筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法和包含IL-15作为活性成分的用于预防或治疗癌症疾病的组合物

筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法和包含il-15作为活性成分的用于预防或治疗癌症疾病的组合物
技术领域
1.本公开涉及筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法，以及筛选具有免疫抗癌活性以抑制癌细胞的外泌体分泌或阻抑程序性凋亡配体1的表达的细胞因子的方法。
2.本公开涉及用于预防或治疗癌症疾病的组合物，该组合物包含通过筛选而选择的il-15或其表达促进剂或激活剂作为活性成分。


背景技术：

3.癌症是由细胞异常生长引起的疾病，据报道，癌症患者的死亡率很高，它在韩国的死因中排名第一。存在几十种的癌症类型，主要根据来源组织进行分类。癌症分为良性肿瘤和恶性肿瘤，其中良性肿瘤具有相对较慢的生长速度，并且几乎不会显示出从肿瘤的原发部位向其他组织的转移，而恶性肿瘤由于通过浸润入远离原发部位的其他组织中而快速生长，由此威胁生命。
4.将手术、化疗和放射治疗用于癌症的治疗方法，尽管已有长期研究，但据报道，接受过治疗的癌症患者中的多于50％死亡。尽管应用了各种治疗方法，但癌症仍难以治疗的原因是，即使通过手术切除癌症来治愈癌症患者，癌症也会因癌细胞转移到患者的其他组织而复发，或者尽管在初始治疗阶段由于抗癌药物的作用，肿瘤的大小减小，但由于癌细胞在治疗期间或治疗后对抗癌药物表现出耐药性，癌症的预后急剧恶化。
5.尤其是，作为常用的化疗剂的抗癌药物主要通过抑制癌细胞增殖的机制而显示出抗癌作用，并且已开发出约60种不同类型的抗癌药物。然而，大多数抗癌药物无法选择性地仅清除癌细胞，从而产生影响正常细胞的副作用。此外，由于癌细胞产生耐药性，这些化疗抗癌药物在癌症治疗中不起作用。
6.为了克服传统抗癌药物的问题，靶向抗癌药物和使用免疫细胞的抗癌治疗已经被开发为专门作用于癌细胞的治疗方法。然而，这些治疗方法根据患者的特征而显示出治疗效率的差异，以至于该问题仍然没有解决，例如由于免疫系统的过度激活而导致急性炎症性疾病的发展。因此，为了预防癌症的发生和治疗癌症，急需开发毒性较小且针对癌细胞而不会诱导癌细胞产生耐药性的新的治疗方法。
7.另一方面，外泌体是由体内大多数细胞分泌的膜状小泡。外泌体的直径约为30-200nm，并且外泌体中包括来自细胞的各种遗传物质(dna、rna、mirna)、蛋白质和脂质。外泌体源自细胞内被称为多囊泡体(mvbs)的特定隔室，不是直接从质膜脱落，而是被释放和分泌到细胞外。特别是，已知由癌细胞分泌的外泌体在癌症的进程中影响癌症转移、新生血管和癌细胞的增殖。抑制这些癌细胞中的外泌体分泌可能会降低外泌体在癌症进程中的功能，从而抑制癌细胞的增殖和转移。
8.此外，免疫检查点分子之一的程序性细胞死亡1(pd-1)已成为多种癌症的治疗靶标。pd-1在活化后的t细胞中水平上升，并且在肿瘤浸润淋巴细胞中常见的耗竭的t细胞中丰富。如果pd-1与其配体程序性细胞死亡配体1(pd-l1)之间的相互作用被阻断，那么在一
些患者中可以看到优秀的抗肿瘤应答和临床效果。最近，基于免疫疗法的各种癌症治疗方法的研究和开发已经开始。此外，据透露，fda批准的免疫疗法在治疗各种癌症方面取得了积极成果。然而，存在如下缺点，它的适用范围限于某些患者，因为它需要高的治疗成本，并且并不是在所有患者中都能诱导出一致的应答性。因此，有必要研究和开发新构思的抗癌药物，该药物可通过使用表现出免疫检查点抑制作用和外泌体分泌抑制作用的细胞因子，最大化癌症的增殖、转移和治疗功效。
9.[现有技术文献]
[0010]
[专利文献]
[0011]
韩国专利公开第10-2018-0090122号


技术实现要素：

技术目标
[0012]
本公开的目的是提供通过如下筛选具有免疫抗癌活性的细胞因子的方法：使用慢病毒转化癌细胞，该慢病毒包括载体，该载体包括编码细胞因子的基因、编码接头的接头结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域。
[0013]
本公开的另一个目的是提供用于预防或治疗癌症疾病的药物组合物。
[0014]
本公开的另一个目的是提供抑制癌细胞来源的外泌体的分泌和pd-l1表达的方法。
[0015]
本公开的另一个目的是提供用于增加免疫细胞来源的外泌体的分泌并阻抑pd-1和ctla-4的表达的方法。技术方案
[0016]
本公开提供了筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法，所述方法包括：(1)制备载体，所述载体包括编码细胞因子的基因、编码接头的接头结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域；(2)制备含有操作(1)中制备的载体的慢病毒；(3)用操作(2)中制备的慢病毒转化癌细胞；以及(4)当操作(3)中转化的癌细胞中的pd-l1的表达水平或与外泌体分泌相关的基因的表达水平比起未转化的对照细胞降低时，确定操作(1)中的细胞因子具有免疫抗癌活性。
[0017]
此外，本公开提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物包含通过筛选方法选择的免疫抗癌活性细胞因子作为活性成分。
[0018]
此外，本公开提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物包含il-15或其表达促进剂或激活剂作为活性成分。
[0019]
此外，本公开提供了抑制癌细胞来源的外泌体分泌和pd-l1表达的方法，所述方法包括向受试者施用il-15或其表达促进剂或激活剂。
[0020]
此外，本公开提供了用于增加免疫细胞来源的外泌体的分泌并抑制pd-1和ctla-4的表达的方法，所述方法包括向受试者施用il-15或其表达促进剂或激活剂。有益效果
[0021]
根据本公开，通过用包含编码细胞因子的基因、编码接头的接头结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域的载体转化癌细胞，可以选择出表现免疫抗癌活性以抑制与外泌体分泌相关的基因的表达水平或pd-l1的表达水平的细胞因子，并且所选择的细胞因子可以被提供作为新的抗癌药物。
[0022]
此外，在本公开中，发现当将通过筛选而选择的il-15处理癌细胞时，由于抑制了癌细胞来源的外泌体的分泌，同时阻抑了诱导细胞毒性t细胞免疫逃逸的pd-l1的表达，从而增强了抗癌作用，并且还确认了il-15表现出直接针对癌细胞的抗癌作用。同时，发现当il-15激活细胞毒性t细胞、阻抑作为免疫检查点的pd-1和ctla-4的表达以减少癌细胞的免疫逃逸、以及增强细胞毒性t细胞的外泌体的分泌时，产生免疫抗癌作用，使得il-15或其表达促进剂或激活剂可用作预防或治疗癌症疾病的组合物。
附图说明
[0023]
图1示出了如下方法，该方法通过用由编码细胞因子的基因、编码接头的接头结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域组成的载体转化癌细胞来筛选免疫抗癌活性细胞因子。
[0024]
图2示出了根据本公开的用于筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法，用在表面上表达的202种细胞因子来鉴别癌细胞中的pd-l1的表达水平的变化的结果。
[0025]
图3示出了根据本发明的用于筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法，按照细胞因子家族用在表面上表达的202种细胞因子对癌细胞进行分类，并鉴别pd-l1的表达水平的变化的结果。
[0026]
图4示出了根据本公开的筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法，用在表面上表达的202种细胞因子鉴别癌细胞中与外泌体分泌相关的基因的表达水平的变化。
[0027]
图5示出了根据本公开的筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法，按照细胞因子家族用在表面上表达的202种细胞因子对癌细胞进行分类，并鉴别与外泌体分泌相关的基因的表达水平的变化的结果。
[0028]
图6示出了根据本公开的筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法分离202种细胞因子，以及鉴别其中降低与外泌体分泌相关的基因的表达并同时降低pd-l1的表达的细胞因子的结果。
[0029]
图7示出了鉴别通过本公开的筛选而选择的il-15降低乳腺癌细胞系中的pd-l1表达的结果。
[0030]
图8示出了鉴别通过本公开的筛选而选择的il-15降低乳腺癌细胞系中的外分泌体分泌调节基因的表达的结果。
[0031]
图9示出了鉴别在乳腺癌细胞中通过il-15降低外泌体表达的结果。
[0032]
图10示出了鉴别在乳腺癌细胞中通过il-15降低外泌体pd-l1的表达的结果。
[0033]
图11示出了鉴别细胞毒性t细胞和经il-15处理的乳腺癌细胞的共培养物中的乳腺癌细胞凋亡的结果。
[0034]
图12示出了鉴别细胞毒性t细胞的抗癌活性增加的结果。
[0035]
图13示出了鉴别细胞毒性t细胞中通过il-15降低pd-1和ctla-4表达的结果。
[0036]
图14示出了鉴别经il-15处理的细胞毒性t细胞中的外泌体分泌相关的基因和外泌体数量的变化。
[0037]
图15示出了鉴别经il-15处理的细胞毒性t细胞和乳腺癌细胞的共培养物中的乳腺癌细胞凋亡的结果。
具体实施方式
[0038]
考虑到本文中的功能，本文中使用的术语已尽可能地从当前广泛使用的通用术语中选择，但这些术语可能会根据本领域技术人员的意图或先例、新技术的出现等而变化。此外，在特定情况下，存在由申请人任意选择的术语，并且在这种情况下，将在本公开的说明书中详细描述其含义。因此，本文中使用的术语不应通过术语的简单名称来定义，而应基于术语的含义和本发明的整体内容。
[0039]
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术或科学术语)具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如在常用词典中定义的术语应被解释为具有与相关领域的情况下的含义一致的含义，并且除非在本技术中明确定义，否则不应被解释为理想的或过于正式的意思。
[0040]
数值范围包括上述范围内定义的数值。本文给出的所有最大数值限值包括所有较低的数值限值，如对较低的数值限值所清楚说明的。本文给出的所有最小数值限值包括所有较高的数值限值，如对较高的数值限值所清楚说明的。本文给出的所有数值限值将包括处于更宽的数值范围内的所有更好的数值范围，如对更窄的数值限值所清楚说明的。
[0041]
在下文中，将对本公开进行更详细的描述。
[0042][0043]
本公开提供了筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法，所述方法包括：(1)制备载体，所述载体包括编码细胞因子的基因、编码接头的接头结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域；(2)制备含有操作(1)中制备的载体的慢病毒；(3)用操作(2)中制备的慢病毒转化癌细胞；以及(4)当操作(3)中转化的癌细胞中的pd-l1的表达水平或与外泌体分泌相关的基因的表达水平比起未转化的对照细胞降低时，确定操作(1)中的细胞因子具有免疫抗癌活性。
[0044]
免疫抗癌活性是抑制外泌体分泌或阻抑pd-l1表达的活性。
[0045]
细胞因子可为选自于由如下所组成的组中的任一种或多种：areg、atp6ap1、bmp10、bmp2、bmp3、bmp5、bmp7、bmp15、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l1、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cd70、cer1、cklf、clcf1、cmtm1、cmtm2、cmtm3、cmtm5、cmtm6、cmtm7、cmtm8、cntf、csf1、csf2、csf3、csh1、csh2、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl2、cxcl3、cxcl6、cxcl9、cyp26b1、ebi3、epo、erap1、fam3b、fam3d、faslg、fgf10、fgf12、figf、gdf10、gdf15、gdf2、gdf3、gdf9、gh1、glmn、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna10、ifna13、ifna14、ifna17、ifna2、ifna21、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifnb1、ifne1、ifng、ifnw1、igl1、ik、il10、il11、il12a、il12b、il13、il15、il16、il17a、il17c、il17d、il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il1f5、il1f6、il1f7、il1f8、il1f9、il1rn、il2、il20、il22、il23a、il24、il25、il27、il28a、il28b、il29、il3、il32、il33、il4、il5、il6、il7、il8、il9、inha、inhba、inhbb、lass1、lefty1、lefty2、lif、lta、mdk、mif、mstn、nampt、nodal、nrg1、osm、pdgfa、pdgfb、pf4、pf4v1、pik3r1、ppbp、prl、pten、ptn、pxmp2、rhoq、scg2、scgb1a1、scgb3a1、scye1、sdcbp、sectm1、siva1、slco1a2、slurp1、spp1、thpo、tnf、tnfrsf11b、tnfsf10、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf14、tnfsf15、tnfsf18、tnfsf8、tnfsf9、tradd、trap1、trip6、tslp、txlna、tymp、vegfa、vegfc、wnt16、xcl1和xcl2。
[0046]
与外泌体分泌相关的基因是rab27a，并且使用包含由seq id no:1示出的序列和由seq id no:2示出的序列的引物组来测量rab27a的表达水平。
[0047]
使用包含由seq id no:3示出的序列和由seq id no:4示出的序列的引物组来测量pd-l1的表达水平。
[0048]
使用包含由seq id no:5至seq id no:24示出的序列的引物组来测量各种基因的表达水平。
[0049]
接头可具有选自于由seq id no:25至seq id no:35示出的氨基酸序列中的任何一个的重复1-20次的序列。
[0050]
跨膜结构域是选自于由如下所组成的组中的任何一种受体中包含的跨膜结构域：表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生生长因子(pdgf)受体、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、胆囊收缩素(cck)受体、神经营养因子(ngf)受体、肝细胞生长因子(hgf)受体、肾上腺素(eph)受体、血管生成素受体以及相关受体酪氨酸激酶(ryk)受体。
[0051]
此外，本公开提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物包含通过筛选方法选择的免疫抗癌活性细胞因子作为活性成分。
[0052]
癌症可以是选自于由如下所组成的组中的任一种，但不限于此：黑色素瘤、结肠癌、肺癌、皮肤癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、肛门癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤。
[0053]
细胞因子在癌细胞中抑制外泌体分泌或阻抑pd-l1的表达，其中，pd-l1在癌细胞中或在癌细胞生成的外泌体表面上表达。
[0054]
药物组合物可以以一种或多种外用制剂的形式配制，所述外用制剂选自于由乳膏剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、搽剂、糊剂(pastas)和贴膏剂所组成的组。
[0055]
本公开的药物组合物可以包含额外用于配制的药学上可接受的载体和稀释剂。药学上可接受的载体和稀释剂包括：赋形剂，如淀粉、糖和甘露醇；填充剂和增量剂，如磷酸钙；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素和羟丙基纤维素；粘合剂，如明胶、藻酸盐/酯和聚乙烯吡咯烷酮；润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、氢化蓖麻油和聚乙二醇；崩解剂，如聚维酮和交联聚维酮；以及表面活性剂，如聚山梨醇酯、鲸蜡醇和甘油，但不限于此。药学上可接受的载体和稀释剂可以与受试者在生物学和生理学上相容。稀释剂的实例可包括盐水、水性缓冲液、溶剂和/或分散介质，但不限于此。
[0056]
根据期望的方法，本公开的药物组合物可以口服或胃肠外(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，优选口服给药。此外，本公开的药物组合物的剂量范围根据受试者的体重、年龄、性别、健康状况和饮食、给药时间、给药方法、排泄速率和疾病的严重程度而变化，但不限于此。
[0057]
此外，本公开提供了保健功能性食品组合物，所述组合物包含通过筛选方法选择的免疫抗癌活性细胞因子作为活性成分。
[0058]
本公开通常可以作为常用的食品来应用。
[0059]
本公开的食品组合物可以用作保健功能性食品。本文所使用的术语“保健功能性食品”是指根据韩国保健功能性食品法，用具有对人体有用的功能性的原料或成分制造和加工的食品，并且本文所使用的术语“功能性”是指获得健康保健(例如人体结构和功能的生理作用或营养物质的调节)的有效性的摄入。
[0060]
本公开的食品组合物可以包含常见的食品添加剂，并且除非另有规定，否则作为“食品添加剂”的适用性根据韩国食品和药品安全部批准的韩国食品添加剂法典的通用规则和通用试验方法，由与相应项目相关的规范和标准进行确定。
[0061]“韩国食品添加剂法典”中列出的项目可包括例如：酮类、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸和肉桂酸等化合物，柿子色素、甘草提取物、结晶纤维素、高粱色素和瓜尔胶等天然添加剂，以及l-谷氨酸钠制剂、面条添加的碱剂、防腐剂和焦油着色剂等混合制剂。
[0062]
本发明的食品组合物可以以片剂、胶囊、粉剂、颗粒、液体剂和丸剂的形式制造和加工。
[0063]
例如，胶囊形式的保健功能性食品中的硬胶囊制剂可以通过将根据本公开的组合物与添加剂(如赋形剂)一起混合并填充在传统的硬胶囊中来制备，而软胶囊制剂可以通过将根据本公开的组合物与添加剂(如赋形剂)混合，然后将其填充在胶囊基质(如明胶)中来制造。如有必要，软胶囊制剂可包含增塑剂(如甘油或山梨醇)、着色剂和防腐剂。
[0064]
对赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增味剂和调味剂的术语的定义在本领域已知的文献中有所描述，并且包括具有相同或相似功能的那些。食品的类型没有特别限制，并包括普通意义上的所有保健功能性食品。
[0065]
本文中使用的术语“预防”是指通过施用根据本公开的组合物来阻抑或延缓疾病的任何作用。本文所使用的术语“治疗”是指通过施用根据本公开的组合物来改善或有利地改变疾病症状的任何作用。本文中使用的术语“改善”是指通过向个体施用根据本公开的组合物或使个体摄入该组合物来改善疾病的不良状态的任何作用。
[0066]
此外，本公开具体说明了il-15的表达或活性水平可以通过选自于由逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、蛋白质印迹和荧光激活细胞分选(facs)所组成的组中的任何一种或多种来测量，但不限于此。
[0067]
此外，本公开提供了抑制癌细胞来源的外泌体分泌和pd-l1表达的方法，该方法包括向受试者施用il-15或其表达促进剂或激活剂。
[0068]
此外，本公开提供了增加免疫细胞来源的外泌体的分泌并抑制pd-1和ctla-4的表达的方法，该方法包括向受试者施用il-15或其表达促进剂或激活剂。实施例
[0069]
为了帮助理解本公开，在下文中将详细地描述实验示例和示例的实施方式。然而，下面的实验示例和示例的实施方式仅仅是本公开的内容的说明，并且本公开的范围不限于下面的实验示例和示例的实施方式。提供本公开的实验示例和示例的实施方式以向本领域普通技术人员更完整地解释本公开。
[0070][0071]
实施例1：细胞培养
[0072]
将hek-293ft细胞(人胚肾)和mda-mb-231(人乳腺癌细胞系)在补充有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的dmem培养基(dulbecco's modified eagle's medium,hyclone)中
进行培养。将4t1(小鼠乳腺癌细胞系)在补充有10％ fbs、1％青霉素-链霉素(hyclone)的rpmi-1640培养基中进行培养。将ctll-2细胞(小鼠细胞毒性t淋巴细胞)在补充有10％ fbs、1％青霉素-链霉素和20iu/ml重组il-2(r&dsystem)的rpmi 1640培养基中进行培养。
[0073][0074]
实施例2：慢病毒的制备
[0075]
为了筛选根据本公开的免疫抗癌活性细胞因子，制备包含编码被预测显示出免疫抗癌活性的202种候选细胞因子的基因的载体，并使用慢病毒将其转化入癌细胞中。
[0076]
参考论文(proc natl acad sci u s a.2013may 14；110(20):8099-104)，制备包含编码细胞因子的基因、编码接头的接头结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域的载体。各载体被制备为包含编码202种细胞因子中的任一种的各基因，包括areg、atp6ap1、bmp10、bmp2、bmp3、bmp5、bmp7、bmp15、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l1、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cd70、cer1、cklf、clcf1、cmtm1、cmtm2、cmtm3、cmtm5、cmtm6、cmtm7、cmtm8、cntf、csf1、csf2、csf3、csh1、csh2、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl2、cxcl3、cxcl6、cxcl9、cyp26b1、ebi3、epo、erap1、fam3b、fam3d、faslg、fgf10、fgf12、figf、gdf10、gdf15、gdf2、gdf3、gdf9、gh1、glmn、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna10、ifna13、ifna14、ifna17、ifna2、ifna21、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifnb1、ifne1、ifng、ifnw1、igl1、ik、il10、il11、il12a、il12b、il13、il15、il16、il17a、il17c、il17d、il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il1f5、il1f6、il1f7、il1f8、il1f9、il1rn、il2、il20、il22、il23a、il24、il25、il27、il28a、il28b、il29、il3、il32、il33、il4、il5、il6、il7、il8、il9、inha、inhba、inhbb、lass1、lefty1、lefty2、lif、lta、mdk、mif、mstn、nampt、nodal、nrg1、osm、pdgfa、pdgfb、pf4、pf4v1、pik3r1、ppbp、prl、pten、ptn、pxmp2、rhoq、scg2、scgb1a1、scgb3a1、scye1、sdcbp、sectm1、siva1、slco1a2、slurp1、spp1、thpo、tnf、tnfrsf11b、tnfsf10、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf14、tnfsf15、tnfsf18、tnfsf8、tnfsf9、tradd、trap1、trip6、tslp、txlna、tymp、vegfa、vegfc、wnt16、xcl1和xcl2。
[0077]
通过以下方式制备待用于以载体转化细胞的慢病毒。将hek-293ft细胞以约1
×
106的细胞浓度接种在含有dmem培养基的6孔板中，所述dmem培养基补充有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素。在opti-mem(编号31985-070；gibco)培养基的存在下，将lipofectamine2000试剂(编号11668-027；thermo fisher scientific)、pcmvd(#ps100001；origene)和pvsvg(#1733；addgene)病毒包装载体与包含编码细胞因子的基因的载体以1:1:1的比例混合而进行处理，然后在37℃下过夜培养。第二天，除去上清液，并用含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的新鲜培养基更换培养基。培养48小时后，获取包含病毒的培养基上清液并离心，并使用不含表面活性剂的乙酸纤维素(sfca)膜过滤装置(0.45μm；corning)以去除细胞碎片。根据制造商的说明，通过lenti-x p24快速滴度试剂盒(#632200；takara)测量慢病毒的效价。分别分配慢病毒并在-80℃下冷冻。
[0078][0079]
实施例3：使用慢病毒转化入癌细胞
[0080]
为筛选根据本公开的显示出免疫抗癌活性的细胞因子，用实施2中制备的慢病毒
转化癌细胞。
[0081]
将mda-mb-231细胞(乳腺癌细胞)以约2.0
×
104细胞/孔的浓度接种在48孔板中。以10的感染复数(moi)的浓度用10μg/ml聚凝胺处理慢病毒。将用慢病毒处理的细胞混合物在室温下以1200g离心90分钟后，使之经受旋转接种，随后在37℃下培养过夜。去除多余的病毒，然后用补充有10％胎牛血清的新鲜dmem培养基更换培养基。
[0082][0083]
实施例4：经转化的癌细胞中的rab27a或pd-l1的表达水平的变化
[0084]
通过实时聚合酶链式反应(qrt-pcr)测定根据本公开的经转化的癌细胞中的rab27a的表达水平、与外泌体分泌相关的基因或pd-l1的表达水平是否发生变化。
[0085]
在将实施例3中的经转化的mda-mb-231细胞培养72小时后，根据制造商的说明，使用mrna提取试剂盒(direct-zol
tm rna microrep，#r2060；zymo research)从细胞中提取mrna，然后使用nanodrop(ds-11系列分光光度计；denovix)测量提取的mrna的浓度。根据制造商的说明，使用试剂盒(omniscript rt试剂盒，#205113；qiagen)将500ng所提取的mrna合成为cdna。为了鉴别每个经转化的癌细胞中的rab27a或pd-l1表达水平的变化，使用表1中的引物组和power sybr
tm green pcr master mix(#4367659；applied biosystems)进行qrt-pcr以用于分析。使用steponeplus实时pcr系统(applied biosystems)仪器进行qrt-pcr。
[0086]
表1
[0087][0088]
在归一化为同一样品中的gapdh的量后将每个样品中的rab27a或pd-l1的表达水平通过ct(比较性阈值周期)分析进行计算，并表达为来自初始ct值的经修正的2-δδct
值。
[0089][0090]
实施例5：经il-15处理的乳腺癌细胞中的pd-l1表达的分析
[0091]
5-1.实时聚合酶链式反应
[0092]
将mda-mb-231细胞(人乳腺癌细胞系)以约4.0
×
105细胞/孔的浓度接种在6孔板中。将4t1细胞(小鼠乳腺癌细胞系)以2.5
×
105细胞/孔的浓度接种，并在第二天以浓度为100ng/ml的il-15处理，然后培养24小时。培养后，根据制造商的说明，使用mrna提取试剂盒(direct-zol
tm rna microprep，#r2060；zymo research)从细胞中提取mrna，并使用nanodrop(ds-11系列分光光度计；denovix)测量提取的mrna的浓度。根据制造商的说明，使用试剂盒(omniscript rt kit,#205113；qiagen)将1000ng经提取的mrna合成为cdna。为了鉴别每个经转化的癌细胞中的pd-l1表达水平的变化，使用表1所示的引物组和power sybr
tm green pcr master mix(#4367659；applied biosystems)通过qrt-pcr进行分析。使用steponeplus实时pcr系统(applied biosystems)仪器进行qrt-pcr。
[0093]
在归一化为同一样品中的gapdh的量后将每个样品中的pd-l1的表达水平通过ct(比较性阈值周期)分析进行计算，并表达为来自初始ct值的经修正的2-δδct
值。结果如图7所示，发现在用il-15处理的mda-mb-231和4t1细胞中的pd-l1 mrna表达显著降低。
[0094]
5-2.蛋白质印迹
[0095]
用裂解缓冲液裂解细胞以制备细胞裂解物。然后通过sds-page分离细胞裂解物的蛋白质，并将其转移到硝化纤维素膜。此后，在室温下用5％脱脂奶粉和0.1％吐温-20封闭溶液(tbs-t)封闭膜1小时，并使之经受与pd-l1的一抗(ab210931；abcam)和β-肌动蛋白(cst，#4970)的反应，然后与hrp缀合的二抗反应。与各自的一抗在4℃下培养过夜，然后与hrp缀合的二抗在室温下培养1小时。将增强化学发光(ecl)检测试剂(#34095；thermo scientific，#rpn2209；ge healthcare)用于使图像可视化。结果如图7所示，发现在用il-15处理的mda-mb-231和4t1细胞中的蛋白质表达降低。
[0096][0097]
实施例6：经il-15处理的乳腺癌细胞中的外泌体分泌相关基因的分析
[0098]
6-1.实时聚合酶链式反应和蛋白质印迹
[0099]
为分析在il-15(100ng/ml)处理后由mda-mb-231和4t1细胞分泌的外泌体的变化，测量参与外泌体产生和分泌的酶(rab5、rab7、rab27a)的mrna表达。以与实施例5-1中相同的方式进行实时聚合酶链式反应，并使用表1中所示的引物。结果如图8所示，发现与对照组相比，经il-15处理的乳腺癌细胞中的rab5、rab7和rab27a的mrna表达降低。
[0100]
此外，使用所述细胞进行蛋白质印迹。以与实施例5-2中相同的方式进行蛋白质印迹，并且在该实验中使用的一抗如下：rab5(ab18211；abcam)、rab7(ab50533；abcam)和rab27a(ab55667；abcam)。结果如图8所示，发现与对照组相比，经il-15处理的乳腺癌细胞中的rab5、rab7和rab27a的蛋白表达降低。从上述结果发现，经il-15处理的乳腺癌细胞中的与外泌体分泌相关的基因减少。
[0101][0102]
实施例7：外泌体的分离和纯化
[0103]
在150mm的板上接种约6.4
×
106个mda-mb-231细胞(人乳腺癌细胞系)和4.0
×
106个4t1细胞(小鼠乳腺癌细胞系)。第二天，在无胎牛血清的dmem和rpmi培养基中进行接种，
并以浓度为100ng/ml的il-15进行处理，随后培养24小时。将各细胞在其中培养的培养基的上清液依次以300g、2500g和10000g进行连续离心。将离心后的上清液通过0.2μm注射器过滤器过滤，并以120000g离心以获得细胞外囊泡的团粒。将获得的团粒悬浮在pbs中，并在-80℃下冷冻保存。
[0104][0105]
实施例8：使用纳米粒子追踪分析乳腺癌细胞来源的外泌体
[0106]
使用配备有快速视频捕获和粒子追踪软件的nanosight lm10(malvern instruments)测量乳腺癌细胞(mda-mb-231，4t1)中的经纯化的外泌体的大小和浓度。结果如图9所示，通过纳米粒子追踪分析确定，与对照组相比，在用il-15处理的两种类型的乳腺癌细胞中的外泌体数量减少。
[0107][0108]
实施例9：对来源于经il-15处理的乳腺癌细胞的外泌体pd-l1的表达调控的分析
[0109]
为了评估il-15在乳腺癌细胞(mda-mb-231，4t1)中的功效，测量了pd-l1蛋白在外泌体中的表达，已知该蛋白对癌细胞的免疫逃逸最关键。使用外泌体进行蛋白质印迹。以与实施例5-2中相同的方式进行蛋白质印迹。结果如图10所示，发现与对照组相比，经il-15处理的两种类型的乳腺癌细胞中的pd-l1的蛋白表达显著降低。
[0110]
将外泌体与抗pd-l1(ab10931；abcam)抗体培养过夜，然后与fitc缀合的二抗(a11001；invitrogen/goat anti-mouse igg(h+l)cross-adsorbed secondary antibody alexa fluor 488)培养过夜，随后使用sev流式细胞仪(cytoflex/beckman coulter)进行分析。结果如图10所示，发现经il-15处理的样品中的外泌体pd-l1的表达量与对照组相比降低。
[0111][0112]
实施例10：对经il-15预处理的乳腺癌细胞的共培养的分析
[0113]
为了通过乳腺癌细胞中的pd-l1的减少以及细胞毒性t细胞活性的增加来证明il-15的抗癌作用，将经il-15处理的乳腺癌细胞4t1和细胞毒性t细胞共培养，以鉴别乳腺癌细胞的活力，如图11所示。使用具有细胞发光基因的乳腺癌细胞(4t1-luc-g5)，并使用mts和ivis spectrum(perkinelmer)进行分析。
[0114]
将乳腺癌细胞以约6.0
×
103细胞/孔的浓度接种入96孔板中，并用il-15(100ng/ml)进行预处理。培养24小时后，将该细胞与不同比例的ctll-2细胞(1:5至1:10)进行培养。培养结束时，向各孔加入mts试剂，然后在37℃下培养4小时。使用酶标仪测量490nm处的吸光度。
[0115]
此外，为分析4t1-luc-g5细胞的活力，使用发光和荧光动物体内成像系统(ivis)。将d-荧光素(p/n 122799；perkin)加入各孔中，并使用ivis软件测量荧光素。结果如图11所示，发现细胞毒性t细胞和经il-15处理的乳腺癌细胞的共培养组中的乳腺癌细胞的活力显著降低。
[0116][0117]
实施例11：对经il-15活化的ctll-2细胞的抗癌功效的分析
[0118]
接下来，用il-15处理细胞毒性t细胞，以评估外泌体的功效。简言之，将ctll-2细胞以2.0
×
105细胞/孔的密度接种在6孔板中，然后用il-15(100ng/ml)培养24小时。然后，
针对ki-67、ifn-γ、穿孔素和颗粒酶b实施流式细胞术。本实验中使用的一抗如下：ki-67(ab16667，1:500；abcam)、颗粒酶b(ab4059，1:500abcam)和ifn-g(ab9657，1:500，abcam)。结果如图12所示，当用il-15处理ctll-2细胞时，发现作为细胞增殖指示物的ki-67蛋白的表达与对照组相比增加。
[0119]
此外，当用il-15处理ctll-2细胞时，发现与对照组比较，作为细胞毒性指示物的ifn-γ和颗粒酶b蛋白的表达也增加。因此，确定il-15增强了细胞毒性t细胞的细胞毒性功能，从而提高了抗癌作用。
[0120][0121]
实施例12：对经il-15活化的ctll-2细胞中的免疫检查点的分析
[0122]
接下来，用il-15处理细胞毒性t细胞，以评估作为免疫检查点的pd-1和ctla-4的表达变化。此外，以与实施例5-1和实施例11中相同的方式鉴别经il-15处理的细胞毒性t细胞中的免疫检查点pd-1(程序性细胞死亡-1)和ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞抗原-4)的表达。结果如图13所示，与对照组相比，用il-15处理的细胞毒性t细胞中的pd-1和ctla-4的mrna和蛋白表达显著降低。这表明由于癌细胞与pd-l1的结合，细胞毒性t细胞中的减少的pd-1和ctla-4引起免疫逃逸减少，从而增强抗癌作用。
[0123][0124]
实施例13：经il-15处理的细胞毒性t细胞中的外泌体分泌变化的分析
[0125]
通过qrt-pcr和蛋白质印迹分析外泌体分泌相关基因rab5、rab7和rab27a在经il-15处理的ctll2细胞中的表达。结果如图14所示，发现与对照组相比，经il-15处理的细胞毒性t细胞中的rab5、rab7和rab27a的mrna和蛋白表达显著增加。
[0126]
此外，通过nta分析，与对照组相比，经il-15处理的ctll-2细胞分泌的外泌体增加。结果如图14所示，发现与对照组相比，用il-15处理的细胞毒性t细胞中的外泌体表达增加。这表明抗癌作用可以通过增加细胞毒性t细胞的外泌体来增强。
[0127][0128]
实施例14：对经il-15预处理的t细胞的共培养的分析
[0129]
将乳腺癌细胞以约6.0
×
103细胞/孔的浓度接种在96孔板中，并将用il-15预处理24小时的ctll-2细胞与不同比例的黑色素瘤细胞(1:5至1:10)共培养。培养结束时，向各孔加入mts试剂，并在37℃下培养4小时。使用酶标仪测量490nm处的吸光度。
[0130]
此外，为了分析4t1-luc-g5细胞的活力，使用发光和荧光动物体内成像系统(ivis)。将d-荧光素(p/n 122799；perkin)加入各孔中，并使用ivis软件测量荧光素。结果如图15所示，发现经il-15预处理的细胞毒性t细胞和乳腺癌细胞的共培养组中的乳腺癌细胞的活力显著降低。
[0131][0132]
如上所述，详细描述了本公开的内容的具体部分，对于本领域普通技术人员来说明显的是，该具体描述只是优选实施方式，并且本公开的范围不受此限制。换言之，本公开的实质范围可以由所附权利要求及其等同物来限定。

技术特征：
1.一种筛选免疫抗癌活性细胞因子的方法，所述方法包括：(1)制备载体，所述载体包括编码细胞因子的基因、编码接头的接头结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域；(2)制备含有操作(1)中制备的载体的慢病毒；(3)用操作(2)中制备的慢病毒转化癌细胞；以及(4)当操作(3)中转化的癌细胞中的pd-l1的表达水平或与外泌体分泌相关的基因的表达水平比起未转化的对照细胞降低时，确定操作(1)中的所述细胞因子具有免疫抗癌活性。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述免疫抗癌活性是抑制外泌体分泌或阻抑pd-l1表达的活性。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞因子是选自于由如下所组成的组中的任一种或多种：areg、atp6ap1、bmp10、bmp2、bmp3、bmp5、bmp7、bmp15、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l1、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cd70、cer1、cklf、clcf1、cmtm1、cmtm2、cmtm3、cmtm5、cmtm6、cmtm7、cmtm8、cntf、csf1、csf2、csf3、csh1、csh2、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl2、cxcl3、cxcl6、cxcl9、cyp26b1、ebi3、epo、erap1、fam3b、fam3d、faslg、fgf10、fgf12、figf、gdf10、gdf15、gdf2、gdf3、gdf9、gh1、glmn、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna10、ifna13、ifna14、ifna17、ifna2、ifna21、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifnb1、ifne1、ifng、ifnw1、igl1、ik、il10、il11、il12a、il12b、il13、il15、il16、il17a、il17c、il17d、il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il1f5、il1f6、il1f7、il1f8、il1f9、il1rn、il2、il20、il22、il23a、il24、il25、il27、il28a、il28b、il29、il3、il32、il33、il4、il5、il6、il7、il8、il9、inha、inhba、inhbb、lass1、lefty1、lefty2、lif、lta、mdk、mif、mstn、nampt、nodal、nrg1、osm、pdgfa、pdgfb、pf4、pf4v1、pik3r1、ppbp、prl、pten、ptn、pxmp2、rhoq、scg2、scgb1a1、scgb3a1、scye1、sdcbp、sectm1、siva1、slco1a2、slurp1、spp1、thpo、tnf、tnfrsf11b、tnfsf10、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf14、tnfsf15、tnfsf18、tnfsf8、tnfsf9、tradd、trap1、trip6、tslp、txlna、tymp、vegfa、vegfc、wnt16、xcl1和xcl2。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述与外泌体分泌相关的基因是rab27a。5.如权利要求4所述的方法，其中，rab27a的表达水平是使用引物组测量的，所述引物组包括由seq id no:1示出的序列和由seq id no:2示出的序列。6.如权利要求1所述的方法，其中，pd-l1的表达水平是使用引物组测量的，所述引物组包括由seq id no:3示出的序列和由seq id no:4示出的序列。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述接头具有选自于由seq id no:25至seq id no:35示出的氨基酸序列中的任何一个的重复1-20次的序列。8.如权利要求1所述的方法，其中，所述跨膜结构域是选自于由如下所组成的组中的任何一种受体中包含的跨膜结构域：表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生生长因子(pdgf)受体、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、胆囊收缩素(cck)受体、神经营养因子(ngf)受体、肝细胞生长因子(hgf)受体、肾上腺素(eph)受体、血管生成素受体以及相关受体酪氨酸激酶(ryk)受体。9.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述组合物包含通过权利要求1-8中任一
项所述的筛选方法选择的免疫抗癌活性细胞因子作为活性成分。10.如权利要求9所述的药物组合物，其中，所述癌症是选自于由如下所组成的组中的任一种：黑色素瘤、结肠癌、肺癌、皮肤癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、肛门癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤。11.如权利要求9所述的药物组合物，其中，所述细胞因子是选自于由如下所组成的组中的任一种或多种：areg、atp6ap1、bmp10、bmp2、bmp3、bmp5、bmp7、bmp15、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l1、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cd70、cer1、cklf、clcf1、cmtm1、cmtm2、cmtm3、cmtm5、cmtm6、cmtm7、cmtm8、cntf、csf1、csf2、csf3、csh1、csh2、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl2、cxcl3、cxcl6、cxcl9、cyp26b1、ebi3、epo、erap1、fam3b、fam3d、faslg、fgf10、fgf12、figf、gdf10、gdf15、gdf2、gdf3、gdf9、gh1、glmn、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna10、ifna13、ifna14、ifna17、ifna2、ifna21、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifnb1、ifne1、ifng、ifnw1、igl1、ik、il10、il11、il12a、il12b、il13、il15、il16、il17a、il17c、il17d、il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il1f5、il1f6、il1f7、il1f8、il1f9、il1rn、il2、il20、il22、il23a、il24、il25、il27、il28a、il28b、il29、il3、il32、il33、il4、il5、il6、il7、il8、il9、inha、inhba、inhbb、lass1、lefty1、lefty2、lif、lta、mdk、mif、mstn、nampt、nodal、nrg1、osm、pdgfa、pdgfb、pf4、pf4v1、pik3r1、ppbp、prl、pten、ptn、pxmp2、rhoq、scg2、scgb1a1、scgb3a1、scye1、sdcbp、sectm1、siva1、slco1a2、slurp1、spp1、thpo、tnf、tnfrsf11b、tnfsf10、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf14、tnfsf15、tnfsf18、tnfsf8、tnfsf9、tradd、trap1、trip6、tslp、txlna、tymp、vegfa、vegfc、wnt16、xcl1和xcl2。12.如权利要求9所述的药物组合物，其中，所述细胞因子抑制外泌体分泌或阻抑癌细胞中的pd-l1的表达。13.如权利要求12所述的药物组合物，其中，所述pd-l1在癌细胞中或在癌细胞生成的外泌体表面上表达。14.一种保健功能性食品组合物，所述组合物包含通过权利要求1-8中任一项所述的筛选方法选择的免疫抗癌活性细胞因子作为活性成分。15.一种用于预防或治疗癌症疾病的药物组合物，所述组合物包含il-15或其表达促进剂或激活剂作为活性成分。16.如权利要求15所述的药物组合物，其中，所述il-15表达促进剂或激活剂选自于由特异性地结合至il-15蛋白的化合物、肽、适配体和抗体所组成的组。17.如权利要求15所述的药物组合物，其中，所述il-15或其表达促进剂或激活剂减少癌细胞来源的外泌体的分泌和pd-l1的表达，以抑制免疫逃逸并增强抗癌作用。18.如权利要求15所述的药物组合物，其中，所述il-15或其表达促进剂或激活剂增强细胞毒性t细胞的活性，减少作为免疫检查点的pd-1和ctla-4，通过促进外泌体分泌抑制免
疫逃逸，并增强抗癌作用。19.如权利要求15所述的药物组合物，其中，所述癌症疾病选自于由如下所组成的组：黑色素瘤、皮肤癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、骨癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤。

技术总结
本发明涉及筛选具有抑制外泌体从癌细胞分泌或阻抑程序性凋亡配体的表达的免疫抗癌活性细胞因子的方法，其中，将由编码细胞因子的基因、编码接头的接头结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域组成的载体转化到癌细胞中，并由此可以选择表现出免疫抗癌活性的细胞因子，该细胞因子阻抑与外泌体分泌相关的基因的表达水平或PD-L1的表达水平，并且将所选择的细胞因子提供作为新的抗癌剂。此外，本发明涉及用于预防或治疗癌症疾病的组合物，该组合物包含使用上述筛选技术选择的IL-15或其表达促进剂或激活剂作为活性成分。在本发明中，发现用IL-15处理癌细胞阻抑了癌细胞来源的外泌体分泌和诱导T细胞的免疫逃逸的PD-L1的表达，并且还发现抗癌作用直接表现在癌细胞上。发现IL-15激活细胞毒性T细胞，减少免疫检查点PD-1和CTLA-4，并且促进源自免疫细胞的外泌体，并由此显示出免疫抗癌活性。因此，IL-15或其表达促进剂或激活剂可以被有效地用作用于预防或治疗癌症疾病的组合物。疗癌症疾病的组合物。疗癌症疾病的组合物。


技术研发人员：白文昌 芮敬武 姜成旼
受保护的技术使用者：庆北大学校产学协力团
技术研发日：2021.09.02
技术公布日：2023/7/22