛、肝、肾和肺。

技术总结
本文公开了自组装纳米材料，所述自组装纳米材料包含其上非共价地粘附有生物学活性分子的詹纳斯碱基纳米管，其中生物学活性分子为细胞外基质(ECM)分子、生物活性分子、或其组合。合。合。


技术研发人员：陈玉鹏
受保护的技术使用者：康涅狄格大学
技术研发日：2021.10.13
技术公布日：2023/7/22