用于检测溶液中的分析物的可重复使用试剂匣的制作方法

用于检测溶液中的分析物的可重复使用试剂匣
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年11月20日递交的美国临时申请第63/116,575号的优先权，通过援引以其全文并入本文以用于任何目的。
技术领域
3.本公开涉及准备包含基质的可重复使用且可干燥的试剂匣的方法，该基质包含检测分子，例如抗体，以用于检测或富集样品中的分析物，例如被抗体识别的抗原。在一些实施例中，该试剂匣包含保持该基质的管或孔。在一些实施例中，该基质或相关试剂匣可以湿性或干燥存储。本公开还涉及该试剂匣及其使用方法。


背景技术：

4.各种可商购的基质可用于检测溶液样品中的特定分析物。例如，包含涂覆有蛋白质a、蛋白质g和/或蛋白质l的材料的基质可用于在基质上捕获抗体恒定区，从而与溶液中的其他成分相比检测和富集它们。基质可以直接或通过基质上的蛋白质a、蛋白质g和/或蛋白质l用抗体涂覆，例如，以检测或富集样品中的抗原分析物。基质可以用抗原涂覆，例如，以检测或富集针对那些抗原的抗体。涂覆有不全抗原的基质也可用于检测溶液中的分析物。形成基质的材料是多种多样的，例如树脂、珠粒等。
5.然而，许多基质及容纳这样的基质的试剂匣一旦被用于检测溶液中的分析物，例如，特定而言细胞裂解物中的分析物，便不能有效地重复使用，并且在单次使用之后即被丢弃。因此，例如在常规筛选实验中，使用这样的试剂匣可能非常昂贵，因为用于涂覆试剂匣的蛋白质试剂可能需要大量连续供应，并且相当耗时，因为可能需要定期准备新鲜试剂匣。例如，可能需要准备特定的检测分子，然后将其附着于基质上，之后才能使用，这可能需要许多处理步骤。并且对于一些必要试剂，例如商业抗体或抗原，购买准备足够的经涂覆的基质所需的数量可能非常昂贵。因此，如果基质可以重复使用，则可以节省大量时间及资源。
6.尤其是，本文中，本公开描述了准备包含基质的试剂匣的方法，该试剂匣可以重复使用例如多次，并且还可在使用之间于干燥状态存储以便更容易处理，用于检测溶液(包括复杂溶液，例如细胞裂解物)中的分析物；以及相关的可重复使用的试剂匣。本文中，本公开还描述了使用本文所述的试剂匣检测溶液样品中的特定分析物的示例性方法，该特定分析物为例如生物流体及细胞裂解物中的主要组织相容性复合物i类(mhc-i)分子以及其他蛋白质。


技术实现要素：

7.本公开尤其包括一种用于检测溶液中的分析物的可重复使用试剂匣，其中该试剂匣包含：a)基质，b)附着于该基质的检测分子，其中该检测分子特异性结合于该分析物，并且其中该检测分子任选地与该基质交联；以及c)至少一种冷冻保护剂，其中该试剂匣可用于检测溶液中的该分析物至少10、20、50或100次，且其中，每次使用之后，任选地用该冷冻
保护剂将该基质于干燥状态存储。在一些方面中，该试剂匣为两端开口管、一端开口管、孔、带孔或不带孔平盘、或能够容纳该基质的晶片。在一些方面中，该基质包含含有二氧化矽或琼脂糖的颗粒(例如珠粒、细粒、碎粒或丸粒)，其中该颗粒任选地为磁性的。在一些情况下，该基质包含蛋白质a、蛋白质g和/或蛋白质l。在一些情况下，该检测分子为抗体。在一些情况下，该检测分子与该基质交联。在一些情况下，多于一种类型的检测分子附着于该基质，例如用于检测溶液中两种不同抗原分析物的两种不同抗体。在一些方面中，该检测分子用选自庚二亚氨酸二甲酯(dmp)、氰酸酯、nhs酯、吖内酯、羰基二咪唑(cdi)、顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰基、吡啶二硫化物、酰肼或碳二亚胺的交联剂与该基质交联。在一些方面中，能够通过基质上的检测分子检测的分析物为蛋白质或肽。例如，在一些情况下，该分析物为主要组织相容性复合物i(mhc-i)分子。在一些情况下，该试剂匣可用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少10次。在一些情况下，该可重复使用试剂匣于干燥状态存储。在一些方面中，该试剂匣可在准备后于干燥状态存储，然后在每次使用后于湿性状态存储后用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少10次。在一些方面中，该试剂匣可在每次使用后于干燥状态存储后用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少10次。在一些方面中，该试剂匣可在准备后于干燥状态存储，然后在每次使用后于湿性状态存储后用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少20次。在一些情况下，该试剂匣可在每次使用后于干燥状态存储后，用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少20次。在一些方面中，该试剂匣可在准备后于干燥状态存储，然后在每次使用后于湿性状态存储后用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少50次。在一些情况下，该试剂匣可在每次使用后于干燥状态存储后，用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少50次。在一些方面中，该试剂匣可在准备后于干燥状态存储，然后在每次使用后于湿性状态存储后用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少100次。在一些情况下，该试剂匣可在每次使用后于干燥状态存储后，用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少100次。在一些方面中，该基质以酸性ph存储。在一些方面中，该基质于2至8℃存储。在一些方面中，该基质于湿性状态存储。在一些方面中，该基质储以酸性ph且任选地于2至8℃存储。在一些情况下，该冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)或二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。
8.本公开还涉及一种准备先前使用过的(例如，如上文或本文中其他地方所描述的)试剂匣以供再次使用的方法，其包含：在从该试剂匣洗脱分析物后，在1至10％乙酸、1％甲酸或1％三氟乙酸(tfa)中洗涤基质，在包含冷冻保护剂的缓冲液中洗涤基质，以及使该基质干燥。在一些方面中，该冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)或二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。在一些情况下，通过加热试剂匣至至少30℃，随后在室温储存至少1小时使基质干燥。在一些情况下，通过加热试剂匣至37℃，之后于室温存储至少1小时。在一些情况下，使基质干燥，将试剂匣在2至8℃于干燥状态存储直至再次使用。
9.本公开进一步涉及准备如上文或本文中其他地方所描述的可重复使用试剂匣的方法，其包括：获得包含基质的试剂匣，将该基质与检测分子接触，及将该检测分子与该基质交联。
10.本公开进一步涉及检测溶液中的分析物的方法，其包括：将上述或本文中其他地
方所描述的可重复使用试剂匣的基质与包含该分析物的溶液接触，以及任选地从该试剂匣洗脱该分析物。在一些方面中，该分析物为肽或蛋白质。在一些方面中，该分析物为mhc-i分子。在一些情况下，该溶液为生物流体或细胞裂解物。在一些情况下，在与基质接触之前，将溶液过滤或处理以去除细胞碎片及膜物质。在一些情况下，在将该试剂匣用于该方法之前，该试剂匣先前已用于检测分析物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100次。在一些情况下，在分析物洗脱之后，通过本文中先前使用过的试剂匣(例如上面所描述的准备那些)的方法处理该试剂匣。
11.本公开还涵盖试剂盒，其包括至少一个如本文所述的可重复使用试剂匣，例如上面所描述的那些。在一些方面中，试剂盒包括至少一个如本文所述的试剂匣以及：(a)至少一种缓冲液；(b)不含检测分子或具有对照检测分子的至少一个对照试剂匣；(c)用于准备该试剂匣以供存储及再次使用的试剂；和/或(d)使用说明书。
12.应理解，前述一般描述及以下详细描述均仅为例示性及说明性的，且不限制权利要求书。并入本说明书中且构成其一部分的附图说明了某些实施例或方面，且与说明书一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
13.本美国临时申请包含至少一张彩色图。如果本美国临时申请未来由于要求其优先权的非临时申请或国际申请的公开发布而向公众提供，则该局将根据要求以及在收取必要费用的前提下，提供带有彩色图的该临时申请的副本。
14.图1a-e示出了在用于检测mhc-i复合物的方法中使用如本文所述的可重复使用试剂匣的概述。图1a提供了mhc-i相关肽(map)内源性加工及呈递富集工作流程的各个阶段的概述，以及基于质谱的分析及定量。在典型呈递中，细胞内蛋白质在细胞内被多泛素化且易位到蛋白酶体进行降解。因此产生的肽片段经由tap蛋白转运到内质网。然后将它们加载到mhc-i复合物(由mhc-i重链及b2m组成)中，由erap进一步修剪，且该稳定的mhc-i肽复合物被易位到细胞表面。每个独特肽的展示水平取决于其丰度、降解速率及对于给定细胞中mhc-i等位基因的亲和力。富集包括将含有mhc-i复合物的裂解物施加到含有抗mhc-i抗体的固体支持物上，洗掉未结合的污染物，然后经由酸处理洗脱mhc-i蛋白及相关肽。分析包括肽分离及脱盐、层析分离及质谱分析，然后为涉及鉴定及定量步骤的数据处理。图1b描绘了小容量及大容量试剂匣，且提供了小试剂匣及大试剂匣特性的表格，包括重组蛋白容量、细胞丰度及将要加载到定制抗体试剂匣上的量。图1c描绘了使用标准的单次使用assaymap
tm
富集工作流程鉴定的独特mhc-i肽，按物种及有效细胞计数进行分离。图1d提供了抗体试剂匣再次使用方案及循环富集工作流程。蛋白质a试剂匣装载有抗体并且经交联，用于富集mhc-i复合物，且在酸洗脱前进行洗涤。然后试剂匣经由用酸及tbs进行灌注清洗，在4℃存储，且以类似方式再次使用。图1e示出了在连续使用定制抗体试剂匣后，使用granta裂解物，在始终湿性的试剂匣与干燥然后再次润湿的试剂匣上观察到的独特肽计数。
15.图2示出了凝胶电泳，其比较使用重复使用的始终湿性试剂匣与干燥并再次润湿的试剂匣富集的分析物。左侧泳道1至3示出了经纯化的hla蛋白质标准品的滴定结果。y轴上的数字提供了分子量阶梯带的位置，单位为千道耳顿。泳道4至6示出了从湿性存储的试
剂匣洗脱出的hla标准品的水平，而右侧三个泳道7至9示出了从干燥存储/再次润湿的试剂匣洗脱出的hla的水平。泳道4至9中的每一个的相似水平表明，干燥存储及再次润湿的试剂匣能够检测或富集标准蛋白质，类似于始终湿性存储的试剂匣。
16.图3示出了考马斯电泳凝胶数据，用于创建校准曲线及在先前使用过的大容量抗体交联试剂匣上的重组mhc-i复合物的估计容量。
17.图4a-b示出了交联对从试剂匣中富集mhc-i分子的影响。图4a描绘了在试剂匣上富集mhc-i分子后，重组hla及b2m蛋白质(mhc-i分子的次单元)以及样品肽分子及识别mhc-i分子的抗体各自应在液相层析质谱(lc-ms)程序中洗脱的时间。图4b示出了在mhc-i识别抗体与之交联(上图)或非交联(下图)的试剂匣上进行mhc-i富集后，lc-ms运行结果的比较。结果表明，交联对于mhc-i的富集没有明显影响(比较“交联”中的最大峰与正下方“非交联”中的峰的大小)。抗体峰(“非交联”中的最大峰)在交联洗脱中不可见，表明抗体滞留。来自该管柱的第二次洗脱(洗脱2)表明交联也不导致与试剂匣材料的另外的非特异性结合。
18.图5示出了柱状图，其描绘基于在以下工作实例中及该图中柱下方描述的各种条件下滞留于旋转过滤器顶部的体积对裂解物黏度进行的分析。在所述条件下(500μl置于0.45μm costar过滤器上，且于4℃以16,000g旋转1分钟)，水及裂解缓冲液显示没有滞留体积(阴性对照)，而于室温放置一天的mc38裂解物(50m细胞/毫升b缓冲液，阳性对照)显示滞留超过400μl。新鲜granta裂解物(50m细胞/毫升b缓冲液)显示没有滞留，而在室温(典型的、未优化的加载条件)放置4小时者显示黏度显著增加。将温度降低至4℃可以减少聚集，这种方式可以保持18小时以上。如果裂解物用pbs、蔗糖(1m起始，200mm最终)或甘油(50％甘油起始，10％最终)快速冷冻，然后解冻，则即使在室温放置4小时后粘度仍很低(然而室温放置24小时导致粘度大幅增加)。将蔗糖及甘油保存相结合(导致更稀的裂解物溶液)使得冻融时不会立即出现明显滞留，或在室温放置4小时后无明显滞留。
19.图6a-h示出了若干文氏图，其描绘同一批次的granta裂解物的不同试剂匣富集之间的组成重叠(参见实例2)。使用tic信号对每个数据集中的肽进行丰度加权(因此丰度更高的肽对所计算的重叠的贡献更大)，但未对丰度进行校正(因此在计算中保持lc-ms/ms运行之间的不同信号量)。数字代表在ms/ms运行中从包含mhc-i复合物的溶液中检测到的独特肽的数量。此处进行的比较包括“湿性”与“干燥”试剂匣之间、相同类型的复制试剂匣之间、以及多次重复使用之间的比较。具体地，图6a将先前湿性存储的试剂匣(e1w1)与干燥存储的试剂匣(e1d1)的第一次使用(第一次洗脱或e1)进行比较。图6b及图6c示出了使用不同组的经湿性存储与干燥存储的试剂匣(w2/d2与w3/d3)的类似比较。图6d示出了来自全部经干燥存储的相同类型的三种不同试剂匣(d1、d2、d3)的第一次洗脱(即第一次使用；e1)的结果的重叠。图6e示出了来自经湿性存储的三种不同试剂匣(w1、w2或w3)的第二次洗脱(e2)的重叠。图6f、6g及6h示出了对于三种不同的经干燥存储的试剂匣(d1(图6f)、d2(图6g)及d3(图6h))的第一次、第五次及第九次使用(e1、e5及e9)的比较。
具体实施方式
20.定义
21.除非另外定义，否则结合本发明使用的科学及技术术语应具有熟悉此项技术者通常所理解的含义。
22.在本技术中，除非另外陈述，否则所使用的“或”指的是“和/或”。在多重从属权利要求的背景中，所用的“或”仅以替代形式重新提及多于一个前述独立或从属权利要求。同样，除非另外具体陈述，否则诸如“要素”或“组分”等术语涵盖包含一个单元的要素及组分以及包含多于一个次单元的要素及组分两种情况。
23.如本文所阐述，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所引述范围及(在适当时)其分数部分(诸如整数的十分之一及百分之一)内的任何整数值。
24.单位、前缀、及符号是以国际单位制(syst
è
me international de unites(si))接受的形式来表示。数值范围包括界定该范围的数字。本文所提供的标题并不限制本公开的各个方面，这些方面可参照整体说明书来掌握。因此，下文即将定义的术语是参照说明书全文来更全面地定义。
25.应理解，除非另外指示，否则根据本公开所用的下列术语具有下列含义：
26.本文所用的“样品”指的是可含有用于检测或富集的分析物的任何试样。本文中的“溶液”指的是液体形式的样品。
27.本文中的“分析物”以最广泛含义使用，指的是可在样品或溶液中发现的分子或物质，该分子或物质旨在与基质上的检测分子结合(即，被该检测分子识别或检测)，且从而被检测或富集。在一些情况下，分析物可以为蛋白质或肽或另一种类型的生物分子。
28.如本文所用，“检测分子”为直接或间接与分析物特异性结合的任何分子。检测分子可以为例如抗体、抗原分子、不全抗原分子或与分析物特异性结合且与基质相容的任何分子。如本文所用，附着于基质的“检测分子”可以为单一分子种类的分子，或者替代性地，可以为两种或更多种不同分子种类的分子的混合物。
29.在一些实施例中，该分析物和/或检测分子可以为蛋白质或多肽或肽分子。术语“多肽”及“蛋白质”可互换使用且指的是氨基酸残基的聚合物。该氨基酸残基聚合物可含有天然和/或非天然氨基酸残基，且包括但不限于氨基酸残基的胜肽、寡肽、二聚体、三聚体、及多聚体。术语还包括具有修饰(诸如例如糖基化、唾液酸化、及诸如此类)的氨基酸聚合物或与其他分子复合者。本文中的“肽”为相对较短的氨基酸聚合物，诸如大约4至50个氨基酸。
30.在一些情况下，蛋白质可以为抗体。术语“抗体”或“ab”在本文中以最广泛含义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体(“mab”)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体结合体及抗原结合片段，只要其展现所需抗原结合活性。如本文所用，该术语指的是包含重链的至少互补决定区(cdr)1、cdr2及cdr3以及轻链的至少cdr1、cdr2及cdr3的分子，其中该分子能够与抗原结合。该术语还涵盖抗原结合片段。术语“抗原结合片段”包括但不限于能够结合抗原的抗体的片段，诸如fv、单链fv(scfv)、fab、fab’及(fab’)2。相比之下，“全长抗体”指的是包含其所有正常可变区及恒定区部分的抗体分子。抗体结合体可包含直接或间接连接至另一分子的全长抗体或抗原结合片段。如同其他蛋白质及肽，在一些实施例中，抗体可含有各种类型的转译后修饰，诸如糖基化。
31.本文中的“检测”以最广泛含义使用，以涵盖溶液中分析物比溶液中其他分子更具选择性的结合，例如，以测定溶液中是否存在分析物以及将分析物与该溶液中的其他组分分离，从而富集分析物。在一些情况下，本文中的方法用于检测分析物的存在。在一些情况
下，例如，本文中的方法用于与溶液中的其他分子相比“富集”或“分离”分析物，因此可以对分析物进行进一步分析。术语“富集”与“分离”在本文的上下文中可互换使用。
[0032]“试剂匣”在广义上用于指的是容纳或保持“基质”的整体产品。“试剂匣”可以具有任何可用的形状或结构并且可以由任何可用的材料制成，例如玻璃或塑胶材料或聚合材料。“试剂匣”可以包含任何可用的材料，其配置或成形为使得它可以包围或容纳基质并将其保持在适当的位置。通常，试剂匣允许流体流过和/或流经基质。在一些实施例中，基质可以被放置在两端具有开口的管形或圆柱形试剂匣中(例如，如在移液管尖端、毛细管、管柱或其他配置中)，以促进在使用期间将液体溶液移入试剂匣及从试剂匣移出，例如经由自动液体分配装置。例如，在一些情况下，试剂匣可以具有u形，或包含一个孔，允许从基质的一端转移流体，或者它可以具有其中或其上定位有基质的平盘状或扁平的晶片状结构，允许流体流过其表面。
[0033]“基质”广义上指的是可以附着检测分子的物质。本文中的适合的基质包括层析基质，例如c4、c8或c18，或各种类型的珠粒、粒子或树脂，例如二氧化矽、聚合物珠粒和/或金属珠粒。在一些情况下，基质可以涂覆有蛋白质，例如可以识别检测分子的抗体、抗原、抗体恒定区结合蛋白质或不全抗原。例如，蛋白质a、g或l可以存在于基质上以识别抗体检测分子，或者可以在基质上使用链霉亲和素以识别生物素化的检测分子。在由珠粒或树脂粒子组成的基质中，该粒子可以具有任何适宜的形状或大小，只要它们能容纳检测分子，例如球形或大致球形的珠粒，或其他形状，例如丸粒、碎片、片状等。在一些实施例中，该基质粒子可以为磁性的。
[0034]
检测分子可以共价或非共价地“附着”于基质上。在一些实施例中，可使用交联剂以便使检测分子与基质交联。附着也可以为直接或间接的，即，在基质材料与检测分子之间没有或具有中间分子。
[0035]
如果试剂匣可用于检测第一溶液中的分析物，然后清洗并再次平衡以检测第二溶液中的分析物，而在使用相同技术方案的多次测试中检测分析物的能力没有显著、可观察的差异，则该试剂匣可以为“可重复使用的”。
[0036]
本文中的基质可以于湿性或干燥状态存储。以“湿性状态”存储指的是基质保持浸没于液体溶液中，例如缓冲溶液。以“干燥状态”存储指的是基质在存储期间至少部分地暴露于空气，或者在存储之前或期间允许液体从基质蒸发。
[0037]“特异性结合”或“特异性地结合至”或“特异性识别”或如本文所用的关于检测分子与分析物之间的结合的类似术语指的是，结合的亲和力比分析物与检测分子间的结合是由于非特异性结合时具有的亲和力将更高。
[0038]“质谱仪”或“ms”指的是量测样品中的一种或多种分子的质荷比(m/z)的技术。如本文所用，“串联式ms”或“ms/ms”指的是将单个离子、多个离子或整个质量包络(前驱体)移动至段化腔室且接着讲片段化产物送至质量分析仪。根据质谱仪的设计，片段化事件可能发生在单个质量分析仪之前、两个或多个不同分析仪之间或单个质量分析仪内。
[0039]
用于初次使用及再次使用的试剂匣以及制备试剂匣的方法
[0040]
本公开尤其涉及用于检测溶液中的分析物的可重复使用的试剂匣，其中该试剂匣包含基质，其任选地由试剂匣或试剂匣内包含的结构保持在适当位置，其中特异性识别分析物的检测分子例如通过与基质中的物质非共价地结合而附着于该基质。在一些情况下，
检测分子可以与基质交联，例如，以避免在各种处理过程中从基质上脱落。
[0041]
本文中的可重复使用试剂匣可以为用于保持基质的任何合适的形状，以便可以进行分析物的检测。在一些实施例中，起始试剂匣可包含用于保持基质的管或圆柱形部件。例如，试剂匣可以为自旋或重力流动管柱或移液管尖端或层析管柱的形状，允许流体通过离心或重力流动流过包埋于内部的基质。替代性地，该试剂匣可包含保持基质的柔性管路或毛细管。在一些情况下，基质可能被过滤器包围，过滤器足够粗以允许溶液成分自由通过，但足够细以将基质材料保持在适当位置。在一些实施例中，试剂匣可具有在一端开口的管状或孔状结构，或将基质保持在适当位置的平盘状结构或扁平的晶片状结构。例如，管、孔或平盘可以在一端或一侧开口，以允许与缓冲液接触以及与含有分析物的溶液接触并去除该溶液。
[0042]
在一些实施例中，单个试剂匣包含多于一个包含基质的空间、空腔、位置或孔，使得一个试剂匣可用于运行若干个不同的检测反应。在其他实施例中，单个试剂匣包含单个基质成分，因此为了平行运行不同的检测反应，需要多个试剂匣。在一些实施例中，试剂匣可以布置成多样品系统，例如96样品或384样品系统等，例如用于自动处理及液体分配。
[0043]
在一些实施例中，试剂匣具有例如2μl至1ml的体积容量，例如10μl至500μl、2μl至50μl、2μl至25μl、2μl至10μl、10μl至50μl、20μl至30μl、20μl至100μl、20μl至200μl、或50μl至500μl、或100μl至1ml、或200μl至1ml。在一些实施例中，试剂匣具有例如5μl或10μl或20μl或25μl或50μl或100μl的体积容量。
[0044]
在一些实施例中，基质包含任何形状的粒子，例如，可供检测分子附着于其上的粒子，例如颗粒或珠粒或碎片或球体或丸粒或片状等。在一些实施例中，粒子可以由例如二氧化矽或琼脂糖等物质制成。在一些实施例中，粒子可以为磁性的，例如，以允许它们在需要时于分析期间移动，或者被保持在试剂匣中的适当位置。例如，在一些情况下，磁性粒子可能会于分析期间移入及移出试剂匣。在其他实施例中，基质为检测分子可以附着于其上的薄膜或薄片。在一些实施例中，可以例如经由过滤器(例如在每端具有开口的管中)或通过重力(例如在一端具有开口的管中)或通过与试剂匣表面的疏水或静电交互作用(例如放置在平盘或晶片上的基质薄片或薄膜)将基质保持在适当位置。
[0045]
在一些实施例中，检测分子直接附着于基质，例如通过非共价结合。在一些实施例中，它们经由共价结合与基质中的分子连接。在一些实施例中，检测分子经由本身附着于基质的中间分子间接地附着于基质。例如，在一些实施例中，基质包含与特定类型的检测分子结合的分子，例如与生物素化分子结合的链霉亲和素，或识别免疫球蛋白的分子，例如蛋白质a、蛋白质g或蛋白质l，或该分子中两者或更多者的组合。例如，将包含蛋白质a的基质与抗体检测分子接触允许抗体检测分子透过其与基质上的蛋白质a结合而并入到基质上。在一些实施例中，虽然基质可包含试剂例如链霉亲和素或蛋白质a和/或g，但该分子并非本文所用术语的“检测分子”，因为它们不用于特异性地识别特定分析物，而仅为本文中检测分子所连接的分子。因此，例如，在一些实施例中，如果基质包含蛋白质a，则检测分子可包含抗体或其他免疫球蛋白或含有fc的分子，其通过蛋白质a与基质结合。蛋白质a用作基质粒子与检测分子之间的中间链接，而非用作检测分子本身。
[0046]
在一些实施例中，添加到基质中的检测分子还可与基质交联。例如，交联试剂，例如庚二亚氨酸二甲酯(dmp)、或氰酸酯、nhs酯、吖内酯、羰基二咪唑(cdi)、顺丁烯二酰亚胺、
碘乙酰基、吡啶二硫化物、酰肼或碳二亚胺试剂，或其他适合将亲和性试剂固定于基质上的试剂，可用于将检测分子附着于基质。(参见，例如，www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/covalent-immobilization-affinity-ligands.html，用于进一步讨论如何使用该及另外的交联试剂将分子附着于琼脂糖基质。)在其他实施例中，依据试剂匣的预期用途及检测分子的特性，可能不需要交联。在一些实施例中，当dmp用作交联剂时，1至10mm dmp、1至5mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm dmp用于将检测分子与基质交联。在本文的一些实施例中，用于交联反应的dmp的浓度为通常用于该反应的浓度的约四分之一至五分之一。
[0047]
在一些实施例中，本文中的试剂匣还包含至少一种冷冻保护剂，例如蔗糖、海藻糖、二醇例如乙二醇或丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)或二甲基亚砜(dmso)。例如，冷冻保护剂可以与基质接触，例如以保护检测分子和/或其他基质成分于存储期间例如于干燥状态下存储期间免受损坏或变性。在一些情况下，该冷冻保护剂包含葡萄糖和/或海藻糖。在一些情况下，该冷冻保护剂包含海藻糖。
[0048]
因此，在一些实施例中，本文中的可重复使用试剂匣包含(a)基质及(b)附着于该基质的分子，其中该侦测分子特异性结合于检测该分析物，并且其中该检测分子任选地与该基质交联。在一些实施例中，本文中的可重复使用试剂匣包含(a)基质；(b)附着于该基质的检测分子，其中该检测分子特异性结合于该分析物，并且其中该检测分子任选地与该基质交联；及(c)至少一种冷冻保护剂。
[0049]
某些用于分析物检测的市售试剂匣及基质通常预期仅使用一次并丢弃，并且还预期在使用前保持为湿性状态。(参见，例如，bravo试剂匣，agilent。)本公开令人惊讶地显示，本文所述的试剂匣可以重复使用多次而不会显著损失信号以检测细胞培养物上清液或细胞裂解物中的分析物，并且试剂匣可以于干燥状态存储。在一些实施例中，该试剂匣于干燥状态存储。在一些这样的情况下，该试剂匣包含冷冻保护剂并且于干燥状态存储。在一些情况下，试剂匣于2至8℃于干燥状态存储，例如在冰箱或冷藏室中，或于4℃存储。在一些情况下，在用于检测分析物之前，再次润湿于干燥状态存储的试剂匣。在一些情况下，在再次使用之前，任选地于降低温度之前，可以通过存储下述干燥试剂匣基质：加热至至少30℃，例如加热至30至45℃、30至37℃、30℃或37℃，例如持续至少30分钟，持续30至60分钟，或60至120分钟，接着使其于室温冷却至少1小时，例如至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时或隔夜。在一些实施例中，该试剂匣于湿性状态存储，例如，其中基质浸没于缓冲溶液中。在一些情况下，试剂匣于2至8℃于湿性状态存储，例如在冰箱或冷藏室中，或于4℃存储。在一些这样的情况下，该试剂匣包含冷冻保护剂并且于湿性状态存储。
[0050]
在一些实施例中，该试剂匣如上所述以7.0或更低的ph存储。在一些实施例中，该试剂匣以酸性ph(即，低于7.0的ph)存储。在一些实施例中，该试剂匣以ph 4至7，例如ph 4至6、ph 4至6.5、ph 4.5至6.5、ph 4.8至6.8、ph 5至7、ph 4至5、ph 5至6、ph 6至6.5或ph 6至7存储。在一些实施例中，该试剂匣在包含edta和/或叠氮化钠的缓冲液中存储。
[0051]
在本文的一些实施例中，该试剂匣为先前已使用过至少一次以检测溶液中的分析物的试剂匣。例如，在一些实施例中，试剂匣可用于检测溶液中的分析物，并且所检测的分析物被洗脱以将其从试剂匣中移除，并且试剂匣基质与包含冷冻保护剂的缓冲液接触以在
使用之间存储。在一些实施例中，该缓冲液任选地处于酸性ph和/或包含edta和/或叠氮化钠。在一些实施例中，该试剂匣可以重复使用至少9次而检测能力没有明显的可观察到的降低。例如，在一些情况下，在第一次到最后一次运行之间所检测的来自样品至分析物的组成或量没有显著变化的情况下，对于相同样品可以重复使用试剂匣至少9次。(参见，例如，图6a-h。)在一些实施例中，该试剂匣可以重复使用至少10、20、50或100次而检测能力没有明显的可观察到的降低。例如，在一些实施例中，相较于第一次使用时洗脱的分析物，具有包含抗体检测分子的基质的试剂匣在使用至少10、20、50或100次后，仍然能够从细胞裂解物或生物流体中洗脱至少90％的蛋白质分析物。在一些实施例中，相较于第一次使用时洗脱的分析物，具有包含抗体检测分子的基质的试剂匣在使用至少10、20、50或100次后，仍然能够从细胞裂解物或生物流体中洗脱至少95％的蛋白质分析物。在一些实施例中，相较于第一次使用时试剂匣的效率，具有包含抗体检测分子的基质的试剂匣在使用至少10、20、50或100次后，仍然能够以至少90％的效率检测及富集生物样品中的蛋白质分析物。在一些实施例中，相较于第一次使用时试剂匣的效率，具有包含抗体检测分子的基质的试剂匣在使用至少10、20、50或100次后，仍然能够以至少95％的效率检测及富集生物样品中的蛋白质分析物。在一些这样的情况下，该试剂匣在每次使用之间于干燥状态与冷冻保护剂一起存储。在一些该情况下，该试剂匣在每次使用之间于湿性状态与或不与冷冻保护剂一起存储。在一些情况下，试剂匣在使用之间于2至8℃于干燥或湿性状态存储，例如在冰箱或冷藏室中，或于4℃存储。在一些情况下，在每次使用之间将其与酸性ph且/或包含edta和/或叠氮化钠的缓冲液一起存储。
[0052]
在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少两次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少三次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少四次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少五次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少六次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少七次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少八次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少九次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少十次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少20次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少50次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些实施例中，该试剂匣为已使用过至少100次以检测溶液中的分析物的试剂匣。在一些这样的情况下，在先前一次或多次使用之后，该试剂匣已于干燥状态与冷冻保护剂一起存储。在一些这样的情况下，该试剂匣在每次使用之后已于湿性状态与或不与冷冻保护剂一起存储。在一些情况下，试剂匣在使用之间已于2至8℃于干燥或湿性状态存储，例如在冰箱或冷藏室中，或于4℃存储。在一些情况下，在每次使用之间将其与酸性ph且/或包含edta和/或叠氮化钠的缓冲液一起湿性存储。在一些情况下，在每次使用之间将其与冷冻保护剂一起干燥存储，但在已经用包含edta和/或叠氮化钠的酸性ph缓冲液处理后干燥。
[0053]
在一些试剂匣于2至8℃于干燥状态存储例如在冰箱或冷藏室中或例如于4℃存储的情况下，该试剂匣可存储至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少3
个月或至少6个月。在一些情况下，它可以在添加冷冻保护剂之后，于干燥状态于2至8℃存储，例如在冰箱或冷藏室中，或例如于4℃存储，存储至少24小时，至少48小时，至少1周，至少2周、至少1个月、至少3个月或至少6个月。此外，在一些实施例中，在干燥之前，在用包含edta和/或叠氮化钠的酸性缓冲液进行预先处理之后，它可以在上述条件下存储。在一些试剂匣湿性存储的情况下，它可以在使用之间于包含edta和/或叠氮化钠的酸性ph缓冲液中于2至8℃存储，例如在冰箱或冷藏室中，或例如于4℃存储，存储至少24小时，至少48小时，至少1周，至少2周、至少1个月、至少3个月、至少6个月或至少1年。在其他情况下，试剂匣可以于室温湿性存储于该缓冲液中，前提条件是其存储在使得基质保持浸没于缓冲液中(即，使其保持湿性)的条件下。本公开还准备涉及用于在使用之间存储的可重复使用试剂匣的方法。例如，在一些方法中，在先前的分析物检测洗脱之后，将试剂匣于缓冲液中洗涤至少一次，该缓冲液例如1％至10％乙酸例如1％、5％或10％乙酸，1％甲酸或1％三氟乙酸(tfa)，且随后将基质与冷冻保护剂例如在ph 7或更低的缓冲液中接触，或在例如ph 4至7的缓冲液中接触，或在例如ph 4至6、ph 4至6.5、ph 4.5至6.5、ph 4.8至6.8、ph 5至7、ph 4至5、ph 5至6、ph 6至6.5、or ph 6至7的酸性缓冲液中接触。在一些实施例中，该冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)或二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。在一些实施例中，该冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。在一些实施例中，该冷冻保护剂包含海藻糖。在一些实施例中，包含冷冻保护剂的缓冲液还包含edta和/或叠氮化钠。在一些实施例中，然后使该试剂匣干燥。在一些情况下，在再次使用之前，任选地于降低温度之前，可以通过存储下述干燥试剂匣基质：加热至至少30℃，例如加热至30至45℃、30至37℃、30℃或37℃，例如持续至少30分钟，持续30至60分钟，或60至120分钟，接着使其于室温冷却至少1小时，例如至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时或隔夜。
[0054]
在一些实施例中，可重复使用试剂匣通过下述准备：获得包含基质的试剂匣，或任选地将基质添加到试剂匣中，将基质与检测分子接触，使该分子附着于该基质，以及任选地将该检测分子与该基质交联。在一些情况下，然后去除多余的、未附着的检测分子。使用前，可使用适当的缓冲液平衡该试剂匣。
[0055]
在一些实施例中，该可重复使用试剂匣使用抗体作为检测分子准备。在一些这样的情况下，该基质可包含分子，该分子特异性地识别抗体的例如fc结构域或其他恒定区的部分，理想地允许抗体在不干扰其抗原结合功能的区域结合至该基质。例如，在一些实施例中，将经纯化或分离的抗体暴露于包含例如蛋白质a、蛋白质g或蛋白质l或其组合例如蛋白质a及蛋白质g的基质，使之与基质结合，然后去除多余的抗体。在一些情况下，使用交联剂将抗体检测分子与包含蛋白质a、g和/或l的基质交联。类似地，当使用其他检测分子例如待检测的分析物的不全抗原或其他结合剂时，它们也可与基质交联。
[0056]
在一些实施例中，一种类型的检测分子附着于基质，例如对特定抗原具有特异性的抗体。在其他实施例中，可以将两种或更多种类型的检测分子附着于基质。在一些情况下，识别多于一种分析物的检测分子可以包括在单个基质中，例如靶向两种不同抗原的两种不同抗体，或靶向一组分析物的若干种不同抗体。在其他情况下，例如，可以将识别相同抗原的不同部分的两种或更多种不同抗体附着于基质。因此，在一些实施例中，例如，该基质可以由2、3、4、5、10、20、100或2至5、5至10、10至20、10至50、10至100或50至100种不同的检测分子结合，因此该基质能够识别溶液中的一系列或一组分析物。
[0057]
在一些情况下，该检测分子与该基质交联，例如，以防止它们在重复使用时从基质中浸出。在一些实施例中，该交联剂选自庚二亚氨酸二甲酯(dmp)、氰酸酯、nhs酯、吖内酯、羰基二咪唑(cdi)、顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰基、吡啶二硫化物、酰肼或碳二亚胺。在一些实施例中，使用dmp进行交联。在一些实施例中，与dmp的交联反应在试剂匣中进行，该dmp的浓度为该交联反应的通常推荐浓度的四分之一至五分之一。因此，例如，可推荐使用约20至25mm dmp，但在本案中，小于10mm dmp可用于将蛋白质检测分子(例如抗体)与基质交联。在一些情况下，可以使用3至10mm dmp、3至7mm dmp、5至10mm dmp或4至6mm dmp。在一些情况下，可以使用5mm dmp。在一些实施例中，与通常推荐浓度相比，降低交联剂的浓度提高了试剂匣重复使用的能力而不显著削弱试剂匣基质检测分析物的能力。
[0058]
用于检测多肽的可重复使用试剂匣的示例性用途
[0059]
本公开还涵盖本文中使用及重复使用试剂匣的方法。在一些实施例中，该分析物为例如肽或蛋白质。例如，该分析物可以为被抗体检测分子特异性识别的肽或蛋白质。例如，如本文所述，一种示例蛋白质分析物为mhc-i复合物分子。
[0060]
在一些情况下，可以在生物溶液例如体液(例如血液、血浆、尿液等)或细胞裂解物中检测分析物例如蛋白质或其他生物分子。例如，本文中的方法可以允许从生物流体或细胞裂解物中富集mhc-i复合物分子，使得它们可以在后续步骤如层析法及质谱法中进一步分析。
[0061]
在一些实施例中，在将溶液暴露于试剂匣之前过滤溶液。例如，过滤可帮助去除可能堵塞基质或干扰其后续再次使用的大颗粒。在一些实施例中，溶液在0.1至1μm过滤器上过滤，例如在0.1μm、0.2μm、0.22μm、0.3μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm或0.8μm过滤器上过滤，或在0.1至0.5μm过滤器上，例如在0.1至0.5μm过滤器上，例如0.1μm、0.2μm、0.22μm、0.3μm、0.4μm、0.45μm或0.5μm过滤器上过滤。在一些实施例中，其中生物流体或细胞裂解物用于分析物检测，该流体在与试剂匣基质接触之前冷却，例如在冰上冷却，或冷却到例如2至15℃的温度。例如，在一些实施例中，将样品冷却至2至10℃或4至10℃或10至15℃的温度。在一些实施例中，在降低温度之前，将冷冻保护剂添加到溶液中，例如蔗糖、甘油或海藻糖。在一些实施例中，在添加冷冻保护剂后快速冷冻溶液。在一些实施例中，生物流体或细胞裂解物在与试剂匣基质接触之前被稀释，例如在等张缓冲液中。在一些实施例中，溶液中的总蛋白质浓度可以在与基质接触之前测定，例如在二辛可宁酸(bicinchoninic acid(bca))分析中。
[0062]
在一些实施例中，一旦分析物已从本文中的试剂匣中洗脱，其可通过例如电泳、层析法或结构分析、或质谱法或层析法后联质谱法之类的过程进一步分析。
[0063]
在一些实施例中，还可以定量与基质结合的分析物的量。例如，分析物的量可以通过例如电泳及光密度测定法或通过将来自分析物的信号整合到层析峰中来测定。
[0064]
在一些情况下，使用方法包括使用先前已经用于检测或富集相同或相似分析物的试剂匣来检测或富集分析物。在一些情况下，该试剂匣之前已经使用过至少一次。在一些情况下，该试剂匣之前已经使用过至少两次。在一些情况下，该试剂匣之前已经使用过至少三次。在一些情况下，该试剂匣之前已经使用过至少四次。在一些情况下，该试剂匣之前已经使用过至少五次。在一些情况下，该试剂匣之前已经使用过至少六次。在一些情况下，该试剂匣之前已经使用过至少七次。在一些情况下，该试剂匣之前已经使用过至少八次。在一些
情况下，该试剂匣之前已经使用过至少九次。
[0065]
在一些情况下，该用途包括在洗脱分析物后准备试剂匣以供后续使用，例如通过在缓冲液中将其洗涤至少一次，该缓冲液例如1％至10％乙酸例如1％、5％、或10％乙酸、1％甲酸或1％三氟乙酸(tfa)，并且任选地将基质与冷冻保护剂接触。该冷冻保护剂可以在缓冲液中，例如在ph 7或更低的缓冲液中，或在例如ph 4至7的缓冲液中，或在例如ph 4至6、ph 4至6.5、ph 4.5至6.5、ph 4.8至6.8、ph 5至7、ph 4至5、ph 5至6、ph 6至6.5或ph 6至7的酸性缓冲液中。在一些实施例中，该冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)或二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。在一些实施例中，该冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。在一些实施例中，该冷冻保护剂包含海藻糖。在一些实施例中，包含冷冻保护剂的缓冲液还包含edta和/或叠氮化钠。在一些实施例中，然后使该试剂匣干燥。在一些情况下，在再次使用之前，任选地于降低温度之前，可以通过存储下述干燥试剂匣基质：加热至至少30℃，例如加热至30至45℃、30至37℃、30℃或37℃，例如持续至少30分钟，持续30至60分钟，或60至120分钟，接着使其于室温冷却至少1小时，例如至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时或隔夜。
[0066]
包括试剂匣的试剂盒
[0067]
本公开还涵盖包括本文中试剂匣的试剂盒。在一些实施例中，该试剂匣尚未使用。在其他实施例中，它们先前已经使用过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100次。在一些实施例中，该试剂盒包括如上所述的于干燥状态存储的试剂匣。在一些实施例中，该试剂盒包括如上所述的于湿性状态存储的试剂匣。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括使用说明书。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括用于检测或富集样品中的分析物的试剂，例如平衡、洗涤和/或洗脱缓冲液。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括对照，例如不含检测分子的空白试剂匣或具有不旨在识别分析物的结构相似的检测分子的试剂匣。在一些实施例中，该试剂盒可以被包装以运送到其他地点。在一些实施例中，包括试剂匣的该试剂盒可如上所述于干燥状态存储至少24小时、48小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少3个月、或至少6个月，在一些情况下在室温存储，在其他情况下于2至8℃存储。在一些实施例中，包括试剂匣的该试剂盒可如上所述于湿性状态存储至少24小时、48小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少3个月、至少6个月、或至少1年，在一些情况下在室温存储，在其他情况下于2至8℃存储。在一些实施例中，试剂盒还可包括用于清洁及存储试剂匣的试剂，例如包括冷冻保护剂、edta及叠氮化钠中的一种或多种的缓冲液。在一些实施例中，试剂盒包含一包试剂匣，例如，10、50、100个(例如，包括96孔试剂匣的96孔平盘；或装入96孔平盘系统内的一组约100个管状试剂匣)、500或1000个试剂匣。
[0068]
以下实例提供了对本文中示例性试剂匣以及准备、存储及使用它们的方法的进一步描述，但不旨在限制本公开的范围。
[0069]
实例
[0070]
实例1.准备及测试可重复使用试剂匣
[0071]
试剂匣准备
[0072]
获得以下材料用于准备经抗体涂覆的试剂匣：6个大型assaymap
tm
蛋白质a试剂匣(agilent)、一个seahorse 1孔μ平盘、eppendorf pcr平盘(深孔平盘)、pbs、tbs及25mm tris缓冲液、1％乙酸洗脱缓冲液、以及抗人hla a、b、c抗体w6/32溶液(1mg/ml，在pbs中)。
将试剂匣组装到平盘中的预定义行中并且用pbs平衡，与抗体溶液接触，使抗体结合至试剂匣基质上的蛋白质a，洗涤，然后暴露于交联试剂。具体地，将该试剂匣布置于多孔平盘中，并使用自动液体分配装置(agilent assaymap
tm
bravo)，首先用pbs灌注并平衡该试剂匣，先后使用流速为300μl/min的250μl pbs以及流速为20μl/分钟的150μl pbs进行。然后以20μl/min的流速添加1ml抗体溶液，然后用pbs洗涤试剂匣以去除多余的抗体。
[0073]
然后用交联剂处理试剂匣以将抗体与蛋白质a基质交联。试剂匣首先用200mm三乙醇胺(tea)缓冲液ph 8.2灌注及平衡，然后用体积为200μl的5mm dmp以5μl/min的流速处理。然后首先用250μl tbs清洗试剂匣，接着用250μl 25mm tris清洗，每次流速皆为20μl/min，然后与1％乙酸的洗脱缓冲液(50μl，10μl/min)接触。然后用乙酸、tris及tbs缓冲液(分别为100μl、200μl及200μl体积，流速分别为20μl/min)对试剂匣进行第二次处理，并将试剂匣置于190μl tbs以及1mm edta及0.025％叠氮化钠的存储缓冲液中，确保液体保持在每个试剂匣管柱中的基质顶部上方。
[0074]
某些试剂匣按照如下干燥，而其他试剂匣则存储在存储缓冲液中。准备了20mm his-乙酸盐、200mm海藻糖、ph 6的干燥缓冲液。将270μl干燥缓冲液添加到选择用于干燥存储的试剂匣中。然后将试剂匣于37℃放置1小时使其干燥，然后在使用前于室温存储一整夜。
[0075]
试剂匣测试
[0076]
然后在assaymap
tm
bravo系统中测试如上所述准备的于湿性状态存储以及在使用前于干燥状态存储的经抗体涂覆及交联的试剂匣与溶液中的分析物的结合。具体地，使用3个湿性存储及3个干燥存储的w6/32抗体试剂匣进行测试。该试剂匣在tbs中灌注及平衡(150μl以300μl/min进行灌注，然后100μl以20μl/min进行平衡)，添加分析物溶液(50μl，10μl/min)。将含有hla的溶液添加到湿性或干燥存储的w6/32试剂匣中。然后用250μl tbs以20μl/min的流速洗涤试剂匣，然后用250μl 25mm tris ph 8.0以20μl/min洗涤，随后用50μl 1％乙酸以10μl/min流速洗脱。然后将洗脱物加载到丙烯酰胺电泳凝胶上，然后通过在微波炉中加热1.5分钟用simplyblue
tm
(thermofisher scientific)染色，接着摇动10分钟并在水中脱色1小时。
[0077]
凝胶泳道如下，结果如图2所示。
[0078]
泳道样品体积(μl)1hla标准品102hla标准品53hla标准品24从w6/32湿性存储试剂匣1洗脱155从w6/32湿性存储试剂匣2洗脱156从w6/32湿性存储试剂匣3洗脱157从w6/32干燥存储试剂匣1洗脱158从w6/32干燥存储试剂匣2洗脱159从w6/32干燥存储试剂匣3洗脱15
[0079]
从图2中可以看出，从湿性存储及干燥存储的试剂匣(图2右侧第4至9泳道)中的hla洗脱看起来相等，表明试剂匣可以在湿性存储或干燥存储后使用。
technologies,inc.)添加到平盘中。在使用搅拌将细胞从平盘上提起之前，将平盘于室温静置5分钟。然后将accutase细胞混合物添加到含有生长培养基的离心管(falcon tube)中，使用vicell xr对细胞进行计数并测定每毫升的活细胞浓度，然后在每种条件下，将2.5亿个细胞转移到50ml离心管中。为了收获悬浮granta细胞，如上所述对细胞进行计数及转移。然后通过离心使全部细胞沉淀，去除上清液，将丸粒在液氮中快速冷冻，然后放置于-80℃。
[0091]
细胞裂解与存储
[0092]
将细胞丸粒从-80℃移除，并在置于冰上之前于37℃水浴中快速解冻。将2.5亿个细胞granta丸粒在5ml非变性og清洁剂缓冲液(pbs、0.25％去氧胆酸钠、0.2mm碘乙酰胺、1mm edta、1％辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷(og)及1x蛋白酶+磷酸酶抑制剂(sigma))中裂解，并将裂解物转移到一个5ml微量离心管(eppendorf tube)中。将2.5亿个细胞mc38丸粒在每个10ml og缓冲液中裂解并转移到两个5ml微量离心管中。将裂解物置于冰上30分钟，然后在4℃以20,000g离心沉降60分钟以澄清。澄清的裂解物立即倾倒至50ml离心管真空过滤器(0.45μm，康宁公司)中，并在温和真空下过滤。将经过滤的溶液以4ml等分试样(完整的granta 250m细胞裂解物或mc38 250m细胞裂解物的一半)转移到各自的15ml离心管中，接着各自添加1.33ml的50％甘油及1m蔗糖(最终浓度为10％甘油和200mm蔗糖)。试管通过倒置混合直至均匀，移出10μl用于bca分析，移出30μl用于西方墨点法及凝胶内消化(用于全局蛋白质组学)。然后快速冷冻离心管，并于-80℃放置。
[0093]
试剂匣准备、存储及再次使用
[0094]
如下所述进行试剂匣交联。简而言之，在以1mg/ml的浓度加载1mg抗体之前，将干燥的蛋白质a试剂匣在pbs中灌注，然后用pbs洗涤(对于所有试剂匣尺寸，灌注以300μl/min进行。洗涤及装载小试剂匣分别以10μl及5μl/min进行。洗涤及装载大试剂匣以20μl/min进行)。然后将试剂匣平衡到200mm三乙醇胺(tea，sigma)中，于室温历时40分钟加载tea(ph 8.2)中的5mm庚二亚氨酸二甲酯(dmp，sigma)，然后接连地用tbs、25mm tris(ph 8.0)(tris缓冲液)、1％乙酸、tris缓冲液、以及最后的tbs洗涤。然后将试剂匣在装有tbs、1mm edta、0.025％叠氮化钠的空试剂匣架中于4℃存储，然后封膜。为了制作干燥的试剂匣，将试剂匣缓冲液更换为20mm组氨酸、200mm海藻糖、ph6.0，于37℃放置1小时，然后于室温在黑暗中放置至少18小时以完成干燥。然后以与干燥蛋白质a试剂匣相同的方式重构经干燥的试剂匣。
[0095]
将重复使用的试剂匣转移至assaymap
tm
bravo，每个试剂匣的颈部用棉签擦干(如果从4℃转移)，然后用水灌注，用1％乙酸灌注，并在再次使用前用水清洗。
[0096]
使用试剂匣进行mhc富集
[0097]
将经稀释的冷冻细胞裂解物从-80℃的干冰冷冻器中移出，并于37℃水浴中快速解冻，然后放置在湿冰上，无需混合。将经交联的试剂匣从冰箱中移出并转移至assaymap
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系统，使用qtip将杯子擦干，然后用水灌注，用1％乙酸灌注，并用水洗涤。
[0098]
将500μl的每种裂解物转移至0.45μm costar旋转过滤管，在4℃以16,000g离心沉降1分钟，然后置于冰上。检查旋转过滤管是否在过滤器顶部滞留有裂解物。如果滞留的裂解物体积大于10至20μl，则不会将材料用于试剂匣实验，因为它被认为可能会堵塞试剂匣。将回流至相应15ml离心管的流经液在冰上存储。将样品冷却至10℃。
[0099]
从每个8.3ml离心管中，将每孔1.1ml转移至deepwell
tm
样品平盘的四个孔中
with immune infiltration and increased antigenicity.nat.commun.10,5228(2019)。
[0109]
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技术特征：
1.一种用于检测溶液中的分析物的可重复使用试剂匣，其中所述试剂匣包括：a)基质，b)附着于所述基质的检测分子，其中所述检测分子特异性地与所述分析物结合，并且其中所述检测分子任选地与所述基质交联；以及c)至少一种冷冻保护剂，其中所述试剂匣可用于检测溶液中的所述分析物至少10、20、50或100次，并且其中，每次使用之后，任选地用冷冻保护剂将所述基质存储在干燥状态。2.根据权利要求1所述的可重复使用试剂匣，其中所述试剂匣为两端开口的管、一端开口的管、孔、带孔或不带孔的板、或能够容纳所述基质的芯片。3.根据权利要求1或2所述的可重复使用试剂匣，其中所述基质包含含有二氧化硅或琼脂糖的颗粒(例如珠粒、细粒、碎片或丸粒)，其中所述颗粒任选地为磁性的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中所述基质包含蛋白质a、蛋白质g和/或蛋白质l。5.根据权利要求1至4中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中所述检测分子为抗体。6.根据权利要求1至5中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中所述检测分子与所述基质交联。7.根据权利要求6所述的可重复使用试剂匣，其中所述检测分子用选自以下各项的交联剂与所述基质交联：庚二亚氨酸二甲酯(dmp)、氰酸酯、nhs酯、吖内酯、羰基二咪唑(cdi)、顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰基、吡啶基二硫化物、酰肼或碳二亚胺。8.根据权利要求1至7中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中通过所述基质上的所述检测分子可检测的所述分析物为蛋白质或肽。9.根据权利要求8所述的可重复使用试剂匣，其中所述分析物为主要组织相容性复合物i(mhc-i)分子。10.根据权利要求1至9中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中所述试剂匣可用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少10次。11.根据权利要求1至10中任一项所述的可重复使用试剂匣，其存储在所述干燥状态。12.根据权利要求11所述的可重复使用试剂匣，其中在每次使用后于所述干燥状态储存后，所述试剂匣可用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少10次。13.根据权利要求11所述的可重复使用试剂匣，其中在每次使用后于所述干燥状态储存后，所述试剂匣可用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少20次。14.根据权利要求11所述的可重复使用试剂匣，其中在每次使用后于所述干燥状态储存后，所述试剂匣可用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少50次。15.根据权利要求11所述的可重复使用试剂匣，其中在每次使用后于所述干燥状态储存后，所述试剂匣可用于检测细胞裂解物或生物流体中的蛋白质分析物至少100次。16.根据权利要求11至15中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中所述基质以酸性ph存储。17.根据权利要求11至16中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中所述基质存储在2至8℃。18.根据权利要求1至10中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中所述基质存储在湿性
状态。19.根据权利要求18所述的可重复使用试剂匣，其中所述基质以酸性ph存储。20.根据权利要求18或19所述的可重复使用试剂匣，其中所述基质存储在2至8℃。21.根据权利要求1至20中任一项所述的可重复使用试剂匣，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)或二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。22.一种准备先前使用过的根据权利要求1至21中任一项所述的试剂匣以供再次使用的方法，其包括：在已从所述试剂匣洗脱分析物后，在1至10％乙酸、1％甲酸或1％三氟乙酸(tfa)中洗涤所述基质，在包含冷冻保护剂的缓冲液中洗涤所述基质，以及使所述基质干燥。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)或二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中通过加热所述试剂匣至至少30℃，随后在室温储存至少1小时使所述基质干燥。25.根据权利要求24所述的方法，其中通过加热所述试剂匣至37℃，随后在室温储存至少1小时使所述基质干燥。26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中在使所述基质干燥后，将所述试剂匣在2至8℃于干燥状态存储直到再次使用。27.一种准备根据权利要求1至21中任一项所述的可重复使用试剂匣的方法，所述方法包括：获得包含基质的试剂匣，将所述基质与检测分子接触，以及将所述检测分子与所述基质交联。28.一种检测溶液中的分析物的方法，其包括：将根据权利要求1至21中任一项所述的可重复使用试剂匣的所述基质与包含所述分析物的溶液接触，以及任选地从所述试剂匣洗脱所述分析物。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述分析物为肽或蛋白质。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述分析物为mhc-i分子。31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述溶液为生物流体或细胞裂解物。32.根据权利要求31所述的方法，其中在与所述基质接触之前，将所述溶液过滤或处理以去除细胞碎片和膜物质。33.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中在将所述试剂匣用于所述方法之前，所述试剂匣先前已用于检测所述分析物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100次。34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中在洗脱分析物之后，通过根据权利要求22至26中任一项所述的方法来处理所述试剂匣。35.一种试剂盒，其包括至少一个根据权利要求1至21中任一项所述的可重复使用试剂匣。36.根据权利要求35所述的试剂盒，其进一步包括：(a)至少一种缓冲液；(b)没有检测分子或具有对照检测分子的至少一个对照试剂匣；(c)用于准备所述试剂匣以供储存和再次使用的试剂；和/或(d)使用说明书。

技术总结
本公开涉及准备包含基质的可重复使用且可干燥的试剂匣，以用于检测或富集样品中的分析物，诸如被抗体识别的抗原的方法，所述基质包含检测分子，诸如抗体。在一些实施方案中，所述试剂匣包括保持所述基质的管或孔。在一些实施方案中，所述基质或相关联的试剂匣可以湿性或干燥地进行存储。本公开还涉及所述试剂匣及其使用方法。其使用方法。其使用方法。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：基因泰克公司
技术研发日：2021.11.18
技术公布日：2023/7/22