纯化DTX-P7的方法与流程

纯化dtx-p7的方法
技术领域
1.本技术涉及用于肿瘤的分子靶向治疗的化合物的纯化及后处理的技术领域，特别是涉及具有多重抗肿瘤效应的分子靶向治疗的化合物dtx
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p7的纯化及后处理方法。


背景技术：

2.原癌信号通路之间存在着多重平行关系，阻断单一通路往往不足以危及癌细胞的生存。为弥补不足，研究人员开始着眼于这些通路的交汇点，希望以一种药物同时阻断多条通路，提高药物的治疗效果，改善药物的抑瘤谱和患者个体的普适性。hsp90是广泛存在于真核细胞的一种分子伴侣，它是一个重要的原癌信号网络交汇点。对肿瘤细胞的hsp90分子伴侣功能进行抑制，就有可能同时促进多种原癌蛋白质的降解。同时hsp90 通过调控细胞自噬过程来参与细胞对药物的应答，因而抑制hsp90有望显著改善肿瘤治疗效果。
3.化合物dtx-p7是由小分子药物—多西他赛通过连接子—丁二酸与全新结构的靶向七肽(lpltplp)—p7连接而形成的具有多重抗肿瘤效应的分子靶向治疗的化合物。dtx-p7的氨基酸序列为：dtx-suc-leu
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pro-leu-thr-pro-leu-pro-oh。dtx-p7具有如下所示的化学结构：
[0004][0005]
化合物dtx-p7是基于肿瘤细胞膜上特有表达的hsp90进行药物递送，能显著提高在肿瘤部位的药物浓度，降低非瘤组织中的药物浓度，减少对正常组织的影响。靶向七肽p7不仅能结合细胞膜表面的hsp90从而抑制其胞内表达水平，而且可同时抑制肿瘤的多条信号通路。所述七肽 p7不同于现有的hsp抑制剂，其与化疗药物协同增效，有望成为潜在的肿瘤早期的治疗药物。
[0006]
多西他赛本身水溶性极差，所连接的七肽p7中有6个氨基酸为非极性氨基酸，并且连接子丁二酸或丁二酸酐也是脂溶性的，这导致dtx-p7 的水溶性差。此外，多西他赛结构中存在着叔丁氧羰基、结构张力较大的四元氧杂环、苯甲酸酯和乙酸酯等对强酸和碱敏感的基团。同时，p7结构中只有一个羧基，没有任何碱性基团，不适于通过调节酸或碱条件来改善其水溶性。因为dtx-p7的这些结构特点导致其纯化和后处理工艺比较困难。在采用反相色谱法进行纯化的过程中，若采用含有三氟乙酸的洗脱剂体系进行纯化，则所得到产品的纯度和纯化效率都比较低。在将经纯化得到的产品进行后处理的过程中，若采用旋蒸除
溶剂后直接冻干的后处理工艺，则在旋蒸的过程中，会有固体析出。若采用乙腈等作为溶剂，则析出的固体为粘稠状，将该粘稠状固体进一步冻干，得到的冻干产品不均一，并且由于溶剂裹挟在粘稠状固体中而导致溶剂残留，产品质量不达标。
[0007]
因此，本领域中亟需用于纯化和后处理dtx-p7的方法以高收率获得更高纯度的dtx-p7。


技术实现要素：

[0008]
一方面，本技术提供了用于纯化dtx-p7的方法，其包括以下步骤：
[0009]
(1)将dtx-p7粗品溶解于乙腈的水溶液中，并用有机滤膜进行过滤，以得到dtx-p7粗品的溶液(粗品预处理步骤)；
[0010]
(2)将所述dtx-p7粗品的溶液通过反相色谱法进行纯化，以硫酸盐水溶液作为流动相a以及以乙腈作为流动相b进行洗脱，并收集目标级分(一步纯化步骤)；
[0011]
(3)将所述目标级分通过反相色谱柱进行浓缩，其中用第一乙醇水溶液平衡色谱柱，然后用第二乙醇水溶液进行洗脱，并收集经浓缩的目标级分(浓缩步骤)；以及
[0012]
(4)除去所述经浓缩的目标级分中的溶剂，向所得残余物中加入无水乙醇或丙酮，将所得残余物的乙醇或丙酮溶液加入水中以进行沉降，并将所得沉降液进行冻干，得到纯化的dtx-p7(冻干步骤)。
[0013]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(1)中，将dtx-p7粗品溶解于体积分数为25％-55％(v/v)乙腈的水溶液中。
[0014]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，以20-200mmol/l的硫酸盐水溶液作为流动相a。在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，以ph 2.0-4.0的20-200mmol/l的硫酸盐水溶液作为流动相a。
[0015]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，将作为流动相b的乙腈以45％(v/v)-55％(v/v)的梯度进行洗脱。
[0016]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(4)中，以每1克残余物用5-10 ml无水乙醇或丙酮进行溶解的配比向所得残余物中加入无水乙醇或丙酮。
[0017]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(4)中，将所得残余物的乙醇或丙酮溶液加入水中，使得所述沉降液中的乙醇或丙酮的体积分数为5-10％。
[0018]
在本技术的用于纯化dtx-p7的方法中，通过在一步纯化步骤中采用硫酸盐水溶液/乙腈作为流动相体系，经纯化后所得样品的纯度》99.5％，优选地，最大单杂＜0.2％。在后处理过程中，先采用乙醇/水进行柱浓缩，再除去经浓缩的目标级分中的溶剂以进一步浓缩，然后采用乙醇或丙酮溶解残余物，再加入水以进行沉降，冻干沉降液，可以以90％以上的高收率得到高纯度(如纯度为99％以上)的且溶剂残留合格的dtx-p7。
附图说明
[0019][0020]
图1显示了实施例一中的dtx-p7粗品溶液的目标峰的hplc谱图 (全量程)。
[0021]
图2显示了实施例一中的dtx-p7粗品溶液的目标峰的hplc谱图 (有关物质)。
[0022]
图3显示了实施例一中的一步纯化步骤后的目标峰的hplc谱图(全量程)。
[0023]
图4显示了实施例一中的一步纯化步骤后的目标峰hplc谱图(有关物质)。
[0024]
图5显示了实施例一中的浓缩步骤后的目标峰的hplc谱图(全量程)。
[0025]
图6显示了实施例一中的浓缩步骤后的目标峰的hplc谱图(有关物质)。
[0026]
图7显示了实施例一中的冻干曲线图。
[0027]
发明的详细说明
[0028]
一方面，本技术提供了用于纯化dtx-p7的方法，其包括以下步骤：
[0029]
(1)将dtx-p7粗品溶解于乙腈的水溶液中，并用有机滤膜进行过滤，以得到dtx-p7粗品的溶液(粗品预处理步骤)；
[0030]
(2)将所述dtx-p7粗品的溶液通过反相色谱法进行纯化，以硫酸盐水溶液作为流动相a以及以乙腈作为流动相b进行洗脱，并收集目标级分(一步纯化步骤)；
[0031]
(3)将所述目标级分通过反相色谱柱进行浓缩，其中用第一乙醇水溶液平衡色谱柱，然后用第二乙醇水溶液进行洗脱，并收集经浓缩的目标级分(浓缩步骤)；
[0032]
(4)除去所述经浓缩的目标级分中的溶剂，向所得残余物中加入无水乙醇或丙酮，将所得残余物的乙醇或丙酮溶液加入水中以进行沉降，并将所得沉降液进行冻干，得到纯化的dtx-p7(冻干步骤)。
[0033]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(1)中，将dtx-p7粗品溶解于体积分数为25％-55％(v/v)，优选30％-50％(v/v)的乙腈的水溶液中。如果乙腈的水溶液中乙腈的比例太低，则乙腈水溶液溶解dtx-p7粗品时不易获得澄清溶液。如果乙腈的水溶液中乙腈的比例太高，则样品不容易被吸附在柱填料上，容易洗脱出。
[0034]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(1)中，采用孔径为0.4μm-0.5μm，优选孔径为0.45μm的有机滤膜进行过滤。可以使用本领域中常用的有机滤膜进行过滤，其实例包括但不限于聚四氟乙烯膜(ptfe)、聚偏二氟乙烯膜(pvdf)、尼龙膜(n6n66)等等。
[0035]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(1)中，所得到的dtx-p7粗品的溶液的浓度为40-60mg/ml。控制dtx-p7粗品溶液的浓度有利于对该粗品溶液实施的前处理。如果dtx-p7粗品溶液的浓度太低，则溶液体积太大，不利于前处理，过滤耗时延长，且增加了在后续步骤中上样的时间。如果dtx-p7粗品溶液的浓度太高，则dtx-p7粗品不易溶清，难于通过膜过滤，dtx-p7粗品损失较大。
[0036]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，可以使用本领域中常用的反相色谱填料，优选c18填料。
[0037]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，硫酸盐的实例包括但不限于硫酸钠、硫酸钾和硫酸铵，优选硫酸钠。采用硫酸盐(特别是硫酸钠) 水溶液体系进行纯化，能有效改善峰形，使制备峰的峰形对称。而且，硫酸盐(特别是硫酸钠)水溶液体系对dtx-p7粗品中所有杂质均有明显的分离效果，能改善dtx-p7的纯化效果。
[0038]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，以20-200mmol/l、优选 20-100mmol/l、更优选50-80mmol/l的硫酸盐水溶液作为流动相a。
[0039]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，以ph 2.0-4.0、优选ph 2.0-3.0、更优选ph 2.50的硫酸盐水溶液作为流动相a。在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，以ph 2.0-4.0、优选ph 2.0-3.0、更优选ph 2.50的20-200mmol/l的硫酸盐水溶液作为流动相a；或者，以ph 2.0
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4.0、优选ph 2.0-3.0、更优选ph 2.50的20-50mmol/l的硫酸盐水溶液作
为流动相a；或者，以ph 2.0-4.0、优选ph 2.0-3.0、更优选ph 2.50的50 mmol/l的硫酸盐水溶液作为流动相a。通过控制硫酸盐水溶液的ph能进一步增大dtx-p7粗品中的杂质的分离度，获得更好的纯化效果。
[0040]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，可以用本领域中常用的 ph调节剂，例如磷酸或硫酸，优选磷酸，来调节硫酸盐水溶液的ph值。用磷酸调节硫酸盐水溶液的ph值能实现以下效果中的至少一种：控制流动相的ph值，增加样品在制备柱上的保留性，改善分离效果，避免使用硫酸，以提高工艺的安全性。
[0041]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，将作为流动相b的乙腈以45％(v/v)
→
55％(v/v)，优选49％(v/v)
→
55％(v/v)的梯度进行洗脱。洗脱时间可以例如为0min
→
60min。
[0042]
在本技术的一些实施方案中，通过实施一步纯化步骤(2)，所得dtx
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p7的纯度＞99.5％，优选地，最大单杂＜0.2％，并且纯化收率＞90％。
[0043]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(3)中，可以使用本领域中常用的反相色谱填料，优选c18填料。
[0044]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(3)中，用40％-60％(v/v)，优选50％(v/v)的乙醇水溶液平衡色谱柱，例如平衡10min。通过平衡色谱柱能将上述的一步纯化步骤中引入的硫酸盐置换完全，避免了最终的dtx-p7 成品中引入不必要的离子。
[0045]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(3)中，用90％-95％(v/v)，优选 95％(v/v)的乙醇水溶液进行等度洗脱，例如洗脱60min，以实现快速洗脱出目标峰的目的，提高目标级分中的dtx-p7浓度，方便进行后续操作。
[0046]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(3)中，所获得的经浓缩的目标级分的纯度＞99.5％，优选地，单杂＜0.2％，并且收率接近100％。
[0047]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(4)中，将步骤(3)中获得的经浓缩的目标级分在减压下进行旋转蒸发以除去溶剂，进一步浓缩，获得固体形式的残余物。可以常规选择减压下进行旋转蒸发的水浴温度，例如 25℃-40℃，优选25℃-35℃，更优选32℃。
[0048]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(4)中，以每1克残余物用5-10 ml无水乙醇或丙酮，优选5ml的无水乙醇或丙酮进行溶解的配比向所得残余物中加入无水乙醇或丙酮。如果无水乙醇或丙酮的用量少，则残余物溶解不完全，不能获得清澈溶液；如果无水乙醇或丙酮用量多，则后续过程中的沉降液的体积太大，不利于冻干。
[0049]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(4)中，将所得残余物的乙醇或丙酮溶液加入水中以进行沉降，使得所述沉降液中的乙醇或丙酮的体积分数为5-10％(v/v)，优选地，得到的沉降液中乙醇或丙酮的体积分数为 10％(v/v)。所得到的沉降液呈白色乳浊液。
[0050]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(4)中，向所得残余物中加入无水乙醇或丙酮进行溶解，然后将所得溶液加入到水中进行沉降，可以使得析出的dtx-p7颗粒均匀，冻干后的dtx-p7成品均一，并使得沉降液在预冻时能冻结，且冻干后的成品中溶剂残留合格。若采用其它溶剂进行沉降，则会导致析晶过程中固体出现粘结或者冻干后溶剂残留超标等现象。而且，本技术的发明人发现需要将所得的残余物的乙醇或丙酮溶液加入到水中进行沉降，若操作顺序相反，则导致析出的固体不均一。
[0051]
在本技术的一些实施方案中，在步骤(4)中，将呈白色乳浊液的沉降液分装于冻干
盘后，进行冻干。
[0052]
本技术的用于纯化dtx-p7的方法可以实现以下有益效果中的至少一种效果。
[0053]
(1)本技术采用硫酸盐(特别是硫酸钠)水溶液和乙腈体系作为流动相进行一步纯化，对dtx-p7粗品中的所有杂质均有明显的分离纯化效果，能够有效提高dtx-p7的纯度和收率，例如，dtx-p7的纯度》99.5％，优选地，最大单杂《0.2％，而且，减少尾料回收针数，降低人力物力成本。
[0054]
(2)本技术采用乙醇和水体系进行柱浓缩，能够有效提高单针上样量，缩短纯化工期，提高目标级分中的dtx-p7浓度，减少级分的体积量，缩短后续的浓缩工期。
[0055]
(3)本技术的除去经浓缩的目标级分中的溶剂，进行进一步浓缩，先将所得残余物用乙醇或丙酮溶解，再加入水中进行沉降，析出固体后再冻干的后处理方法解决了在传统的对dtx-p7进行后处理的过程中，除去溶剂以进一步浓缩时dtx-p7固体析出，冻干后成品不均一，溶剂残留超标等问题。
[0056]
(4)本技术的工艺操作简单，纯化效果理想，后处理方法新颖，适用于大批量的产业化生产。通过实施本技术的方法，可获得最大单杂《 0.2％，总杂《0.5％，且溶剂残留合格的纯度可高达99.0％以上的dtx
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p7纯品，纯化的总收率高达90％以上。
实施例
[0057]
下面结合具体实施例，进一步示例性地阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0058]
实施例1
[0059]
1、粗品预处理
[0060]
合成裂解后，得到固体形式的dtx-p7粗品，粗品的纯度约为83.37％， dtx-p7的含量约为50wt％。将dtx-p7粗品用50％(v/v)的乙腈水溶液进行溶解：取540g粗品加入6l乙腈，搅拌溶解澄清后，加入6l纯化水稀释至含50％(v/v)乙腈的水溶液，溶液澄清，用0.45μm尼龙膜(n6n66) 过滤，得到粗品溶液(图1，图2)。
[0061]
2、一步纯化
[0062]
一步纯化步骤采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将步骤1 中获得的粗品溶液等分成三份进行纯化。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为90g的粗品溶液，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用50mmol/l 的经磷酸调节至ph＝2.00的硫酸钠水溶液和乙腈作为流动相，按照乙腈％为49％(v/v)-55％(v/v)的梯度进行洗脱，收集目标级分。重复上述的一步纯化步骤两次，共计实施三次上样和纯化步骤。所得dtx-p7样品的纯度为99.81％，最大单杂为0.10％，将所有的合格级分合并，并待进行下一步的浓缩(图3，图4)。
[0063]
3、浓缩
[0064]
采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将上述合并的合格级分进行浓缩。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为260g的合格级分，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用纯化水与无水乙醇进行柱浓缩，再用纯化水与无水乙醇按50％(v/v)：50％(v/v)平衡柱10min，最后用纯化水和无水乙醇的体系按照无水乙醇％(v/v)：90％乙醇进行等度洗脱60min，收集洗脱液。所得的样品纯度为99.79％，最大单杂为0.10％。将合格的经浓缩的目标级分进行合并以待后处理(图5，图6)。
[0065]
4、冻干
[0066]
将合格的经浓缩的目标级分合并，在30℃的水浴温度下减压旋蒸以除去溶剂和进一步浓缩。旋蒸至获得固体残余物后，以5ml无水乙醇/1gdtx-p7的配比用无水乙醇溶解固体残余物，在完全溶解澄清后，将残余物的乙醇溶液加入到9倍体积的纯化水中以沉降析晶，此时乙醇被稀释至其浓度为10％(v/v)，边加边搅拌均匀，沉降液呈白色乳浊液。按照冻干曲线进行冻干，冻干结束，出箱，得到约251g合格的dtx-p7，纯化的总收率为92.9％。乙醇残留量为0.03％，乙腈残留量为0.0006％，残留溶剂检测结果合格。获得的dtx-p7成品的最终纯度为99.79％(图7)。
[0067]
实施例2
[0068]
1、粗品预处理
[0069]
合成裂解后，得到固体形式的dtx-p7粗品，粗品的纯度约为80.05％， dtx-p7的含量约为45wt％。将dtx-p7粗品用40％(v/v)的乙腈水溶液进行溶解：取666g粗品加入6l乙腈，搅拌溶解澄清后，加入9l纯化水稀释至含40％(v/v)乙腈的水溶液，溶液澄清，用0.45μm聚四氟乙烯膜(ptfe) 过滤，得到粗品溶液。
[0070]
2、一步纯化
[0071]
一步纯化步骤采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将步骤1 中获得的粗品溶液等分成三份进行纯化。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为100g的粗品溶液，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用20 mmol/l的经磷酸调节至ph＝4.00的硫酸钠水溶液和乙腈作为流动相，按照乙腈％(v/v)为49％(v/v)-55％(v/v)的梯度进行洗脱，收集目标级分。重复上述的一步纯化步骤两次，共计实施三次上样和纯化步骤。所得dtx-p7 样品的纯度为99.75％，最大单杂为0.10％，将所有的合格级分合并，并待进行下一步的浓缩。
[0072]
3、浓缩
[0073]
采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将上述合并的合格级分进行浓缩。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为280g的合格级分，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用纯化水与无水乙醇进行柱浓缩，再用纯化水与无水乙醇按40％(v/v)：60％(v/v)平衡柱10min，最后用纯化水和无水乙醇的体系按照无水乙醇％(v/v)：95％(v/v)乙醇进行等度洗脱60min，收集洗脱液。所得的样品纯度为99.80％，最大单杂为0.10％。将合格的经浓缩的目标级分进行合并以待后处理。
[0074]
4、冻干
[0075]
将合格的经浓缩的目标级分合并，在35℃的水浴温度下减压旋蒸以除去溶剂和进一步浓缩。旋蒸至获得固体残余物后，以10ml丙酮/1g dtx
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p7的配比用丙酮溶解固体残余物，在完全溶解澄清后，将残余物的丙酮溶液加入到9倍体积的纯化水中以沉降析晶，此时丙酮被稀释至其浓度为10％(v/v)，边加边搅拌均匀，沉降液呈白色乳浊液。按照冻干曲线进行冻干，冻干结束，出箱，得到约272g合格的dtx-p7，纯化的总收率为 90.7％。乙醇残留量为未检测出，乙腈残留量为未检测出，丙酮残留量为 0.04％。残留溶剂检测结果合格。获得的dtx-p7成品的最终纯度为 99.68％。
[0076]
实施例3
[0077]
1、粗品预处理
[0078]
合成裂解后，得到固体形式的dtx-p7粗品，粗品的纯度约为79.92％， dtx-p7的含
量约为56wt％。将dtx-p7粗品用约33％(v/v)的乙腈水溶液进行溶解：取465g粗品加入3l乙腈，搅拌溶解澄清后，加入6l纯化水稀释至含33％(v/v)乙腈的水溶液，溶液澄清，用0.45μm聚偏二氟乙烯膜 (pvdf)过滤，得到粗品溶液。
[0079]
2、一步纯化
[0080]
一步纯化步骤采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将步骤1 中获得的粗品溶液等分成三份进行纯化。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为87g的粗品溶液，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用200mmol/l 的经磷酸调节至ph＝2.50的硫酸钠水溶液和乙腈作为流动相，按照乙腈％(v/v)为49％(v/v)-55％(v/v)的梯度进行洗脱，收集目标级分。重复上述的一步纯化步骤两次，共计实施三次上样和纯化步骤。所得dtx-p7样品的纯度为99.76％，最大单杂为0.10％，将所有的合格级分合并，并待进行下一步的浓缩。
[0081]
3、浓缩
[0082]
采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将上述合并的合格级分进行浓缩。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为248g的合格级分，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用纯化水与无水乙醇进行柱浓缩，再用纯化水与无水乙醇按60％(v/v)：40％(v/v)平衡柱10min，最后用纯化水和无水乙醇的体系按照无水乙醇％(v/v)：95％(v/v)乙醇进行等度洗脱 60min，收集洗脱液。所得的样品纯度为99.82％，最大单杂为0.10％。将合格的经浓缩的目标级分进行合并以待后处理。
[0083]
4、冻干
[0084]
将合格的经浓缩的目标级分合并，在25℃的水浴温度下减压旋蒸以除去溶剂和进一步浓缩。旋蒸至获得固体残余物后，以6ml无水乙醇/1gdtx-p7的配比用无水乙醇溶解固体残余物，在完全溶解澄清后，将残余物的乙醇溶液加入到12倍体积的纯化水中以沉降析晶，此时乙醇被稀释至其浓度为8％(v/v)，边加边搅拌均匀，沉降液呈白色乳浊液。按照冻干曲线进行冻干，冻干结束，出箱，得到约238g合格的dtx-p7，纯化的总收率为91.5％。乙醇残留量为0.02％，乙腈残留量为未检测出，残留溶剂检测结果合格。获得的dtx-p7成品的最终纯度为99.65％。
[0085]
对比例1
[0086]
1、粗品预处理
[0087]
合成裂解后，得到固体形式的dtx-p7粗品，粗品的纯度约为82.16％， dtx-p7的含量约为54wt％。将dtx-p7粗品用约50％(v/v)的乙腈水溶液进行溶解：取500g粗品加入5.5l乙腈，搅拌溶解澄清后，加入5.5l纯化水稀释至含50％(v/v)乙腈的水溶液，溶液澄清，用0.45μm聚四氟乙烯膜(ptfe)过滤，得到粗品溶液。
[0088]
2、一步纯化
[0089]
一步纯化步骤采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将步骤1 中获得的粗品溶液等分成三份进行纯化。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为90g的粗品溶液，流速为1.6l/min，检测波长为230nm。
[0090]
第一针：用纯化水和乙腈作为流动相，按照乙腈％(v/v)为49％(v/v)
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55％(v/v)的梯度进行洗脱，收集目标级分。所得dtx-p7样品的纯度为 90.45％，最大单杂为1.25％，未能得到合格级分，待尾料回收。
[0091]
第二针：用含0.01％tfa的水溶液和乙腈作为流动相，按照乙腈％(v/v) 为49％
(v/v)-55％(v/v)的梯度进行洗脱，收集目标级分。所得dtx-p7样品的纯度为95.36％，最大单杂为0.55％，未能得到合格级分，待尾料回收。
[0092]
第三针：用50mmol/l的经磷酸调节至ph＝2.50的硫酸钠水溶液和乙腈作为流动相，按照乙腈％(v/v)为49％(v/v)-55％(v/v)的梯度进行洗脱，收集目标级分。所得dtx-p7样品的纯度为99.58％，最大单杂为0.08％，能够得到合格级分，待进行下一步的浓缩。
[0093]
尾料回收：将第一针和第二针不合格级分合并，并等分成两份后重复上述第三针的一步纯化步骤，进行两次，共计实施五次上样和纯化步骤，其中前两次未得到合格级分，后三次所得dtx-p7样品的纯度平均为 99.56％，最大单杂平均为0.09％，将所有的合格级分合并，并待进行下一步的浓缩。
[0094]
3、浓缩
[0095]
采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将上述合并的合格级分进行浓缩。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为240g的合格级分，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用纯化水与无水乙醇进行柱浓缩，再用纯化水与无水乙醇按50％(v/v)：50％(v/v)平衡柱10min，最后用纯化水和无水乙醇的体系按照无水乙醇％(v/v)：95％(v/v)乙醇进行等度洗脱 60min，收集洗脱液。所得的样品纯度为99.79％，最大单杂为0.09％。将合格的经浓缩的目标级分进行合并以待后处理。
[0096]
4、冻干
[0097]
将合格的经浓缩的目标级分合并，在25℃的水浴温度下减压旋蒸以除去溶剂和进一步浓缩。旋蒸至获得固体残余物，以5ml无水乙醇/1gdtx-p7的配比用无水乙醇溶解固体残余物，在完全溶解澄清后，将残余物的乙醇溶液加入到9倍体积的纯化水中以沉降析晶，此时乙醇被稀释至其浓度为10％(v/v)，边加边搅拌均匀，沉降液呈白色乳浊液。按照冻干曲线进行冻干，冻干结束，出箱，得到约233g合格的dtx-p7，纯化的总收率为86.3％。乙醇残留量为0.04％，乙腈残留量为0.0005％，残留溶剂检测结果合格。获得的dtx-p7成品的最终纯度为99.49％。
[0098]
对比例2
[0099]
1、粗品预处理
[0100]
合成裂解后，得到固体形式的dtx-p7粗品，粗品的纯度约为81.08％， dtx-p7的含量约为46wt％。将dtx-p7粗品用40％(v/v)的乙腈水溶液进行溶解：取587g粗品加入5.2l乙腈，搅拌溶解澄清后，加入7.8l纯化水稀释至含40％(v/v)乙腈的水溶液，溶液澄清，用0.45μm尼龙膜(n6n66) 过滤，得到粗品溶液。
[0101]
2、一步纯化
[0102]
一步纯化步骤采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将步骤1 中获得的粗品溶液等分成三份进行纯化。单针上样量为含标定dtx-p7纯品为90g的粗品溶液，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用80mmol/l 的经磷酸调节至ph＝3.00的硫酸钠水溶液和乙腈作为流动相，按照乙腈％(v/v)为49％(v/v)-55％(v/v)的梯度进行洗脱，收集目标级分。重复上述的一步纯化步骤两次，共计实施三次上样和纯化步骤。所得dtx-p7样品的纯度为99.60％，最大单杂为0.10％，将所有的合格级分合并，并待进行下一步的浓缩。
[0103]
3、浓缩
[0104]
采用反相的c18填料，在300dac制备柱上将上述合并的合格级分进行浓缩。单针上
样量为含标定dtx-p7纯品为260g的合格级分，流速为1.6l/min，检测波长为230nm，用纯化水与无水乙醇进行柱浓缩，再用纯化水与无水乙醇按40％(v/v)：60％(v/v)平衡柱10min，最后用纯化水和无水乙醇的体系按照无水乙醇％(v/v)：95％(v/v)乙醇进行等度洗脱 60min，收集洗脱液。所得的样品纯度为99.68％，最大单杂为0.10％。将合格的经浓缩的目标级分进行合并以待后处理。
[0105]
4、干燥
[0106]
将合格的经浓缩的目标级分合并，在35℃的水浴温度下减压旋蒸以除去溶剂和进一步浓缩。旋蒸至获得固体残余物250g，分成五份处理，每份50g。
[0107]
第一份：固体残余物，直接冻干，冻干后成品呈粘结小块状，性状不合格。
[0108]
第二份：固体残余物用以5ml无水乙醇/1g dtx-p7的配比用无水乙醇溶解固体残余物，在完全溶解澄清后，将残余物的乙醇溶液加入到异丙醚中沉降析晶，过滤，将过滤后得到的晶体在30℃下真空(《-0.08mpa) 干燥8h，异丙醚残留量为1.4355％(限度0.5％)，残留溶剂不合格。将晶体在30℃下继续真空(《-0.08mpa)干燥8h，异丙醚残留量为1.5574％，残留溶剂仍不合格。将晶体在40℃下继续真空(《-0.08mpa)干燥16h，异丙醚1.5770％，残留溶剂仍不合格。
[0109]
第三份：固体残余物用以5ml无水乙醇/1g dtx-p7的配比用无水乙醇溶解固体残余物，在完全溶解澄清后，将残余物的乙醇溶液加入到正己烷中沉降析晶，过滤，将过滤后得到的晶体在30℃下真空(《-0.08mpa) 干燥8h，正己烷残留量为0.5937％(限度0.0290％)，残留溶剂不合格。将晶体在40℃下继续真空(《-0.08mpa)干燥16h，正己烷残留量为0.3441％，残留溶剂仍不合格。
[0110]
第四份：固体残余物用以5ml无水乙醇/1g dtx-p7的配比用无水乙醇溶解固体残余物，在完全溶解澄清后，将残余物的乙醇溶液加入到正戊烷中沉降析晶，经过滤后的固体粘结，将固体在40℃下真空(《-0.08mpa) 干燥16h，正戊烷残留量为0.0152％(限度0.5％)，残留溶剂合格，但是，成品粘结成块，性状不合格。
[0111]
第五份：固体残余物用以5ml无水乙醇/1g dtx-p7的配比用无水乙醇溶解固体残余物，在完全溶解澄清后，将9倍体积的纯化水加入到残余物的乙醇溶液中以沉降析晶，此时乙醇被稀释至其浓度为10％(v/v)，边加边搅拌均匀，析出固体颗粒较大，出现块状固体。按照冻干曲线进行冻干，冻干结束，出箱，得到约48g dtx-p7，乙醇残留量为0.96％(限度0.5％)，乙腈残留量为未检出，丙酮残留量为未检出。残留溶剂检测结果不合格。

技术特征：
1.用于纯化具有如下结构的dtx-p7的方法，其包括以下步骤：(1)将dtx-p7粗品溶解于乙腈的水溶液中，并用有机滤膜进行过滤，以得到dtx-p7粗品的溶液；(2)将所述dtx-p7粗品的溶液通过反相色谱法进行纯化，以硫酸盐水溶液作为流动相a以及以乙腈作为流动相b进行洗脱，并收集目标级分；(3)将所述目标级分通过反相色谱柱进行浓缩，其中用第一乙醇水溶液平衡色谱柱，然后用第二乙醇水溶液进行洗脱，并收集经浓缩的目标级分；以及(4)除去所述经浓缩的目标级分中的溶剂，向所得残余物中加入无水乙醇或丙酮，将所得残余物的乙醇或丙酮溶液加入水中以进行沉降，并将所得沉降液进行冻干，得到纯化的dtx-p7。2.如权利要求1所述的方法，其中在所述步骤(1)中，将所述dtx-p7粗品溶解于体积分数为25％-55％(v/v)，优选30％-50％(v/v)乙腈的水溶液中。3.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述步骤(1)中，采用孔径为0.4μm-0.5μm，优选孔径为0.45μm的有机滤膜进行过滤。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述步骤(2)中，硫酸盐选自硫酸钠、硫酸钾和硫酸铵，优选为硫酸钠。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在所述步骤(2)中，以20-200mmol/l、优选20-100mmol/l、更优选50-80mmol/l的硫酸盐水溶液作为流动相a。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述步骤(2)中，以ph 2.0-4.0、优选ph 2.0-3.0、更优选ph 2.50的硫酸盐水溶液作为流动相a。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在所述步骤(3)中，所述第一乙醇水溶液为40％-60％(v/v)，优选50％(v/v)的乙醇水溶液。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在所述步骤(3)中，所述第二乙醇水溶液为90％-95％(v/v)，优选95％(v/v)的乙醇水溶液。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在所述步骤(4)中，以每1克所述残余物用5-10ml、优选5ml的无水乙醇或丙酮进行溶解的配比向所述残余物中加入无水乙醇或丙酮。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述步骤(4)中，将所得残余物的乙醇或丙酮溶液加入水中，使得所述沉降液中的乙醇或丙酮的体积分数为5-10％(v/v)，优选10％(v/v)。

技术总结
本申请公开了用于纯化具有如下结构的DTX-P7粗品的方法，其包括粗品预处理步骤、一步纯化步骤、浓缩步骤和冻干步骤。通过本申请的纯化方法，可以以90％以上的收率获得纯度高达99％以上的DTX-P7。P7。P7。


技术研发人员：黄荣宗 王心刚 刘自成 赵玲 金舫
受保护的技术使用者：泰泽惠康生物医药有限责任公司
技术研发日：2022.01.05
技术公布日：2023/7/22