基于动态分析的相对fu比的测定方法与流程

cytochrome p450 inhibition data in the prediction of drug-drug interactions."jpharmacol exp ther 316(1):336-348.


技术实现要素：

24.发明要解决的课题
25.在这些公知的方法中，处理fu值低的化合物(血浆中蛋白结合率高的化合物、高蛋白结合率化合物)时，由于达到平衡状态的时间长、在缓冲室壁面的吸附影响成为问题，所以认为难以得到准确的数值。因此，认为利用平衡透析求出fu值的方法是适合利用的化合物被限定的方法。此外，低值的fu值是容易产生误差的值(例如，fu＝0.00001和fu＝0.00002等数值)，分别得到它们，用于多种试样之间的比较(小鼠、大鼠、狗、猴、人间的比较)时，会导致误差的增加，在分析精度方面也被认为是不利的。在非专利文献2的方法中，在求出fu值的计算过程中，从低分子化合物求出的半透膜透过速度(pmem[m/s])的平均值被用作求各化合物fu值时的共同值。但是，由于pmem根据stokes-einstein的理论，被认为是与分子量呈负相关的系数，因此认为在环孢素(分子量：1202.61)等化合物分子量大而过高评价pmem时，非专利文献2的方法的误差会增加。此外，在化合物分子量大的情况下，由于达到平衡状态的时间长，因此认为对于fu值低的化合物，难以从实验得到准确的fu值。在非专利文献3的方法中，仍然使用缓冲室，不能应对于环孢素等向器件的吸附强的化合物。在非专利文献4、5中，在求出fu比时也使用达到平衡状态后的浓度。因此，难以检测未达到平衡状态的化合物的fu比，认为不适合fu值低的化合物(即高蛋白结合率化合物)。
[0026]
在本发明中，鉴于上述课题，以提供对于高蛋白结合率化合物在短时间取得高精度的fu值之比的方法作为课题。
[0027]
用于解决课题的手段
[0028]
为了解决上述课题，本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过组合平衡透析和动态分析，即使是高蛋白结合率化合物，也能够以高精度且短时间取得该化合物的不同生物学试样之间的相对未结合型分数比(相对fu比)。使用该相对fu比，根据一个生物学试样来源的种中的药物清除率或分布容积的数据，能够修正其他生物学试样来源的种中的药物清除率或分布容积的数据，能够对人药代动力学进行精度良好的预测。
[0029]
即，本发明涉及以下内容。
[0030]
[1]
[0031]
一种用于求出不同生物学试样之间的测定对象物质的相对未结合型分数比(相对fu比)的方法，其包括以下工序：
[0032]
(1)准备相邻室彼此被测定对象物质能够透过的半透膜隔开的室系统(i)的工序；
[0033]
(2)在所述室系统(i)内，在一个室(供体侧室)中添加含有第一生物学试样(a)及所述测定对象物质的供体溶液的工序；
[0034]
(3)在所述室系统(i)内，在与所述供体侧室不同的室(受体侧室)中添加含有第二生物学试样(b)的受体溶液的工序；
[0035]
(4)经时测定所述工序(2)的供体溶液和所述工序(3)的受体溶液中的所述测定对象物质的浓度的工序；以及
[0036]
(5)使用与在所述工序(4)中测定的测定对象物质的浓度相关的数据，计算相对fu比的工序。
[0037]
[2]
[0038]
根据[1]所述的方法，其进一步包括以下工序：
[0039]
(6)准备相邻室彼此被使测定对象物质透过的半透膜隔开的、与所述室系统(i)不同的室系统(ii)的工序；
[0040]
(7)在所述室系统(ii)内，在一个室(受体侧室)中添加含有所述生物学试样(a)的受体溶液的工序；
[0041]
(8)在所述室系统(ii)内，在与所述受体侧室不同的室(供体侧室)中添加含有所述生物学试样(b)及所述测定对象物质的供体溶液的工序；
[0042]
(9)经时测定所述工序(7)的受体溶液和所述工序(8)的供体溶液中的所述测定对象物质的浓度的工序；以及
[0043]
(10)使用与在所述工序(9)中测定的测定对象物质的浓度相关的数据，计算相对fu比的工序。
[0044]
[3]
[0045]
根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述生物学试样(a)和/或(b)被缓冲液稀释。
[0046]
[4]
[0047]
根据[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，所述半透膜的分级分子量为50kda以下。
[0048]
[5]
[0049]
根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，所述工序(5)及(10)是动态分析。
[0050]
[6]
[0051]
根据[5]所述的方法，其中，所述动态分析使用下述式1至式3而进行：
[0052]
(式1)
[0053][0054]
(式2)
[0055][0056]
(式3)
[0057][0058]
(式中，
[0059]
式1表示供体溶液中的测定对象物质的每单位时间的量的变化，式2表示受体溶液中的测定对象物质的每单位时间的量的变化，式3表示供体侧室中的吸附级分的测定对象物质的每单位时间的量的变化；
[0060]
v1表示供体溶液的容积，v2表示受体溶液的容积，fu1表示测定对象物质相对于供体溶液中所含有的生物学试样的fu值，fu2表示测定对象物质相对于受体溶液中所含有的生物学试样的fu值，c1表示供体溶液中的测定对象物质的浓度(总浓度：结合型及未结合型
测定对象物质的合计。但是，吸附在平衡透析装置的测定对象物质除外)，c2表示受体溶液中的测定对象物质的浓度(总浓度：结合型及未结合型测定对象物质的合计)，ps表示未结合型测定对象物质的透析膜透过清除率，clad表示供体侧室中的测定对象物质的吸附清除率，koff表示供体侧室中的吸附级分的测定对象物质的解离速度常数，xad表示供体侧室中的测定对象物质的吸附量)。
[0061]
[7]
[0062]
根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中，所述经时测定在所述生物学试样和/或所述测定对象物质变性的时间内进行。
[0063]
[8]
[0064]
根据[1]至[7]中任一项所述的方法，其中，所述经时测定在24小时内进行。
[0065]
[9]
[0066]
根据[1]至[8]中任一项所述的方法，其中，所述室系统(i)和/或所述室系统(ii)由2个室构成。
[0067]
[10]
[0068]
根据[1]至[9]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(a)中的所述测定对象物质的蛋白结合率为95％以上。
[0069]
[11]
[0070]
根据[1]至[10]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(b)中的所述测定对象物质的蛋白结合率为95％以上。
[0071]
[12]
[0072]
根据[1]至[11]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(a)是选自由微粒体级分、血液、血浆和血清组成的组中的一种。
[0073]
[13]
[0074]
根据[1]至[12]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(b)是选自由微粒体级分、血液、血浆和血清组成的组中的一种。
[0075]
[14]
[0076]
根据[1]至[13]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样是血清。
[0077]
[15]
[0078]
根据[1]至[14]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(a)来自哺乳动物。
[0079]
[16]
[0080]
根据[1]至[15]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(b)来自哺乳动物。
[0081]
[17]
[0082]
根据[1]至[16]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(b)来自与所述生物学试样(a)来源的动物物种不同的动物物种。
[0083]
[18]
[0084]
根据[1]至[17]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(a)来自选自由小鼠、大鼠、兔、狗、猴和人组成的组中的一种。
[0085]
[19]
[0086]
根据[1]至[18]中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(b)来自选自由小鼠、
大鼠、兔、狗、猴和人组成的组中的一种。
[0087]
[20]
[0088]
根据[1]至[19]中任一项所述的方法，其中，所述测定对象物质的clogp为25以下。
[0089]
[21]
[0090]
根据[1]至[20]中任一项所述的方法，其中，所述测定对象物质的分子量为5000以下。
[0091]
[22]
[0092]
根据[1]至[21]中任一项所述的方法，其中，所述测定对象物质是低分子化合物或肽化合物。
[0093]
[23]
[0094]
根据[1]至[22]中任一项所述的方法，其中，所述测定对象物质是具有环状结构的肽化合物。
[0095]
[24]
[0096]
根据[1]至[23]中任一项所述的方法，其中，所述测定对象物质是具有非天然氨基酸残基的肽化合物。
[0097]
[25]
[0098]
根据[24]所述的方法，其中，所述非天然氨基酸残基是非天然n取代氨基酸残基。
[0099]
[26]
[0100]
根据[1]至[25]中任一项所述的方法，其中，所述测定对象物质是氨基酸残基数为7以上且30以下的肽化合物。
[0101]
[27]
[0102]
使用根据[1]至[26]中任一项所述的方法求出的所述相对fu比和所述生物学试样(a)或所述生物学试样(b)中任一者来源的种中的药物清除率数据，预测另一者生物学试样来源的种中的药物清除率的方法。
[0103]
[28]
[0104]
使用根据[1]至[26]中任一项所述的方法求出的所述相对fu比和所述生物学试样(a)或所述生物学试样(b)中的任一者来源的种中的药物分布容积数据，预测另一者生物学试样来源的种中的药物分布容积的方法。
[0105]
发明效果
[0106]
根据本发明的方法，即使是高蛋白结合率化合物，也能够在对平衡透析不一定需要达到平衡状态的情况下，以高精度且短时间取得测定对象物质涉及的不同生物学试样之间的相对fu比。另外，通过使用该相对fu比的值，根据一个生物学试样来源的种中的药物清除率或分布容积的数据，能够精度良好地预测其他生物学试样来源的种中的药物清除率或分布容积的数据。
[0107]
附图简单说明
[0108]
[图1]图1(1a～1h)表示本发明方法的工序的示意图的一例。
[0109]
[图2]图2(2a～2h)表示本发明方法的工序的示意图的一例。与图1的情况不同的是，放入生物学试样(a)及(b)的室。
[0110]
[图3]图3是通过动态分析软件(“simbiology(注册商标)/matlab，版本信息：
9.7.0.1190202(r2019b)”、the math works，inc.公司制)实施分析时的数理模型的图。
[0111]
[图4]图4((1)～(4))表示根据本发明的方法，使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用硝苯地平的情况下，从透析反应开始时经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻(横轴)处的各溶液中的测定对象物质的浓度(纵轴)的绘图(实测值：圆形标记)以及通过对这些绘图的动态分析的拟合曲线(预测值：曲线)。
[0112]
图4(1)表示使用人血清和小鼠血清的结果。在图4(1)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(小鼠血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(小鼠血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0113]
图4(2)表示使用人血清和大鼠血清的结果。在图4(2)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(大鼠血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(大鼠血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0114]
图4(3)表示使用人血清和狗血清的结果。在图4(3)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(狗血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(狗血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0115]
图4(4)表示使用人血清和猴血清的结果。在图4(4)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(猴血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(猴血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0116]
[图5]图5((1)～(4))表示根据本发明的方法，使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用环孢素的情况下，从透析反应开始时经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻(横轴)处的各溶液中的测定对象物质的浓度(纵轴)的绘图(实测值：圆形标记)以及通过对这些绘图的动态分析的拟合曲线(预测值：曲线)。
[0117]
图5(1)表示使用人血清和小鼠血清的结果。在图5(1)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(小鼠血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(小鼠血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0118]
图5(2)表示使用人血清和大鼠血清的结果。在图5(2)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(大鼠血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(大鼠血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0119]
图5(3)表示使用人血清和狗血清的结果。在图5(3)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(狗血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(狗血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0120]
图5(4)表示使用人血清和猴血清的结果。在图5(4)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(猴血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(猴血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0121]
[图6]图6((1)～(4))表示根据本发明的方法，使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用布洛芬的情况下，从透析反应开始时经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻(横轴)处的各溶液中的测定对象物质的浓度(纵轴)的绘图(实测值：圆形标记)以及通过对这些绘图的动态分析的拟合曲线(预测值：曲线)。
[0122]
图6(1)表示使用人血清和小鼠血清的结果。在图6(1)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(小鼠血清)的浓度的经时变化。
[0123]
图6(2)表示使用人血清和大鼠血清的结果。在图6(2)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(大鼠血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(大鼠血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0124]
图6(3)表示使用人血清和狗血清的结果。在图6(3)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(狗血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(狗血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0125]
图6(4)表示使用人血清和猴血清的结果。在图6(4)中，拟合曲线a表示受体溶液中(人血清)的浓度的经时变化，拟合曲线b表示供体溶液中(猴血清)的浓度的经时变化。拟合曲线c表示受体溶液中(猴血清)的浓度的经时变化，拟合曲线d表示供体溶液中(人血清)的浓度的经时变化。
[0126]
[图7]图7是将基于本发明的方法得到的相对fu比[使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用硝苯地平的情况下，使用透析反应开始起经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻的数据，通过动态分析求出的fu比](x轴)和基于参考例的方法求出的fu比(在一个室中用小鼠、大鼠、狗、猴或人的血清，在另一个室中用缓冲液，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比)(y轴)进行比较的图。在图中，由两条实线的斜线包围的范围表示纵轴中记载的fu比与横轴中记载的fu比之间的比为0.5倍以上且2.0倍以下的范围。
[0127]
[图8]图8是将基于本发明的方法得到的相对fu比[使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用环孢素的情况下，使用透析反应开始起经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻的数据，通过动态分析求出的fu比](x轴)和基于参考例的方法求出的fu比(在一个室中用小鼠、大鼠、狗、猴或人的血清，在另一个室中用缓冲液，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比)(y轴)进行比较的图。在图中，由两条实线的斜线包围的范围表示纵轴中记载的fu比与横轴中记载的fu比之间的比为0.5倍以上且2.0倍以下的范围。
[0128]
[图9]图9是将基于本发明的方法得到的相对fu比[使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用布洛芬的情况下，使用透析反应开始起经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻的数据，通过动态分析求出的fu比](x轴)和基于参考例的方法求出的fu比(在一个室中用小鼠、大鼠、狗、猴或人的血清，在另一个室中用缓冲液，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比)(y轴)进行比较的图。在图中，由两条实线的斜线包围的范围表示纵轴中记载的fu比与横轴中记载的fu比之间的比为0.5倍以上且2.0倍以下的范围。
[0129]
[图10]图10是将基于比较例的方法求出的fu比[使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用硝苯地平的情况下，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比](x轴)和基于参考例的方法求出的fu比(在一个室中用小鼠、大鼠、狗、猴或人的血清，在另一个室中用缓冲液，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比)(y轴)进行比较的图。在图中，由两条实线的斜线包围的范围表示纵轴中记载的fu比与横轴中记载的fu比之间的比为0.5倍以上且2.0倍以下的范围。
[0130]
[图11]图11是将基于比较例的方法求出的fu比[使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用环孢素的情况下，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比](x轴)和基于参考例的方法求出的fu比(在一个室中用小鼠、大鼠、狗、猴或人的血清，在另一个室中用缓冲液，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比)(y轴)进行比较的图。在图中，由两条实线的斜线包围的范围表示纵轴中记载的fu比与横轴中记载的fu比之间的比为0.5倍以上且2.0倍以下的范围。
[0131]
[图12]图12是将基于比较例的方法求出的fu比[使用不同的生物学试样(在一个室中用人的血清，在另一个室中用小鼠、大鼠、狗或猴的血清)，作为测定对象物质使用布洛芬的情况下，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比](x轴)和基于参考例的方法求出的fu比(在一个室中用小鼠、大鼠、狗、猴或人的血清，在另一个室中用缓冲液，使用透析反应开始起经过24小时的时刻的数据，通过静态分析求出的fu比)(y轴)进行比较的图。在图中，由两条实线的斜线包围的范围表示纵轴中记载的fu比与横轴中记载的fu比之间的比为0.5倍以上且2.0倍以下的范围。
[0132]
[图13-1]图13-1是表示人稳态分布容积的观测值(纵轴：vss obs(l/kg))与使用通过实施例1、3、4、6、8～12中的本发明方法(动态分析)求出的各测定对象物质的相对fu比(大鼠/人)而基于公知的分布容积的预测方法求出的人的稳态分布容积的预测值(横轴：vss pre(l/kg))的比较的图。图中的实线的斜线表示预测值相对于观测值的误差为0.67倍以上且1.5倍以下的范围。
[0133]
[图13-2]图13-2是表示人稳态分布容积的观测值(纵轴：vss obs(l/kg))与使用比较例1、3、4、6、8～12(静态分析)中的各测定对象物质的fu比(大鼠/人)而基于公知的分布容积的预测方法求出的人的稳态分布容积的预测值(横轴：vss pre(l/kg))的比较的图。图中的实线的斜线表示预测值相对于观测值的误差为0.67倍以上且1.5倍以下的范围。
[0134]
[图13-3]图13-3是表示人稳态分布容积的观测值(纵轴：vss obs(l/kg))与使用
参考例1、3、4、6、8～12(静态分析(相对缓冲液))中的各测定对象物质的fu比(大鼠/人)而基于公知的分布容积的预测方法求出的人的稳态分布容积的预测值(横轴：vss pre(l/kg))的比较的图。图中的实线的斜线表示预测值相对于观测值的误差为0.67倍以上且1.5倍以下的范围。
[0135]
[图14-1]图14-1是表示咪达唑仑的血中浓度-时间曲线下面积上升比(aucr)的观测值(横轴：aucr obs)与使用了实施例14～20中求出的相对fu比、抑制剂实验中所使用的ki值的作为cyp3a4底物的咪达唑仑的aucr预测值(纵轴：aucr pre)的比较的图。图中的实线的斜线表示aucr的预测值与aucr的观测值之比为1的线(aucr的观测值与预测值一致的线)。
[0136]
[图14-2]图14-2是表示咪达唑仑的aucr的观测值(横轴：aucr obs)与使用了参考例14～20中求出的fu值、抑制剂实验中所使用的ki值的作为cyp3a4底物的咪达唑仑的aucr预测值(纵轴：aucr pre)的比较的图。图中的实线的斜线表示aucr的预测值与aucr的观测值之比为1的线(aucr的观测值与预测值一致的线)。
[0137]
[图14-3]图14-3是表示咪达唑仑的aucr的观测值(横轴：aucr obs)与使用了参考例21～27中求出的fu比、抑制剂实验中所使用的ki值的作为cyp3a4底物的咪达唑仑的aucr预测值(纵轴：aucr pre)的比较的图。图中的实线的斜线表示aucr的预测值与aucr的观测值之比为1的线(aucr的观测值与预测值一致的线)。
[0138]
发明的具体实施方式
[0139]
关于本说明书中的术语
[0140]
本说明书中的“测定对象物质”是待测定相对fu比的化合物，优选列举低分子化合物或肽化合物。
[0141]
本说明书中的“低分子化合物”是指除了后述的肽化合物以外，优选分子量为2000以下的化合物，例如包括天然化合物和在制造工序中包含化学合成的新化合物(new molecular entity：nme)。低分子化合物的分子量更优选为1000以下，进一步优选为800以下，特别优选为500以下。另外，低分子化合物的clogp优选为25以下，更优选为16以下，进一步优选为10以下，进一步优选为7以下，进一步优选为6以下，进一步优选为5以下，进一步优选为4以下。clogp是将化合物分成部分结构而通过计算机计算的分配系数(计算软件是公知的。例如，可以使用daylight chemical information systems、inc.公司等的软件进行计算)。
[0142]
本说明书中的“肽化合物”只要是天然氨基酸和/或非天然氨基酸通过酰胺键或酯键连接的肽化合物，则没有特别限定，期望是优选5个残基以上、更优选7个残基以上、进一步优选8个残基以上、特别优选9个残基以上，并且优选30个残基以下、更优选25个残基以下、进一步优选15个残基以下、特别优选13个残基以下的肽化合物。例如，肽化合物可以是优选5个残基以上且30个残基以下、更优选7个残基以上且25个残基以下、进一步优选8个残基以上且15个残基以下、特别优选9个残基以上且13个残基以下的肽化合物。
[0143]
本发明中能够使用的肽化合物优选一个肽中包含至少3个n取代氨基酸，更优选包含至少5个以上n取代氨基酸。这些n取代氨基酸可以在肽化合物中连续存在，也可以不连续存在。本发明中的肽化合物可以是直链状也可以是环状，优选环状肽化合物。另外，也可以具有分支结构。在具有非天然型氨基酸残基的肽化合物中，进一步优选是具有被n-甲基化
的非天然型氨基酸残基的肽化合物。
[0144]
肽化合物的分子量优选为5000以下，更优选为3000以下，进一步优选为2000以下，优选为500以上，更优选为800以上，进一步优选为1000以上。例如，肽化合物的分子量可以优选为500以上且5000以下，更优选为800以上且3000以下，进一步优选为1000以上且2000以下。
[0145]
肽化合物的clogp优选为25以下，更优选为22以下，进一步优选为20以下，进一步优选为18以下，进一步优选为16以下，进一步优选为15以下，优选为5以上，更优选为10以上，进一步优选为12以上。例如，肽化合物的clogp可以优选为5以上且25以下，更优选为10以上且20以下，进一步优选为12以上且18以下。
[0146]
本说明书中的“环状肽化合物”只要是具有由5个残基以上的氨基酸组成的环状部的肽化合物，则没有特别限定，其环化方法也没有限定，是可通过将直链肽化合物的n末端侧的基团与c末端侧的基团环化而得到的环状的肽化合物。环化可以是通过如酰胺键的碳-氮键的环化、通过如酯键和醚键的碳-氧键的环化、通过如硫醚键的碳-硫键的环化、通过碳-碳键的环化、或通过杂环构建的环化等任何形式。它们之中，优选经由酰胺键或碳-碳键等共价键的环化，更优选经由通过侧链的羧基与n末端的主链的氨基的酰胺键的环化。环化中应用的羧基和氨基等的位置可以是主链上，也可以是侧链上，只要是可环化的位置，则没有特别限制。
[0147]
本说明书中的“氨基酸”中包含天然氨基酸和非天然氨基酸(有时称为氨基酸衍生物)。本说明书中的“天然氨基酸”指gly、ala、ser、thr、val、leu、ile、phe、tyr、trp、his、glu、asp、gln、asn、cys、met、lys、arg、pro。非天然氨基酸(氨基酸衍生物)没有特别限定，示例β-氨基酸、d型氨基酸、n取代氨基酸(pro除外)、α,α-二取代氨基酸、侧链与天然氨基酸不同的氨基酸、羟基羧酸等。作为本说明书中的氨基酸，任意的空间构型是容许的。氨基酸的侧链的选择不设特别限制，除氢原子外也自由选自例如烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基、螺结合的环烷基。可以分别赋予取代基，这些取代基也没有限制，例如，可以从包含卤素原子、o原子、s原子、n原子、b原子、si原子、或p原子的任意的取代基中独立地自由选择一个或2个以上。即，示例任选被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基等、或氧代、氨基羰基、卤素原子等。在非限定的一个方式中，本说明书中的氨基酸可以是同一分子内具有羧基与氨基的化合物(即使该情形中，如脯氨酸、羟脯氨酸的亚氨基酸也包含在氨基酸中)。
[0148]
作为卤素来源的取代基，列举氟(-f)、氯(-cl)、溴(-br)、碘(-i)等。
[0149]
作为o原子来源的取代基，列举羟基(-oh)、氧基(-or)、羰基(-c＝o-r)、羧基(-co2h)、氧基羰基(-c＝o-or)、羰基氧基(-o-c＝o-r)、硫羰基(-c＝o-sr)、羰基硫基(-s-c＝o-r)、氨基羰基(-c＝o-nhr)、羰基氨基(-nh-c＝o-r)、氧基羰基氨基(-nh-c＝o-or)、磺酰基氨基(-nh-so
2-r)、氨基磺酰基(-so
2-nhr)、氨磺酰氨基(-nh-so
2-nhr)、硫代羧基(-c＝o-sh)、羧基羰基(-c＝o-co2h)等基团。
[0150]
作为氧基(-or)的实例，列举烷氧基、环烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基等。
[0151]
作为羰基(-c＝o-r)的实例，列举甲酰基(-c＝o-h)、烷基羰基、环烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、芳烷基羰基等。
[0152]
作为氧基羰基(-c＝o-or)的实例，列举烷基氧基羰基、环烷基氧基羰基、烯基氧基羰基、炔基氧基羰基、芳基氧基羰基、杂芳基氧基羰基、芳烷基氧基羰基等。
[0153]
作为羰基氧基(-o-c＝o-r)的实例，列举烷基羰基氧基、环烷基羰基氧基、烯基羰基氧基、炔基羰基氧基、芳基羰基氧基、杂芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基等。
[0154]
作为硫羰基(-c＝o-sr)的实例，列举烷基硫羰基、环烷基硫羰基、烯基硫羰基、炔基硫羰基、芳基硫羰基、杂芳基硫羰基、芳烷基硫羰基等。
[0155]
作为羰基硫基(-s-c＝o-r)的实例，列举烷基羰基硫基、环烷基羰基硫基、烯基羰基硫基、炔基羰基硫基、芳基羰基硫基、杂芳基羰基硫基、芳烷基羰基硫基等。
[0156]
作为氨基羰基(-c＝o-nhr)的实例，列举烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、炔基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、芳烷基氨基羰基等。除这些外，还列举与-c＝o-nhr中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。
[0157]
作为羰基氨基(-nh-c＝o-r)的实例，列举烷基羰基氨基、环烷基羰基氨基、烯基羰基氨基、炔基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基等。除这些外，还列举与-nh-c＝o-r中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。
[0158]
作为氧基羰基氨基(-nh-c＝o-or)的实例，列举烷氧基羰基氨基、环烷氧基羰基氨基、烯基氧基羰基氨基、炔基氧基羰基氨基、芳基氧基羰基氨基、杂芳基氧基羰基氨基、芳烷基氧基羰基氨基等。除这些外，还列举与-nh-c＝o-or中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。
[0159]
作为磺酰基氨基(-nh-so
2-r)的实例，列举烷基磺酰基氨基、环烷基磺酰基氨基、烯基磺酰基氨基、炔基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、芳烷基磺酰基氨基等。除这些外，还列举与-nh-so
2-r中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。
[0160]
作为氨基磺酰基(-so
2-nhr)的实例，列举烷基氨基磺酰基、环烷基氨基磺酰基、烯基氨基磺酰基、炔基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、杂芳基氨基磺酰基、芳烷基氨基磺酰基等。除这些外，还列举与-so
2-nhr中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。
[0161]
作为氨磺酰氨基(-nh-so
2-nhr)的实例，列举烷基氨磺酰氨基、环烷基氨磺酰氨基、烯基氨磺酰氨基、炔基氨磺酰氨基、芳基氨磺酰氨基、杂芳基氨磺酰氨基、芳烷基氨磺酰氨基等。进而，与-nh-so
2-nhr中的n原子结合的2个h原子可以被独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、和芳烷基的取代基取代，此外，这2个取代基可以形成环。
[0162]
作为s原子来源的取代基，列举硫醇(-sh)、硫基(-s-r)、亚磺酰基(-s＝o-r)、磺酰基(-s(o)
2-r)、磺基(-so3h)、五氟硫烷基(-sf5)。
[0163]
作为硫基(-s-r)的实例，选自烷基硫基、环烷基硫基、烯基硫基、炔基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基、芳烷基硫基等。
[0164]
作为亚磺酰基(-s＝o-r)的实例，列举烷基亚磺酰基、环烷基亚磺酰基、烯基亚磺酰基、炔基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、杂芳基亚磺酰基、芳烷基亚磺酰基等。
[0165]
作为磺酰基(-s(o)
2-r)的实例，列举烷基磺酰基、环烷基磺酰基、烯基磺酰基、炔
基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、芳烷基磺酰基等。
[0166]
作为n原子来源的取代基，列举叠氮(-n3，也称为“叠氮基”)、氰基(-cn)、伯氨基(-nh2)、仲氨基(-nh-r)、叔氨基(-nr(r'))、脒基(-c(＝nh)-nh2)、取代脒基(-c(＝nr)-nr'r")、胍基(-nh-c(＝nh)-nh2)、取代胍基(-nr-c(＝nr”')-nr'r")、氨基羰基氨基(-nr-co-nr'r")。
[0167]
作为仲氨基(-nh-r)的实例，列举烷基氨基、环烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、芳烷基氨基等。
[0168]
作为叔氨基(-nr(r'))的实例，例如，列举烷基(芳烷基)氨基等具有分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等的任意2个取代基的氨基，这些任意2个取代基可以形成环。
[0169]
作为取代脒基(-c(＝nr)-nr'r”)的实例，列举n原子上的3个取代基r、r'、和r”分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，例如烷基(芳烷基)(芳基)脒基等。
[0170]
作为取代胍基(-nr-c(＝nr”')-nr'r”)的实例，列举r、r'、r”、和r”'分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，或它们形成环的基团等。
[0171]
作为氨基羰基氨基(-nr-co-nr'r”)的实例，列举r、r'、和r”分别独立地选自氢原子、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，或它们形成环的基团等。
[0172]
作为b原子来源的取代基，列举硼基(-br(r'))和二氧基硼基(-b(or)(or'))等。这2个取代基r和r'分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等，或它们可以形成环。具体地，列举环状硼基，更具体地，列举频哪醇硼基(pinacholatoboryl group)、新戊二醇硼基(neopentanediolatoboryl group)、儿茶酚硼基(catecholatoboryl group)等。
[0173]
作为本说明书中的n取代氨基酸的氮原子上的取代基，具体地，示例烷基、c
1-c6烷基、c
1-c4烷基、甲基、c
7-c
14
芳烷基、苄基、苯乙基等。
[0174]
氨基酸的主链氨基可以未取代(-nh2)，也可以被取代(即，-nhr。此处，r表示任选地具有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基，此外，如脯氨酸，与n原子结合的碳链和α位的碳原子可以形成环)。这样的主链氨基被取代的氨基酸在本说明书中有时称为“n-取代氨基酸”。作为本说明书中的“n-取代氨基酸”，优选示例n-烷基氨基酸、n-c
1-c6烷基氨基酸、n-c
1-c4烷基氨基酸、n-甲基氨基酸、n-c
7-c
14
芳烷基氨基酸、n-苯乙基氨基酸，但不限于这些。
[0175]
本说明书中的“氨基酸”中包含分别对应的全部同位素。“氨基酸”的同位素是至少一个原子被原子编号(质子数)相同、质量数(质子和中子数的和)不同的原子取代的那种。作为本说明书的“氨基酸”中包含的同位素的实例，有氢原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，分别地，包含2h、3h、
13
c、
14
c、
15
n、
17
o、
18
o、
32
p、
35
s、
18
f、
36
cl等。
[0176]
本发明中所使用的“生物学试样”是指来自生物的生物体试样，优选是指来自哺乳动物的生物体试样。作为哺乳动物，优选列举小鼠、大鼠、兔、狗、猴或人。作为生物体试样，例如，优选列举体液、组织、细胞或其部分，更优选列举选自由微粒体级分、血液、血浆和血清组成的组中的生物体试样。
[0177]
在本发明中，“不同的生物学试样”是指2个以上不同的生物学试样。作为不同的生
物学试样，可以使用来自异种生物之间(例如，小鼠和人、大鼠和人等)或同种生物之间(例如，人和人)的生物体试样。进而，不同的生物学试样包括来自异种生物的相同的生物体部位或不同的生物体部位的生物体试样、以及来自同种生物的相同的生物体部位或不同的生物体部位的生物体试样。例如，本发明中的不同的生物学试样包括来自同种或异种哺乳动物的微粒体级分对微粒体(microsome)级分、血液对血液、血浆对血浆、血清对血清等同一种类的生物体试样部位，另外，包括例如血液对血浆、微粒体级分对血浆、血浆对血清等不同的生物体试样部位。即使不同的生物体试样来自同种生物之间的相同生物体部位，在来自不同个体的情况下，也可以包含在本发明的不同的生物学试样中。
[0178]
在本说明书中，“蛋白结合率”是指在总量的测定对象物质中与生物学试样中的蛋白(例如，白蛋白等“非特异性蛋白”)结合的测定对象物质的比例(质量比或摩尔比或其百分比)。即，蛋白结合率＝1-未结合型分数(fu)。在本发明中，可以使用蛋白结合率优选为95％以上、更优选为97％以上、进一步优选为98％以上、最优选为99％以上的测定对象物质。
[0179]
在本说明书中，“未结合型分数(fu)”是指在蛋白(例如，白蛋白)的存在下，总量的测定对象物质中未与生物学试样中的蛋白结合的测定对象物质(本说明书中，有时称为“未结合型测定对象物质”)的比例。即，未结合型分数(fu)＝1-蛋白结合率。“相对未结合型分数比(相对fu比)”是指不同的生物学试样各自中的测定对象物质的未结合型分数之比。例如，作为相对fu比，列举生物学试样(a)中的测定对象物质的fu值(fu1)与不同于生物学试样(a)的生物学试样(b)中的测定对象物质的fu值(fu2)之比(fu1/fu2)。
[0180]
在本发明的方法中，“半透膜”将“室”内划分为2个以上。“半透膜”是所选择的分子种类能够通过扩散而穿过的膜。作为用于平衡透析的半透膜，选择能够使测定对象物质(存在时，与缓冲液等溶剂)穿过，但无法使生物学试样穿过的半透膜。优选地，半透膜是尺寸选择性膜，例如，半透膜可以通过分级分子量(截留分子量：mwco)来表征。该情形中，半透膜的mwco优选为50kda以下，更优选为14kda以下，进一步优选为8kda以下，优选为3.5kda以上，更优选为4kda以上，进一步优选为6kda以上。例如，半透膜的mwco优选为3.5kda以上且50kda以下，更优选为4kda以上且14kda以下，进一步优选为6kda以上且8kda以下。作为可用于本发明方法的半透膜，可以使用公知的半透膜，例如，可以使用由再生纤维素组成的半透膜(rapid equilibrium dialysis(red)device inserts，8kmwco，thermo fisher scientific公司制)等。
[0181]
作为室，可以使用公知的平衡透析法中所使用的室。例如，作为室，可以使用特氟龙制或聚丙烯制的材料的室。
[0182]
在本说明书中，“供体侧”、“供体”或“donor”是指在测定初期时刻添加含有测定对象物质的供体溶液的一侧，例如“供体侧室”或“供体室”是指在测定初期时刻添加含有测定对象物质的供体溶液的室。“受体侧”、“受体”或“acceptor”是指在测定初期时刻添加不含测定对象物质的受体溶液的一侧，例如“受体侧室”或“受体室”是指在测定初期时刻添加不含测定对象物质的受体溶液的室。
[0183]
在本说明书中，“供体溶液”是指向供体侧室(或供体室)添加的溶液以及随后存在于供体侧室(或供体室)中的溶液。另外，“受体溶液”是指向受体侧室(或受体室)添加的溶液以及随后存在于受体侧室(或受体室)中的溶液。
[0184]
在本说明书中，“初期”是指向各室中添加供体溶液和受体溶液，测定对像物质开始在各溶液之间移动的时期。例如，可以将向室内首次添加供体溶液和受体溶液并立即开始搅拌的时刻作为“初期”。但是，测定对象物质具有吸附在室壁面等的性质时，难以测定初期的测定对象物质在供体溶液中的准确浓度，因此优选通过对向室添加前夕的供体溶液进行采样并测定浓度，从而作为初期(即0时刻)的供体溶液中的测定对象物质的浓度，用于分析。
[0185]
在本说明书中，“平衡状态”是指在向被半透膜隔开的室中添加的各溶液之间，测定对象物质的浓度的变化达到稳态而实质上浓度变化消失了的状态。
[0186]
在本发明中，“经时测定”是指随着时间的经过进行测定，其包括时间上连续地进行测定的情况、非连续地每一定时间或每主要时间进行多次测定的情况。
[0187]
在本说明书中，“动态分析”是指如下分析方法，即，通过经时测定室的溶液中的测定对象物质的浓度等，使用分析软件等对测定值实施收敛计算(拟合)等，从而计算fu比(fu值)。与此相对，“静态分析”是指如下分析方法，即，使用仅在特定时刻的室的溶液中的测定对象物质的浓度等的实测值或实测值的比，计算fu比(fu值)。另外，特定时刻优选为结束平衡透析反应的操作的时刻，进一步优选为达到平衡状态后结束平衡透析反应的时刻。
[0188]
不同生物学试样之间的测定对象物质的相对fu比的测定方法(a)
[0189]
本发明的用于求出不同生物学试样之间的测定对象物质的相对未结合型分数比(相对fu比)的方法，包括以下工序(1)至(5)。
[0190]
(1)准备相邻室彼此被测定对象物质能够透过的半透膜隔开的室系统(i)的工序；
[0191]
(2)在所述室系统(i)内，在一个室(供体侧室)中添加含有第一生物学试样(a)及所述测定对象物质的供体溶液的工序(例如，图1a和图1f)；
[0192]
(3)在所述室系统(i)内，在与所述供体侧室不同的室(受体侧室)中添加含有第二生物学试样(b)的受体溶液的工序(例如，图1b和图1e)；
[0193]
(4)经时测定所述工序(2)的供体溶液和所述工序(3)的受体溶液中的所述测定对象物质的浓度的工序(例如，图1c至图1d和图1g至图1h)；以及
[0194]
(5)使用与在所述工序(4)中测定的测定对象物质的浓度相关的数据，计算相对fu比的工序。
[0195]
在本发明的方法中，进行所述工序(2)和工序(3)的顺序没有特别限定，例如，工序(3)可以在工序(2)之后实施，工序(2)可以在工序(3)之后实施，或者工序(2)和工序(3)可以同时或并行地实施(例如，图1a至图1b和图1e至图1f)。
[0196]
以下，参照图1对本发明的一例进行说明。在图中，室系统具备由膜m隔开的相邻的2个室(供体侧室、受体侧室)。尺寸选择性膜m将2个室隔开，使测定对象物质透过，但不会使来自第一生物学试样(a)的非特异性蛋白和来自第二生物学试样(b)的非特异性蛋白透过。
[0197]
图1(图1a至图1d，图1e至图1h)表示分析期间的透析室系统i。图1a表示将包含含有非特异性蛋白4的第一生物学试样(a)和测定对象物质3的供体溶液向供体侧室1添加(黑箭头)时的状态，其中测定对象物质3和非特异性蛋白4存在于供体侧室1的供体溶液中。图1b表示将包含含有非特异性蛋白5的第二生物学试样(b)的受体溶液向受体侧室2添加(黑箭头)时的状态，其中非特异性蛋白5存在于受体侧室2的受体溶液中。图1c表示测定对象物质开始从供体侧室1向受体侧室2移动的初期阶段的状况。图1d表示测定对象物质从供体侧
室1向受体侧室2移动，或者进一步从受体侧室2向供体侧室1反向移动，从而趋于平衡进行透析的阶段的状况。从初期阶段开始，经时地多次测定向各室中添加的溶液中的测定对象物质的浓度。
[0198]
图1e至1h表示将图1a和图1b的操作顺序更换后的状况的示意图的一例。
[0199]
在向供体侧室1添加的测定对象物质3中，只有非特异性蛋白4或未结合在室壁的测定对象物质通过半透膜。通过半透膜的测定对象物质的一部分与受体侧室2中的非特异性蛋白5结合。溶液中的测定对象物质的浓度在两个室之间趋于平衡，但由于测定对象物质对各个非特异性蛋白的结合特性不同，因此对各个非特异性蛋白的结合特性会影响所有测定对象物质的分布。
[0200]
在本发明的方法中，向室中添加的生物学试样和测定对象物质可以被溶剂稀释。作为溶剂，只要是对生物学试样和测定对象物质的特性没有实质性的影响，溶解生物学试样或测定对象物质，或者相互良好混合的溶剂，则没有特别限定。作为这样的溶剂，例如可以优选使用缓冲液。作为缓冲液，例如，列举磷酸系缓冲液、tris缓冲液
·
hepes缓冲液等good's缓冲液、醋酸系缓冲液、柠檬酸系缓冲液、柠檬酸磷酸系缓冲液、硼酸系缓冲液、酒石酸系缓冲液、碳酸系缓冲液、邻苯二甲酸系缓冲液、草酸系缓冲液等。
[0201]
缓冲液的渗透压期望优选为生理盐水的0.5倍以上，更优选为0.9倍以上，优选为生理盐水的2倍以下，更优选为1.1倍以下。例如，缓冲液的渗透压可以设在优选生理盐水的0.5倍以上且2倍以下、进一步优选0.9倍以上且1.1倍以下的范围。作为缓冲液的ph，期望优选为6以上，更优选为7.0以上，优选为8以下，进一步优选为7.8以下。例如，缓冲液的ph可以优选为6以上且8以下，进一步优选为7.0以上且7.8以下。
[0202]
进而，对于测定对象物质，为了提高其溶解性，可以预先溶解在二甲基亚砜(dmso)、乙醇等溶剂中，与生物学试样一起混合于缓冲液中。
[0203]
在本发明的方法中，作为生物学试样，可以优选使用微粒体级分、血液、血浆和血清，在这些中，可以更优选使用血浆或血清，可以进一步优选使用血清。在使用血清作为生物学试样时，能够减轻测定对象物质对装置等的吸附，并且达到测定对象物质的高回收率而能够抑制测定对象物质的浓度降低。
[0204]
进而，在本发明的方法中，在将生物学试样利用缓冲液等稀释而使用时，更优选使用稀释后的血清。通过使用稀释血清，能够在动态分析中的浓度测定中容易捕捉初期浓度变化。由此，对于在透析中难以得到稳态的高蛋白结合率化合物，在测定相对fu比时，能够实现进一步的精度提高和时间缩短。
[0205]
在本发明中，生物学试样在供体溶液或受体溶液中的初期浓度没有特别限定，例如期望在优选1％以上且50％以下、更优选1％以上且30％以下、进一步优选1％以上且10％以下左右的范围(溶液中的体积比)。
[0206]
在本发明中，测定对象物质在供体溶液或受体溶液中的初期浓度没有特别限定，例如期望在优选0.1(μmol/l)以上且10(μmol/l)以下、更优选0.1(μmol/l)以上且1(μmol/l)以下、更优选0.1(μmol/l)以上且0.5(μmol/l)以下的范围。
[0207]
将供体溶液和受体溶液向室内添加之后，在室中，添加的试样和物质可以通过搅拌扩散，也可以自由扩散。优选地，可以边搅拌室内的溶液，边实施透析。搅拌能够以优选20rpm以上且800rpm以下、更优选250rpm以上且800rpm以下的转速实施。
[0208]
透析反应中室内的溶液等的温度只要是不对生物学试样和测定对象物质的特性产生不良影响的范围，则没有特别限定，例如在优选0℃以上且40℃以下的范围、更优选20℃以上且40℃以下、进一步优选35℃以上且40℃以下的范围即可。
[0209]
在本发明中，上述平衡透析可以使用公知的装置实施。例如，可以使用快速平衡透析装置等实施。
[0210]
在本发明中，经时测定供体溶液和受体溶液中的测定对象物质的浓度。浓度的测定可以连续地实施或每一定时间或每主要时间实施。在每一定时间的测定中，例如可以将各个室内的溶液分注作为样品，通过公知的方法进行测定。例如，上述得到的样品中的测定对象物质的浓度的测定可以使用液相色谱质谱法(lc-ms/ms)、使用uv检测器的液相色谱等方法实施。
[0211]
在本发明中，经时测定中的测定期间依赖于所使用的生物学试样和测定对象物质，没有特别限定，例如可以在从初期到优选72小时、更优选36小时、进一步优选24小时左右的期间进行适当的测定。每一定时间或每主要时间进行测定时，其次数例如优选为20次以内，更优选为10次以内，进一步优选为5次以内。在这样的时间范围，通过经时地进行浓度测定而进行动态分析，即使未达到平衡状态，也能够精度良好地求出相对fu比。
[0212]
在本发明中，可以使用测定的供体溶液和受体溶液中的测定对象物质的浓度的经时数据，计算相对fu比。相对fu比可以使用公知的进行动态分析的软件实施。作为这样的动态分析软件，例如可以使用simbiology/matlab r2019b(the math works,inc.社製)、microsoft excel2019(microsoft corporation公司制)等。
[0213]
以下，对本发明的动态分析方法进行说明。本发明是直接检测不同生物学试样之间的测定对象物质的相对蛋白未结合型分数比(相对fu比)的新分析技术，通过实施(i)不同生物学试样之间的利用快速平衡透析的测定对象物质的浓度推移评价、(ii)动态(动力学)分析，设定用于检测高蛋白结合率化合物的相对fu比的最佳条件。
[0214]
在本发明的动态分析中，将通过平衡透析得到的各溶液中的测定对象物质浓度的测定值(例如，0.5小时值、1小时值、2小时值、4小时值、16小时值、24小时值)及固有参数应用于下述式1(供体溶液中的测定对象物质量的变化)、下述式2(受体溶液中的测定对象物质量的变化)及下述式3(供体侧室中的吸附级分的测定对象物质的每单位时间的量的变化)，进行收敛计算(拟合)，从而求出fu1及fu2的最佳解，将得到的fu1/fu2之比设为相对fu比。
[0215]
此外，对于示出吸附于装置的测定对象物质，在(ii)动态分析中，在质量平衡式将吸附清除率设定为参数，通过基于机理的模型，提高拟合精度。另外，测定对象物质为高蛋白结合率化合物(即，表示低值的fu值的化合物)时，通过分析得到的fu值的准确性经常被视为问题，但在本发明中，根据需要，通过实施在测定方法(a)组合下述测定方法(b)的(iii)双向性评价，即，通过比较利用上述方法求出的相对fu比与在更换向供体溶液和受体溶液中加入的生物学试样后利用同样的方法求出的相对fu比，可以进行数值验证，可以进一步提高得到的相对fu比的精度。进而，根据需要，通过使用(iv)稀释血清，可以改良初期浓度变化的检测条件，可以进一步提高得到的相对fu比的精度。
[0216]
具体地，使用进行动态分析的上述软件，可以对通过下述方法得到的浓度推移进行数据输入，利用下述条件及非线性最小二乘法(lsqnonlin)计算各参数及fu比。
[0217]
(式1)：
[0218][0219]
(式2)：
[0220]
(式3)：
[0221][0222]
式1表示供体溶液中的测定对象物质量的变化(每单位时间的量的变化)。即，式1表示包括测定对象物质从受体侧向供体侧的反向移动(fu2*c2*ps)、测定对象物质从供体侧向受体侧的移动(fu1*c1*ps)、以及向供体侧的装置壁的吸附
·
背离影响(测定对象物质向装置壁吸附(fu1*c1*clad)及吸附的测定对象物质从装置壁背离(koff*xad))的供体侧的测定对像物质量的变化。
[0223]
式2表示受体溶液中的测定对象物质量的变化(每单位时间的量的变化)。即，式2表示包括测定对象物质从受体侧向供体侧的反向移动(fu2*c2*ps)、测定对象物质从供体侧向受体侧的移动(fu1*c1*ps)的受体侧的测定对象物质量的变化(不包括吸附影响)。
[0224]
式3表示供体侧室中的吸附级分的测定对象物质的每单位时间的量的变化(测定对象物质向装置壁的每单位时间的吸附
·
背离)。即，表示包括测定对象物质向供体侧装置壁吸附(fu1*c1*clad)及吸附的测定对象物质从装置壁背离(koff*xad))的、供体侧的测定对像物质的吸附量变化。
[0225]
在这些式中，应用经时测定的溶液中的测定对象物质的浓度(实测值)及固有参数，进行收敛计算(拟合)(与向装置壁的吸附
·
背离有关的参数(clad、koff、xad)通过收敛计算根据浓度由计算机计算并编入)，可以得到相对fu比(fu1/fu2)。
[0226]
此处，各参数分别表示以下。
[0227]
v1：供体溶液的容积(固定值，3.5
×
10-4
l)
[0228]
v2：受体溶液的容积(固定值，2.0
×
10-4
l)
[0229]
fu1：测定对象物质相对于供体溶液中所含有的生物学试样的fu值(计算值)
[0230]
fu2：测定对象物质相对于受体溶液中所含有的生物学试样的fu值(计算值)
[0231]
c1：供体溶液中的测定对象物质的浓度(总浓度：结合型测定对象物质及未结合型测定对象物质的合计。但是，吸附在平衡透析装置的测定对象物质除外)。(测定值，nmol/l)
[0232]
c2：受体溶液中的测定对象物质的浓度(总浓度：结合型及未结合型测定对象物质的合计)。(测定值，nmol/l)
[0233]
ps：测定对象物质的透析膜透过清除率(固定值，1.0
×
10-4
l/h或1.0
×
10-5
l/h)
[0234]
clad：供体侧室中的测定对象物质的吸附清除率(变动值，l/h)
[0235]
koff：供体侧室中的测定对象物质的解离速度常数(变动值，h-1
)
[0236]
xad：供体侧室中的测定对象物质的吸附量(变动值，nmol)
[0237]
各符号中记载的数字“1”表示供体侧，“2”表示受体侧。
[0238]
此外，在本技术实施例中所使用的平衡透析装置中，由于供体侧的壁表面积与受
体侧相比非常大，因此考虑仅在c1中吸附在平衡透析装置的测定对象物质，对于clad、koff及xad也考虑供体侧室中的测定对象物质，但是在使用供体侧的壁表面积和受体侧的壁表面积在某种程度上接近的平衡透析装置的情况下，也可以将受体侧室中的吸附级分的测定对象物质的每单位时间的量的变化作为下述式3’追加立式而进行动态分析。
[0239]
(式3’)：
[0240][0241]
clad’：受体侧室中的测定对象物质的吸附清除率(变动值，l/h)
[0242]
koff’：受体侧室中的测定对象物质的解离速度常数(变动值，h-1
)
[0243]
xad’：受体侧室中的测定对象物质的吸附量(变动值，nmol)
[0244]
该情形中，式2变更为以下的式2’来使用。
[0245]
(式2’)：
[0246][0247]
另外，除了上述的分析方法以外，也可以在将ps不固定为特定值的情况下，将(fu1*ps)和(fu2*ps)分别作为一块的变动参数进行收敛计算(拟合)，以(fu1*ps)与(fu2*ps)之比得到相对fu比(fu1/fu2)。
[0248]
在收敛计算(拟合)中，可以将供体溶液和受体溶液中所含有的生物学试样更换的测定结果作为一组来计算相对fu比。fit data(simbiology model analyzer,program)的默认设定可以适当变更，例如，可以记载下述条件(model、reaction、rules、definition、estimated parameters)并实施。实施分析时的模型如图3所示。
[0249]
reaction:
[0250]
eq1.donor1《-》eq1.acceptor1:+fu1*ps*eq1.donor1/vd1-fu2*ps*eq1.acceptor1/vd2
[0251]
eq1.donor1-》eq1.ad:+cl1*fu1*eq1.donor1/vd1-(koff1*eq1.ad)
[0252]
eq2.donor2《-》eq2.acceptor2:+fu2*ps*eq2.donor2/vd1-fu1*ps*eq2.acceptor2/vd2
[0253]
eq2.donor2-》eq2.ad:+cl2*fu2*eq2.donor2/vd1-(koff2*eq2.ad)
[0254]
rules:
[0255]
rule_1eq1.ca1＝eq1.acceptor1/vd2 repeatedassignment
[0256]
rule_2eq1.cd1＝eq1.donor1/vd1 repeatedassignment
[0257]
rule_3eq2.ca2＝eq2.acceptor2/vd2 repeatedassignment
[0258]
rule_4eq2.cd2＝eq2.donor2/vd1 repeatedassignment
[0259]
rule_5eq1.donor1＝dose1 initialassignment
[0260]
rule_6eq2.donor2＝dose2 initialassignment
[0261]
definition：
[0262]
在第一个生物学试样是小鼠、第二个生物学试样是人的情况下，将以下4个数据作为一组用于分析。
[0263]
数据1(eq1.ca1)：供体溶液中含有小鼠血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析
体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0264]
数据2(eq1.cd1)：供体溶液中含有小鼠血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0265]
数据3(eq2.ca2)：供体溶液中含有人血清、受体溶液中含有小鼠血清的平衡透析体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0266]
数据4(eq2.cd2)：供体溶液中含有人血清、受体溶液中含有小鼠血清的平衡透析体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0267]
estimated parameters:
[0268]
exp(fu1),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 100]；
[0269]
exp(fu2),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 100]；
[0270]
exp(koff1),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 1000000]；
[0271]
exp(koff2),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 1000000]；
[0272]
exp(cl1),initialvalue＝0.001,bounds＝[1e-07 0.1]；
[0273]
exp(cl2),initialvalue＝0.001,bounds＝[1e-07 0.1]；
[0274]
exp(dose1),initialvalue＝0.2115,bounds＝[0.1 0.4或0.5]；
[0275]
exp(dose2),initialvalue＝0.2114,bounds＝[0.1 0.4或0.5]；
[0276]
pooled fit,true
[0277]
不同生物学试样之间的测定对象物质的相对fu比的测定方法(b)
[0278]
本发明的用于求出不同生物学试样之间的测定对象物质的相对未结合型分数比(相对fu比)的方法，可以在包括所述工序(1)至(5)的测定方法(a)中，进一步包括将生物学试样(a)与生物学试样(b)更换的方法。即，本发明的用于求出不同生物学试样之间的测定对象物质的相对未结合型分数比(相对fu比)的方法，还可以包括以下工序(6)至(10)。
[0279]
(6)准备相邻室彼此被使测定对象物质透过的半透膜隔开的、与所述室系统(i)不同的室系统(ii)的工序；
[0280]
(7)在所述室系统(ii)内，在一个室(受体侧室)中添加含有所述生物学试样(a)的受体溶液的工序(例如，图2a和图2f)；
[0281]
(8)在所述室系统(ii)内，在与所述受体侧室不同的室(供体侧室)中添加含有所述生物学试样(b)及所述测定对象物质的供体溶液的工序(例如，图2b和图2e)；
[0282]
(9)经时测定所述工序(7)的受体溶液和所述工序(8)的供体溶液中的所述测定对象物质的浓度的工序(例如，图2c至图2d和图2g至图2h)；以及
[0283]
(10)使用与在所述工序(9)中测定的测定对象物质的浓度相关的数据，计算相对fu比的工序。
[0284]
在所述方法中，进行工序(7)和工序(8)的顺序没有特别限定，例如，工序(8)可以在工序(7)之后实施，工序(7)可以在工序(8)之后实施，或者工序(7)和工序(8)可以同时或并行地实施(例如，图2a至图2b和图2e至图2f)。
[0285]
以下，参照图对本发明的一例进行说明。图2(图2a至图2d，图2e至图2h)表示分析期间的透析室ii。图2a表示将包含含有非特异性蛋白4的第一生物学试样(a)的受体溶液向受体侧室20添加(黑箭头)时的状态，其中非特异性蛋白4存在于受体侧室20的受体溶液中。图2b表示将包含含有非特异性蛋白5的第二生物学试样(b)和测定对象物质3的供体溶液向
供体侧室10添加(黑箭头)时的状态，其中测定对象物质3和非特异性蛋白5存在于供体侧室10的供体溶液中。图2c表示测定对象物质开始从供体侧室10向受体侧室20移动的初期阶段的状况。图2d表示测定对象物质从供体侧室10向受体侧室20移动，或者进一步从受体侧室20向供体侧室10反向移动，从而趋于平衡进行透析的阶段的状况。从初期阶段开始经时测定向各室中添加的溶液中的测定对象物质的浓度。
[0286]
图2e至2h表示将图2a和图2b的操作顺序更换后的状况的示意图的一例。
[0287]
各工序(6)至(10)可以通过与上述工序(1)至(5)同样的方法实施。即，经过工序(6)至(8)，使用在工序(9)中测定的供体溶液和受体溶液中的测定对象物质的浓度的经时数据，可以计算相对fu比(工序(10))。
[0288]
在本发明中，可以将向工序(1)至(4)的2个室添加的溶液中的各个经时的测定对象物质的浓度变化一次导入到编入了规定参数的动态分析软件中的计算式进行拟合处理，求出种差间的相对fu比。另外，可以将向工序(6)至(9)的2个室添加的溶液中的各个经时的测定对象物质的浓度变化一次导入到编入了规定参数的动态分析软件中的计算式进行拟合处理，求出种类差异间的相对fu比。通过这样的工序(1)至(5)得到的相对fu比(以下有时称为“相对fu比(a)”)及通过工序(6)至(10)得到的相对fu比(以下有时称为“相对fu比(b)”)由于使用相同的生物学试样和测定对象物质，因此理论上具有相同的值。
[0289]
因此，通过比较利用工序(1)至(5)以及工序(6)至(10)分别独立得到的相对fu比(以下，有时分别称为“相对fu比(a)”、“相对fu比(b)”)，可以验证各个相对fu值的数值。例如，相对fu比(a)/相对fu比(b)优选为0.8以上且1.2以下、更优选为0.9以上且1.1以下时，可以评价为各自的相对fu比的精度高。
[0290]
进而，可以将向工序(1)至(4)以及工序(6)至(9)的4个室添加的溶液中的各个经时的测定对象物质的浓度变化、即在工序(4)及工序(9)中测定的与测定对象物质的浓度相关的数据一次导入到编入了规定参数的动态分析软件中的计算式进行拟合处理，求出种类差异间的相对fu比。通过这样的方法，可以进一步提高种差间的相对fu比的精度。如实施例所述，通过本发明的方法求出的相对fu值与通过参考例的方法求出的fu值(绝对值)的比也良好地匹配。
[0291]
根据本发明，例如，与从一种生物学试样计算fu值(绝对值)的方法相比，能够同时评价多种、例如2至5种生物学试样之间的相对fu比，因此能够容易进行得到的相对fu比的种间比较。例如，在求出2个生物学试样之间的相对fu比时，准备由平衡透析膜隔开的2个室，在两个室中分别添加含有作为对象的生物学试样的溶液进行测定即可。另外，在同时评价3个以上生物学试样之间的相对fu值比时，可以只准备生物学试样的种类的数量的室，将它们用测定对象物质能够透过的平衡透析膜隔开而使测定对象物质能够自由地扩散，在各室中分别添加含有作为对象的生物学试样的溶液进行测定，也可以准备由平衡透析膜隔开的2个室，在两室中分别添加含有1个以上生物学试样的溶液进行测定。
[0292]
另外，在本发明中，由于得到作为相对于2个以上生物学试样的相对fu比的值，因此与分别得到容易产生误差的小数值的fu值的方法相比，能够使误差最小化，能够进行精度更高的fu比的种间比较。进而，通过设定作为基准的生物学试样，例如基准血清，能够容易进行之后的每个实验的妥当性验证。
[0293]
进而，在本发明中，通过采用动态分析，不仅可以在短时间测定相对fu比，而且由
此能够将生物学试样的经时劣化(ph的经时变化、溶液量的变动等)的影响抑制到最小限度，还可以测定更准确的相对fu比。进而，即使在溶液中的测定对象物质的浓度难以达到平衡状态时，通过使用动态分析，也能够在未达到平衡状态的状态下得到与达到平衡状态后测定的fu比显示良好相关的相对fu比，因此在测定对象物质的蛋白结合率高的情况等特别有效。
[0294]
通过动态分析从一种生物学试样提供fu值时，利用fu已知化合物组中的pmem平均值，但在本发明中，具有关于半透膜透过速度(pmem[m/s])，即使不得到实验上的数值也能够实施分析的特征。例如，即使在环孢素(分子量：1202.61)等化合物分子量大的情况下，通过将pmem设定为分析上任意的固有值，也能够取得相对fu比。
[0295]
药物清除率及分布容积的预测方法
[0296]
本发明涉及的预测药物清除率的方法，包括使用所述相对fu比和一种生物学试样来源的种中的药物清除率的数据，预测其他生物学试样来源的种中的药物清除率的方法。
[0297]“清除率”(cl)定义为药物的消失速度(v)除以此时刻的浓度(c)的值(cl＝v/c)，表示为每单位时间可除去药物的容积(ml/min)。
[0298]
作为使用通过本发明的方法得到的fu比而预测清除率的方法，可以使用公知的方法。例如，在公知的人清除率推定法(fcim:fu-corrected intercept method(非专利文献6:tang,h.and m.mayersohn(2005)."anovel model for prediction of human drug clearance by allometric scaling."drug metab dispos33(9):1297-1303.))中应用药物的fu比和实测的清除率数据(例如，小鼠、大鼠、狗或猴等)，可以预测人清除率。
[0299]
fcim法的预测方法如下所述。
[0300]
·
将多种动物的清除率应用到以下所示的sa(simple allometry)式中，使a和b最佳化；
[0301]
cl＝a(体重)b[0302]
(a：比例因子，b：比例指数)
[0303]
·
根据上述得到的a和rfu(相对fu比(大鼠/人))，通过以下式计算预测人清除率；
[0304]
cl
人
＝33.35x(a/rfu)
0.77
[0305]
本发明涉及的预测药物分布容积的方法，包括使用所述相对fu比和一种生物学试样来源的种中的药物分布容积数据，预测其他生物学试样来源的种中的药物分布容积的方法。
[0306]“分布容积”(v)是指以与血液或血浆中相同的浓度，在体内含有施用药物总量所需的理论上的液体量，分布容积＝体内药物量/血中浓度(例如l)。
[0307]
作为使用通过上述方法得到的fu比而预测分布容积的方法，可以根据需要改变使用公知的方法。例如，在公知的分布容积种差推定法(非专利文献7:berry,l.m.,et al.(2011)."species differences in distribution and prediction of human v(ss)from preclinical data."drug metab dispos 39(11):2103-2116.)中应用药物的fu比和实测的稳态分布容积(例如，小鼠、大鼠、狗或猴等)，可以预测期望的分布容积(例如人)。
[0308]
预测分布容积的方法例如列举用以下的fu修正后的分布容积的推定方法(非专利文献7)。
[0309]
稳态分布容积(vss,[l])
[0310]
用fu修正后的稳态分布容积(vss u,[l]＝vss/fu,[l])
[0311]
sa(simple allometry)：vss u＝a(体重)b[0312]
(a：比例因子，b：比例指数)
[0313]
此处，将作为参考的动物物种的fu设为fu,ref，将相对于作为参考的动物物种的fu比设为rfu(＝fu/fu,ref)时，上述sa的式可以变形为以下的式。
[0314]
vss/rfu＝fu,ref x a(体重)b[0315]
通过使用多个动物物种的实测的vss和rfu，对fu,ref x a和b进行最佳化，可以预测任意种类的vss/rfu，使用rfu可以预测vss。在这种经改变的预测方法中，fu的绝对值在任何种类中也不需要实测。
[0316]
本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考引入本说明书中。
实施例
[0317]
以下，将本发明的优选的具体实施方式作为实施例进行说明，但本发明并不限于这些。
[0318]
[实施例1]
[0319]
通过动态分析取得种差间的相对fu比(测定对象物质：硝苯地平)
[0320]
[供体(donor)溶液的制备]
[0321]
首先，将硝苯地平作为测定对象物质，制备10mmol/l溶液和1mmol/l溶液。具体地，对于粉末硝苯地平1.67mg，加入二甲基亚砜(dmso)0.482ml，制成硝苯地平10mmol/l溶液。接着，对于20μl的硝苯地平10mmol/l溶液，加入dmso 180μl，制成硝苯地平1mmol/l溶液。
[0322]
接着，使各种血清(小鼠血清、大鼠血清、狗血清、猴血清、人血清)溶解。采集经溶解的各种血清，分别加入9倍量的磷酸缓冲生理盐水和1/1000倍量的硝苯地平1mmol/l溶液，制备血清浓度10％(体积比)、硝苯地平浓度1μmol/l、dmso浓度0.1％(体积比)的供体溶液。具体使用的各试样的量如下述表1所示。
[0323]
此外，使用的各试样如下所述。
[0324]
硝苯地平：“硝苯地平”，富士胶片和光纯药(株)公司制，分子量：346.335，clogp:3.12
[0325]
dmso：“culturesure(注册商标)dmso”，富士胶片和光纯药(株)公司制
[0326]
小鼠血清：“小鼠(cd-1(icr)血清”，valley biomedical公司制
[0327]
大鼠血清：“大鼠(sd(crl:cd))血清”，valley biomedical公司制
[0328]
狗血清：“beagle混合血清”，japan slc公司制
[0329]
猴血清：“猴(cynomolgus)血清”，valley biomedical公司制
[0330]
人血清：“human true a serum,pool of donors”，biopredic international公司制
[0331]
磷酸缓冲生理盐水(pbs)：“dulbecco's磷酸缓冲生理盐水(不含ca、mg)”，nacalai tesque公司制
[0332]
[表1]
[0333][0334]
[受体(acceptor)溶液的制备]
[0335]
除了加入dmso溶液代替硝苯地平1mmol/l溶液以外，按照与供体溶液同样的步骤制备血清浓度10％(体积比)、dmso浓度0.1％(体积比)的受体溶液。
[0336]
[透析反应]
[0337]
首先，准备快速平衡透析装置(“red(rapid equilibrium dialysis：快速平衡透析)装置”、透析膜mwco:8kda、thermo fisher scientificc公司制)，向各白室中分别分注特定的供体溶液350μl，向各红室中分别分注特定的受体溶液200μl。向各室中分注的供体溶液或受体溶液如下述表2所示。
[0338]
在表2中，表2-1是使用人和小鼠的血清的情况。表示对于将人血清设为供体侧并将小鼠血清设为受体侧的情况(试验a至c；相同条件)、以及将小鼠血清设为供体侧并将人血清设为受体侧的情况(试验d至f：相同条件)合计6种，分别在0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻实施测定的情形。表2-2是使用人和大鼠的血清的情况，表2-3是使用人和狗的血清的情况，表2-4是使用人和猴的血清的情况，分别表示对于与上述人和小鼠的组合的情况相同的6种模式，分别在0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻实施测定的情形。
[0339]
接着，用铝密封件(“3m(注册商标)微板密封带”、sured器件上部密封，3m日本有限公司制)密闭red装置上部，用振荡器(“mb100-4athermo-shaker”、hangzhou allsheng instruments co.,ltd.公司制)开始透析反应(设定值：搅拌速度rotation 800rpm，37℃)。
[0340]
(表2)使用人/小鼠、大鼠、狗、猴的血清的室型
[0341]
(表2-1)人/小鼠
[0342][0343]
(表2-2)人/大鼠
[0344][0345]
(表2-3)人/狗
[0346][0347]
(表2-4)人/猴
[0348][0349]
[透析反应后的采样]
[0350]
在透析反应开始时起经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻，从分注了供体溶液及受体溶液的各室中分别采集20μl溶液，与180μl的猝灭(quench)溶液1(甲醇/
90μl，制成硝苯地平100μmol/l溶液，基于硝苯地平100μmol/l溶液，制备下述(1)-(8)的稀释系列和空白溶液。
[0370]
[(1)对于硝苯地平100μmol/l溶液24μl，加入dmso 376μl，制成硝苯地平6000nmol/l溶液。
[0371]
(2)对于硝苯地平6000nmol/l溶液120μl，加入dmso 240μl，制成硝苯地平2000nmol/l溶液。
[0372]
(3)对于硝苯地平2000μmol/l溶液120μl，加入dmso 280μl，制成硝苯地平600nmol/l溶液。
[0373]
(4)对于硝苯地平600nmol/l溶液120μl，加入dmso 240μl，制成硝苯地平200nmol/l溶液。
[0374]
(5)对于硝苯地平200nmol/l溶液120μl，加入dmso 280μl，制成硝苯地平60nmol/l溶液。
[0375]
(6)对于硝苯地平60nmol/l溶液120μl，加入dmso 240μl，制成硝苯地平20nmol/l溶液。
[0376]
(7)对于硝苯地平20μmol/l溶液120μl，加入dmso 280μl，制成硝苯地平6nmol/l溶液。
[0377]
(8)对于硝苯地平6nmol/l溶液120μl，加入dmso 240μl，制成硝苯地平2nmol/l溶液。将dmso 200μl用作空白溶液。]
[0378]
对于(1)-(8)的稀释系列10μl及空白溶液10μl，加入20μl的基质溶液(动物或人血清/pbs/dmso＝10/90/0.1，体积比)，进一步加入170μl的猝灭溶液2[对于甲醇/乙腈＝1/1溶液80ml，加入80μl的吲哚美辛溶液(浓度200μg/ml)的溶液]，制成校准曲线样品。用与采样后的样品同样的方法，对校准曲线样品进行预处理。另外，(1)-(8)的稀释系列由于以实际样品为基准时，浓度被调整成2倍，因此通过将由稀释系列调整后的浓度作为半量进行修正，作为校准曲线样品的浓度。
[0379]
校准曲线样品的浓度：(8)1nmol/l、(7)3nmol/l、(6)10nmol/l、(5)30nmol/l、(4)100nmol/l、(3)300nmol/l、(2)1000nmol/l、(1)3000nmol/lms条件(设定值):esi positive、capillary(kv)2.00、cone(v)25.00、source offset(v)50.0、source temperature(℃)150、desolvation temperature(℃)600、desolvation gas flow(l/hr)1000、cone gas flow(l/hr)150、collision gas flow(ml/min)0.20、nebuliser gas flow(bar)7.00
[0380]
[表4]
[0381][0382]
[通过动态分析取得fu比]
[0383]
使用进行动态分析的软件(“simbiology(注册商标)/matlab、版本信息：9.7.0.1190202(r2019b)”、the mathworks,inc.公司制)，对得到的浓度推移进行数据输入，利用下述条件及非线性最小二乘法(lsqnonlin)计算各参数及fu比。另外，将制备供体溶液时的供体溶液中的测定对象物质的设定浓度用作透析反应开始起0小时的时刻的供体溶液中所含的测定对象物质的浓度。
[0384]
(式1)：
[0385][0386]
(式2)：
[0387][0388]
(式3)：
[0389][0390]
此处，各参数分别表示以下。
[0391]
v1：供体溶液的容积(固定值，3.5
×
10-4
l)
[0392]
v2：受体溶液的容积(固定值，2.0
×
10-4
l)
[0393]
fu1：测定对象物质相对于供体溶液中所含有的生物学试样的fu值(计算值)
[0394]
fu2：测定对象物质相对于受体溶液中所含有的生物学试样的fu值(计算值)
[0395]
c1：供体溶液中的测定对象物质的浓度(总浓度：结合型及未结合型测定对象物质的合计。但是，吸附在平衡透析装置的测定对象物质除外)。
[0396]
(测定值，nmol/l)
[0397]
c2：受体溶液中的测定对象物质的浓度(总浓度：结合型及未结合型测定对象物质的合计)。(测定值，nmol/l)
[0398]
ps：未结合型测定对象物质的透析膜透过清除率(固定值，1.0
×
10-4
l/h)
[0399]
clad：供体侧室中的测定对象物质的吸附清除率(变动值，l/h)
[0400]
koff：供体侧室中的测定对象物质的解离速度常数(变动值，h-1
)
[0401]
xad：供体侧室中的测定对象物质的吸附量(变动值，nmol)
[0402]
各符号中记载的数字“1”表示供体侧，“2”表示受体侧。
[0403]
收敛计算(拟合)：
[0404]
在动态分析中，将供体溶液和受体溶液中所含有的生物学试样更换的测定结果作为一组来计算相对fu比。fit data(simbiology model analyzer,program)的默认设定中，记载下述条件(model、reaction、rules、definition、estimated parameters)并实施。实施了分析时的模型如图3所示。
[0405]
reaction:
[0406]
eq1.donor1《-》eq1.acceptor1:+fu1*ps*eq1.donor1/vd1-fu2*ps*eq1.acceptor1/vd2
[0407]
eq1.donor1-》eq1.ad:+cl1*fu1*eq1.donor1/vd1-(koff1*eq1.ad)
[0408]
eq2.donor2《-》eq2.acceptor2:+fu2*ps*eq2.donor2/vd1-fu1*ps*eq2.acceptor2/vd2
[0409]
eq2.donor2-》eq2.ad:+cl2*fu2*eq2.donor2/vd1-(koff2*eq2.ad)
[0410]
rules:
[0411]
rule_1eq1.ca1＝eq1.acceptor1/vd2 repeatedassignment
[0412]
rule_2eq1.cd1＝eq1.donor1/vd1 repeatedassignment
[0413]
rule_3eq2.ca2＝eq2.acceptor2/vd2 repeatedassignment
[0414]
rule_4eq2.cd2＝eq2.donor2/vd1 repeatedassignment
[0415]
rule_5eq1.donor1＝dose1 initialassignment
[0416]
rule_6eq2.donor2＝dose2 initialassignment
[0417]
definition：
[0418]
在第一个生物学试样是小鼠、第二个生物学试样是人的情况下，将以下4个数据作为一组用于分析。
[0419]
数据1(eq1.ca1)：供体溶液中含有小鼠血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0420]
数据2(eq1.cd1)：供体溶液中含有小鼠血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0421]
数据3(eq2.ca2)：供体溶液中含有人血清、受体溶液中含有小鼠血清的平衡透析体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0422]
数据4(eq2.cd2)：供体溶液中含有人血清、受体溶液中含有小鼠血清的平衡透析体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0423]
estimated parameters：
[0424]
exp(fu1)，initialvalue＝1，bounds＝[0.01 100]；
[0425]
exp(fu2)，initialvalue＝1，bounds＝[0.01 100]；
[0426]
exp(koff1)，initialvalue＝1，bounds＝[0.01 1000000]；
[0427]
exp(koff2)，initialvalue＝1，bounds＝[0.01 1000000]；
[0428]
exp(cl1)，initialvalue＝0.001，bounds＝[1e-07 0.1]；
[0429]
exp(cl2)，initialvalue＝0.001，bounds＝[1e-07 0.1]；
[0430]
exp(dose1)，initialvalue＝0.2115，bounds＝[0.1 0.4]；
[0431]
exp(dose2)，initialvalue＝0.2114，bounds＝[0.1 0.4]；
[0432]
pooled fit，true
[0433]
通过上述动态分析方法计算的测定对象物质(硝苯地平)相对于各种类的fu比(/人、血清浓度1/10、人/人为1.00)如表5所示，另外，在透析反应开始时起经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻的向各室添加的溶液中的测定对像物质的浓度绘图和通过动态分析的相对于这些绘图的拟合曲线如图4(1)至(4)所示。
[0434]
[表5]
[0435] 相对fu比(/人)小鼠1.37大鼠0.06
狗1.40猴1.10人1.00
[0436]
[比较例1]
[0437]
通过静态分析取得种差间的相对fu比(测定对象物质：硝苯地平)
[0438]
与实施例1同样地制备供体溶液(10％小鼠、大鼠、狗或猴血清)和受体溶液(10％人血清)，开始透析反应，测定在透析反应开始时起经过24小时的时刻的向各室添加的溶液中的测定对象物质的浓度。将得到的数据应用于下述式4，取得各种血清(小鼠、大鼠、狗或猴)中的硝苯地平的fu比(相对人、人/人为1.00)。在多个孔中用同一血清测定特定对象物质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。
[0439]
(式4)：
[0440][0441]
得到的结果如下所示。
[0442]
[表6]
[0443] fu比(/人)小鼠1.25大鼠0.12狗1.29猴1.01人1.00
[0444]
[参考例1]
[0445]
通过静态分析(相对缓冲液)取得种差间的fu比(测定对象物质：硝苯地平)
[0446]
[供体溶液的制备]
[0447]
除了将各种血清(小鼠、大鼠、狗、猴、人这5种(a至e))、磷酸缓冲生理盐水及硝苯地平1mmol/l溶液的量设为表7所示的量以外，用与实施例1同样的方法，制备血清浓度10％(体积比)、硝苯地平浓度1μmol/l、dmso浓度0.1％(体积比)的供体溶液。
[0448]
[表7]
[0449][0450]
[受体溶液的制备]
[0451]
向磷酸缓冲生理盐水(pbs)(20ml)中加入1/1000倍量的dmso溶液(20μl)，制备dmso浓度为0.1％(体积比)的受体溶液(缓冲液)。
[0452]
[透析反应]
[0453]
除了将向各室分注的溶液设为如表8所示以外，用与实施例1同样的方法进行透析反应。
[0454]
[表8]
[0455][0456]
[透析反应后的采样]
[0457]
除了将采样的时机仅设为透析反应开始时起经过24小时的时刻以外，用与实施例1同样的方法进行采样。
[0458]
[采样后的试样的预处理和利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0459]
用与实施例1同样的方法，进行对于采样后的试样的预处理和样品中的测定对象物质的浓度测定。在多个孔中用同一血清测定特定对象物质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。
[0460]
[使用各种类的fu值计算种差间的相对fu比]
[0461]
首先，将得到的浓度数据应用于下述式5，取得各种血清(小鼠、大鼠、狗、猴或人)中的硝苯地平的fu值。
[0462]
(式5)：
[0463][0464]
接着，将上述fu值应用于下述式6，计算相对于各种人的相对fu比。
[0465]
(式6)：
[0466]fu
比＝α/β
[0467]
(式中，α表示各种类(小鼠、大鼠、狗或猴)的fu值，β表示人的fu值)得到的结果如下所示。
[0468]
[表9]
[0469] fu比(/人)
小鼠1.48大鼠0.12狗1.37猴1.17人1.00
[0470]
[实施例2]
[0471]
通过动态分析取得种差间的相对fu比(测定对象物质：环孢素)
[0472]
[供体溶液的制备]
[0473]
首先，将环孢素作为测定对象物质，制备10mmol/l溶液和1mmol/l溶液。具体地，对于粉末环孢素(“环孢素”、富士胶片和光纯药(株)公司制、分子量1202.61、clogp：14.36、氨基酸残基数11)6.81mg，加入二甲基亚砜(dmso)0.566ml，制成环孢素10mmol/l溶液。接着，对于20μl的环孢素10mmol/l溶液，加入dmso 180ul，制成环孢素1mmol/l溶液。
[0474]
接着，使各种血清(小鼠血清、大鼠血清、狗血清、猴血清、人血清)溶解。采集经溶解的各种血清，分别加入9倍量的磷酸缓冲生理盐水和1/1000倍量的环孢素1mmol/l溶液，制备血清浓度10％(体积比)、环孢素浓度1μmol/l、dmso浓度0.1％(体积比)的供体溶液。具体使用的各试样的量如下述表10所示。
[0475]
此外，除环孢素以外使用的各试样与实施例1相同。
[0476]
[表10]
[0477][0478]
[受体溶液的制备]
[0479]
与实施例1所述的方法同样地实施。
[0480]
[透析反应]
[0481]
与实施例1所述的方法同样地实施。
[0482]
[透析反应后的采样]
[0483]
与实施例1所述的方法同样地实施。
[0484]
[采样后的试样的预处理]
[0485]
与实施例1所述的方法同样地实施。
[0486]
[利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0487]
对于各个所述lc-ms/ms用测定用试样，使用下述测定仪器和测定条件，测定向各室添加的溶液中的环孢素浓度。在多个孔中用同一血清测定特定对象物质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。
[0488]
(测定仪器)
[0489]
lc：waters acquity uplc
[0490]
ms：xevo tq-s(waters corporation,milford,massachusetts)
[0491]
柱：ymc-triart bio c4，柱尺寸2.1x30mm，粒径1.9μm，细孔径30nm
[0492]
(测定条件)
[0493]
柱温度：40℃(设定值)
[0494]
溶剂：a)0.1％甲酸水溶液
[0495]
b)0.1％甲酸乙腈溶液
[0496]
梯度条件：
[0497]
[表11]
[0498][0499]
流速：0.6ml/min
[0500]
自动采样器温度：10℃(设定值)
[0501]
注入量(injection volume)：1μl
[0502]
校准曲线样品的制作：除了使用环孢素代替硝苯地平以外，与实施例1所述的方法同样地实施。
[0503]
校准曲线1nmol/l、3nmol/l、10nmol/l、30nmol/l、100nmol/l、300nmol/l、1000nmol/l、3000nmol/l
[0504]
ms条件(设定值):esi positive、capillary(kv)2.00、cone(v)25.00、source offset(v)50.0、source temperature(℃)150、desolvation temperature(℃)600、desolvation gas flow(l/hr)1000、cone gas flow(l/hr)150、collision gas flow(ml/min)0.20、nebuliser gas flow(bar)7.00
[0505]
[表12]
[0506][0507]
[通过动态分析取得fu比]
[0508]
与实施例1同样地使用进行动态分析的软件(“simbiology(注册商标)/matlab、版本信息：9.7.0.1190202(r2019b)”、the math works,inc.公司制)，对得到的浓度推移进行数据输入，利用下述条件计算各参数及fu比。
[0509]
动态分析涉及的关系式与实施例1所述的式1至式3相同。式中的各参数分别表示以下。
[0510]
v1：供体溶液的容积(固定值，3.5
×
10-4
l)
[0511]
v2：受体溶液的容积(固定值，2.0
×
10-4
l)
[0512]
fu1：测定对象物质相对于供体溶液中所含有的生物学试样的fu值(计算值)
[0513]
fu2：测定对象物质相对于受体溶液中所含有的生物学试样的fu值(计算值)
[0514]
c1：供体溶液中的测定对象物质(总浓度：结合型+未结合型测定对象物质的合计，但是，吸附在平衡透析装置的测定对象物质除外)的浓度(测定值，nmol/l)
[0515]
c2：受体溶液中的测定对象物质(总浓度：结合型+未结合型测定对象物质的合计)的浓度(测定值，nmol/l)
[0516]
ps：测定对象物质的透析膜透过清除率(固定值，1.0
×
10-5
l/h)
[0517]
clad：供体侧室中的测定对象物质的吸附清除率(变动值，l/h)
[0518]
koff：供体侧室中的测定对象物质的解离速度常数(变动值，h-1
)
[0519]
xad：供体侧室中的测定对象物质的吸附量(变动值，nmol)
[0520]
拟合：除了使用下述参数以外，按照与实施例1同样的参数实施。
[0521]
estimated parameters:
[0522]
exp(fu1),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 100]；
[0523]
exp(fu2),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 100]；
[0524]
exp(koff1),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 1000000]；
[0525]
exp(koff2),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 1000000]；
[0526]
exp(cl1),initialvalue＝0.001,bounds＝[1e-07 0.1]；
[0527]
exp(cl2),initialvalue＝0.001,bounds＝[1e-07 0.1]；
[0528]
exp(dose1),initialvalue＝0.2115,bounds＝[0.1 0.5]；
[0529]
exp(dose2),initialvalue＝0.2114,bounds＝[0.1 0.5]；
[0530]
通过上述动态分析方法计算的测定对象物质(环孢素)相对于各种类的fu比(/人、血清浓度1/10、人/人为1.00)如表13所示，另外，在透析反应开始时起经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻的向各室添加的溶液中的测定对像物质的浓度绘图和通过动态分析的相对于这些绘图的拟合曲线如图5(1)至(4)所示。
[0531]
[表13]
[0532] 相对fu比(相对人)小鼠0.63大鼠0.99狗0.82猴2.01人1.00
[0533]
[比较例2]
[0534]
通过静态分析取得种差间的相对fu比(测定对象物质：环孢素)
[0535]
与实施例2同样地制备供体溶液(10％小鼠、大鼠、狗或猴血清)和受体溶液(10％人血清)，开始透析反应，测定在透析反应开始时起经过24小时的时刻的向各室添加的溶液中的测定对象物质的浓度。在多个孔中用同一血清测定特定对象物质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。将得到的数据应用于下述式7，取得各种血清(小鼠、大鼠、狗或猴)中的环孢素的fu比(相对人、人/人为1.00)。
[0536]
(式7)：
[0537][0538]
得到的结果如下所示。
[0539]
[表14]
[0540] fu比(/人)小鼠0.23大鼠0.45狗0.27猴0.78人1.00
[0541]
[参考例2]
[0542]
通过静态分析(相对缓冲液)取得种差间的fu比(测定对象物质：环孢素)
[0543]
[供体溶液的制备]
[0544]
除了将各种血清(小鼠、大鼠、狗、猴、人)、磷酸缓冲生理盐水及环孢素1mmol/l溶液的量设为表15所示的量以外，用与实施例2同样的方法，制备血清浓度10％(体积比)、环孢素浓度1μmol/l、dmso浓度0.1％(体积比)的供体溶液。
[0545]
[表15]
[0546][0547]
[受体溶液的制备]
[0548]
与参考例1所述的方法同样地实施。
[0549]
[透析反应]
[0550]
与参考例1所述的方法同样地实施。
[0551]
[透析反应后的采样]
[0552]
与参考例1所述的方法同样地实施。
[0553]
[采样后的试样的预处理和利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0554]
与实施例2所述的方法同样地实施。
[0555]
[使用各种类的fu值计算种差间的相对fu比]
[0556]
与参考例1所述的方法同样地实施。
[0557]
得到的结果如下所示。
[0558]
[表16]
[0559] fu比(相对人)小鼠1.14大鼠1.79狗1.31猴2.55人1.00
[0560]
[实施例3]
[0561]
通过动态分析取得种差间的相对fu比(测定对象物质：布洛芬)
[0562]
[供体溶液的制备]
[0563]
首先，将布洛芬作为测定对象物质，制备10mmol/l溶液和1mmol/l溶液。具体地，对于粉末布洛芬(“布洛芬”、富士胶片和光纯药(株)公司制、分子量206.28、clogp：3.68)1.91mg，加入二甲基亚砜(dmso)0.926ml，制成布洛芬10mmol/l溶液。接着，对于20ul的布洛芬10mmol/l溶液，加入dmso 180ul，制成布洛芬1mmol/l溶液。
[0564]
接着，使各种血清(小鼠血清、大鼠血清、狗血清、猴血清、人血清)溶解。采集经溶解的各种血清，分别加入9倍量的磷酸缓冲生理盐水和1/1000倍量的布洛芬1mmol/l溶液，制备血清浓度10％(体积比)、布洛芬浓度1μmol/l、dmso浓度0.1％(体积比)的供体溶液。具体使用的各试样的量如下述表17所示。
[0565]
此外，除布洛芬以外使用的各试样与实施例1相同。
[0566]
[表17]
[0567][0568]
[受体溶液的制备]
[0569]
与实施例1所述的方法同样地实施。
[0570]
[透析反应]
[0571]
与实施例1所述的方法同样地实施。
[0572]
[透析反应后的采样]
[0573]
与实施例1所述的方法同样地实施。
[0574]
[采样后的试样的预处理]
[0575]
与实施例1所述的方法同样地实施。
[0576]
[利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0577]
对于各个所述lc-ms/ms用测定用试样，使用下述测定仪器和测定条件，测定向各室添加的溶液中的布洛芬浓度。与实施例1同样地在多个孔中用同一血清测定特定对象物
质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。(测定仪器)
[0578]
lc：waters acquity uplc
[0579]
ms：xevo tq-s(waters corporation,milford,massachusetts)
[0580]
柱：ymc-triart c18柱，柱尺寸2.0x30mm，粒径1.9μm，细孔径12nm
[0581]
(测定条件)
[0582]
柱温度：50℃(设定值)
[0583]
溶剂：
[0584]
a)10mmol/l甲酸铵水溶液(水:甲酸铵溶液1mol/l、1000ml:10ml)
[0585]
b)10mmol/l甲酸铵meoh溶液(meoh:甲酸铵溶液1mol/l、1000ml:10ml)
[0586]
梯度条件：
[0587]
[表18]
[0588][0589]
流速：0.6ml/min
[0590]
自动采样器温度：10℃(设定值)
[0591]
injection volume：10μl
[0592]
校准曲线样品的制作：对溶解于dmso中的布洛芬1mmol/l溶液10μl，加入dmso 90μl，制成布洛芬100μmol/l溶液，基于布洛芬100μmol/l溶液，制备下述(1)-(9)的稀释系列和空白溶液。
[0593]
[(1)对于布洛芬100μmol/l溶液24μl，加入dmso 376μl，制成布洛芬6000nmol/l溶液。
[0594]
(2)对于布洛芬6000nmol/l溶液240μl，加入dmso 240μl，制成布洛芬3000nmol/l溶液。
[0595]
(3)对于布洛芬3000nmol/l溶液240μl，加入dmso 120μl，制成布洛芬2000nmol/l溶液。
[0596]
(4)对于布洛芬2000nmol/l溶液120μl，加入dmso 280μl，制成布洛芬600nmol/l溶液。
[0597]
(5)对于布洛芬600nmol/l溶液240μl，加入dmso 240μl，制成布洛芬300nmol/l溶液。
[0598]
(6)对于布洛芬300nmol/l溶液240μl，加入dmso 120μl，制成布洛芬200nmol/l溶液。
[0599]
(7)对于布洛芬200nmol/l溶液120μl，加入dmso 280μl，制成布洛芬60nmol/l溶液。
[0600]
(8)对于布洛芬60nmol/l溶液240μl，加入dmso 240μl，制成布洛芬30nmol/l溶液。
[0601]
(9)对于布洛芬30nmol/l溶液240μl，加入dmso 120μl，制成布洛芬20nmol/l溶液。将dmso 200μl用作空白溶液。]
[0602]
对于(1)-(9)的稀释系列10μl及空白溶液10μl，加入20μl的基质溶液(动物或人血清/pbs/dmso＝10/90/0.1，体积比)，进一步加入170μl的猝灭溶液2[对于甲醇/乙腈＝1/1溶液80ml，加入80μl的吲哚美辛溶液(浓度200μg/ml)的溶液]，制成校准曲线样品。用与采样后的样品同样的方法，对校准曲线样品进行预处理。另外，(1)-(9)的稀释系列由于以实际样品为基准时，浓度被调整成2倍，因此通过将由稀释系列调整后的浓度作为半量进行修正，作为校准曲线样品的浓度。
[0603]
校准曲线样品的浓度：(9)10nmol/l、(8)15nmol/l、(7)30nmol/l、(6)100nmol/l、(5)150nmol/l、(4)300nmol/l、(3)1000nmol/l、(2)1500nmol/l、(1)3000nmol/l
[0604]
校准曲线10nmol/l、15nmol/l、30nmol/l、100nmol/l、150nmol/l、300nmol/l、1000nmol/l、1500nmol/l、3000nmol/l
[0605]
ms条件(设定值):(esi negative)、capillary(kv)2.00、cone(v)25.00、source offset(v)50.0、source temperature(℃)150、desolvation temperature(℃)600、desolvation gas flow(l/hr)1000、cone gas flow(l/hr)150、collision gas flow(ml/min)0.20、nebuliser gas flow(bar)7.00
[0606]
[表19]
[0607][0608]
[通过动态分析取得fu比]
[0609]
用实施例1所述的方法，测定布洛芬的fu比。关于小鼠/人，由于小鼠受体的浓度为lloq以下而无法检测，因此人供体
→
小鼠受体的测定结果不会用于分析，仅通过小鼠供体
→
人受体的测定结果、即单向的分析求出fu比。
[0610]
拟合(人/小鼠)：
[0611]
在人/小鼠的情况下，fit data(simbiology model analyzer,program)的默认设定中，记载下述条件并实施。
[0612]
definition：
[0613]
在第一个生物学试样是小鼠、第二个生物学试样是人的情况下，将以下2个数据作为一组用于分析。
[0614]
数据1(eq1.ca1)：供体溶液中含有小鼠血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0615]
数据2(eq1.cd1)：供体溶液中含有小鼠血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析
体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0616]
estimated parameters:
[0617]
exp(fu1),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 100]；
[0618]
exp(fu2),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 100]；
[0619]
exp(koff1),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 1000000]；
[0620]
exp(cl1),initialvalue＝0.001,bounds＝[1e-07 0.1]；
[0621]
exp(dose1),initialvalue＝0.2115,bounds＝[0.1 0.5]；
[0622]
pooled fit,true
[0623]
其他设定值：与实施例1同样。
[0624]
拟合(人/大鼠、人/狗、人/猴)：
[0625]
在人/大鼠、人/狗、人/猴的情况下，除了使用下述参数以外，按照与实施例1同样的参数实施。
[0626]
estimated parameters:
[0627]
exp(fu1),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 100]；
[0628]
exp(fu2),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 100]；
[0629]
exp(koff1),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 1000000]；
[0630]
exp(koff2),initialvalue＝1,bounds＝[0.01 1000000]；
[0631]
exp(cl1),initialvalue＝0.001,bounds＝[1e-07 0.1]；
[0632]
exp(cl2),initialvalue＝0.001,bounds＝[1e-07 0.1]；
[0633]
exp(dose1),initialvalue＝0.2115,bounds＝[0.1 0.5]；
[0634]
exp(dose2),initialvalue＝0.2114,bounds＝[0.1 0.5]；
[0635]
通过上述动态分析方法计算的测定对象物质(布洛芬)相对于各种类的fu比(/人、血清浓度1/10、人/人为1.00)如表20所示，另外，在透析反应开始时起经过0.5小时、2小时、4小时、16小时和24小时的时刻的向各室添加的溶液中的测定对像物质的浓度绘图和通过动态分析的相对于这些绘图的拟合曲线如图6(1)至(4)所示。
[0636]
[表20]
[0637] 相对fu比(相对人)小鼠17.02大鼠4.58狗1.06猴2.41人1.00
[0638]
[比较例3]
[0639]
通过静态分析取得种差间的相对fu比(测定对象物质：布洛芬)
[0640]
与实施例3同样地制备供体溶液(10％小鼠、大鼠、狗或猴血清)和受体溶液(10％人血清)，开始透析反应，测定在透析反应开始时起经过24小时的时刻的向各室添加的溶液中的测定对象物质的浓度。在多个孔中用同一血清测定特定对象物质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。将得到的数据应用于下述式8，取得各种血清(小鼠、大鼠、狗或猴)中的布洛芬的fu比(相对人、人/人为1.00)。
[0641]
(式8)：
[0642][0643]
得到的结果如下所示。
[0644]
[表21]
[0645] fu比(/人)小鼠7.58大鼠3.37狗0.59猴1.26人1.00
[0646]
[参考例3]
[0647]
通过静态分析(相对缓冲液)取得种差间的fu比(测定对象物质：布洛芬)
[0648]
[供体溶液的制备]
[0649]
除了将各种血清(小鼠、大鼠、狗、猴、人)、磷酸缓冲生理盐水及布洛芬1mmol/l溶液的量设为表22所示的量以外，用与实施例2同样的方法，制备血清浓度10％(体积比)、布洛芬浓度1μmol/l、dmso浓度0.1％(体积比)的供体溶液。
[0650]
[表22]
[0651][0652]
[受体溶液的制备]
[0653]
与参考例1所述的方法同样地实施。
[0654]
[透析反应]
[0655]
与参考例1所述的方法同样地实施。
[0656]
[透析反应后的采样]
[0657]
与参考例1所述的方法同样地实施。
[0658]
[采样后的试样的预处理和利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0659]
与实施例3所述的方法同样地实施。
[0660]
[使用各种类的fu值计算种差间的相对fu比]
[0661]
与参考例1所述的方法同样地实施。
[0662]
得到的结果如下所示。
[0663]
[表23]
[0664] fu比(相对人)小鼠16.08
大鼠5.01狗1.76猴3.34人1.00
[0665]
[实施例1至3、比较例1至3及参考例1至3中取得的种差间的相对fu比的比较]
[0666]
将实施例1、比较例1和参考例1、实施例2、比较例2和参考例2以及实施例3、比较例3和参考例3中取得的种差间的相对fu比分别比较，结果分别如图7至图12所示。
[0667]
由此，利用本发明方法的相对fu比(向供体溶液及受体溶液中分别加入来自任意种类的血清，从透析反应开始时起经过24小时为止进行透析反应，根据该时刻为止的浓度推移，通过动态分析取得的种差间fu比)和利用参考例所示的现有公知方法求出的fu比(向供体溶液中加入来自任意种类的血清，使用磷酸缓冲生理盐水作为受体溶液，从透析反应开始时起经过24小时为止进行透析反应，使用由该时刻的浓度比求出的fu值，计算动物与人的fu比的数值)在误差2倍的范围内落入各化合物的所有绘图。经确认，绝对平均误差(absolute average fold errors，aafe)在硝苯地平中示出1.16倍，在环孢素中示出1.46倍，在布洛芬中示出1.22倍。(图7、图8、图9)
[0668]
另一方面，利用比较例方法的fu比(向供体溶液及受体溶液中分别加入来自任意种类的血清，从透析反应开始时起经过24小时为止进行透析反应，根据该时刻的浓度比求出的动物与人的fu比)与利用参考例所示的现有公知方法求出的fu比的相关在误差2倍的范围内，在硝苯地平中5个绘图中落入5个绘图，在环孢素中5个绘图中落入1个绘图，在布洛芬中5个图绘图中落入3个绘图。经确认，绝对平均误差在硝苯地平中示出1.08倍，在环孢素中示出3.16倍，在布洛芬中示出1.90倍。(图10、图11、图12)即，在达到平衡状态的时间较短的硝苯地平中，没有发现利用现有方法和本发明的相对fu比有优劣，但在难以达到平衡状态的环孢素、布洛芬中，利用现有方法(静态分析)求出的fu比的精度与利用本发明方法(动态分析)的相对fu比和利用参考例所示的现有公知方法求出的fu比的精度相比差。
[0669]
因此可知，通过使用本发明的方法，对于难以达到平衡状态的测定对象物质，也可以不用等待达到平衡状态(即，在更短时间内)就取得与利用现有公知方法的fu比显示良好相关的相对fu比。
[0670]
[实施例4～13]
[0671]
通过动态分析取得种差间的相对fu比(测定对象物质：阿那匹韦
·
阿帕鲁胺
·
依巴司韦
·
度他雄胺
·
地拉罗司
·
阿立哌唑
·
贝拉布韦
·
洛美他派
·
依鲁替尼
·
孟鲁司特)
[0672]
[供体(donor)溶液的制备]
[0673]
将阿那匹韦
·
阿帕鲁胺
·
依巴司韦
·
度他雄胺
·
地拉罗司
·
阿立哌唑
·
贝拉布韦
·
洛美他派
·
依鲁替尼
·
孟鲁司特作为测定对象物质，分别制备10mmol/l溶液。具体使用的各试样及其量如下述表24所示。
[0674]
[表24]
[0675][0676]
首先，制备各测定对像物质1mmol/l溶液。具体地，对于含有各测定对象物质10mmol/l溶液10μl，加入dmso 90μl而制备。
[0677]
接着，使各种血清(大鼠血清、人血清)溶解。采集经溶解的各种血清，分别加入9倍量的磷酸缓冲生理盐水，对于该溶液加入1/5000倍量的阿那匹韦1mmol/l溶液、1/5000倍量的阿帕鲁胺1mmol/l溶液、1/5000倍量的依巴司韦1mmol/l溶液、1/5000倍量的度他雄胺1mmol/l溶液和1/5000倍量的地拉罗司1mmol/l溶液。另外，采集其他各种血清，分别加入9倍量的磷酸缓冲生理盐水，对于该溶液分别加入1/5000倍量的阿立哌唑1mmol/l溶液、1/5000倍量的贝拉布韦1mmol/l溶液、1/5000倍量的洛美他派1mmol/l溶液、1/5000倍量的依鲁替尼1mmol/l溶液和1/5000倍量的孟鲁司特1mmol/l溶液。通过这样，制备血清浓度10％
(体积比)、dmso浓度0.1％(体积比)、阿那匹韦
·
阿帕鲁胺
·
依巴司韦
·
度他雄胺
·
地拉罗司的浓度分别为0.2μmol/l或阿立哌唑
·
贝拉布韦
·
洛美他派
·
依鲁替尼
·
孟鲁司特的浓度分别为0.2μmol/l的供体溶液。具体使用的各试样的量如下述表25及下述26所示。
[0678]
此外，除硝苯地平以外使用的各试样与实施例1相同。
[0679]
[表25]
[0680][0681]
[表26]
[0682][0683]
[受体(acceptor)溶液的制备]
[0684]
除了加入dmso溶液代替含有各测定对像物质的1mmol/l溶液以外，按照与供体溶液同样的步骤制备血清浓度10％(体积比)、dmso浓度0.1％(体积比)的受体溶液。
[0685]
[透析反应]
[0686]
除了将测定物质从硝苯地平变更为实施例4～13的各测定对象物质以外，用与实施例1同样的方法实施。向各室中分注的供体溶液或受体溶液如下述表27所示。
[0687]
表27表示对于将大鼠血清设为供体侧并将人血清设为受体侧的情况(试验a至c；相同条件)、以及将人血清设为供体侧并将大鼠血清设为受体侧的情况(试验d至f：相同条件)合计6种，分别在0.5小时、2小时、4小时、20小时和24小时的时刻实施测定的情形。
[0688]
(表27)使用了大鼠/人血清的室模式
[0689]
[0690]
[透析反应后的采样]
[0691]
将采集的供体溶液及受体溶液不使用淬火溶液而密封，将各试样在-80℃保存，直到供于预处理，除此以外，用与实施例1同样的方法实施。
[0692]
[采样后的试样的预处理]
[0693]
对于采样后的试样20μl，加入dmso 5μl、is溶液100μl，分别转移到滤板(“multi screen滤板0.45um，低结合”，millipore公司制)，进行过滤器过滤。向过滤后的试样中加入水50μl，作为lc-ms/ms用测定用试样。is溶液的组成如下述表28所示。
[0694]
[表28]
[0695][0696]
[利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0697]
对于各个所述lc-ms/ms用测定用试样，使用下述测定仪器和测定条件，测定各室中的各测定对像物质的浓度。在多个孔中用同一血清测定特定对象物质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。
[0698]
(测定仪器)
[0699]
lc：nexera(shimadzu)
[0700]
ms：qtrap 6500(sciex)
[0701]
柱：inertsustain c18 hp 3um，2.1x30mm(up)
[0702]
(测定条件)
[0703]
柱温度：40℃(设定值)
[0704]
溶剂：a)0.1％甲酸水溶液
[0705]
b)0.1％甲酸乙腈溶液
[0706]
梯度条件：
[0707]
[表29]
[0708]
时间(分钟)a％b％0.09550.570300.95951.25951.259551.8955
[0709]
流速：0.6ml/min
[0710]
自动采样器温度：4℃(设定值)
[0711]
注入量(injection volume)：实施例4～8的情况下为2μl、实施例9～13的情况下为1μl
[0712]
[校准曲线试样的制作和预处理]
[0713]
对于大鼠血清或人血清50μl加入pbs 450μl，作为10％血清(空白基质)，对于空白
基质20μl加入溶解于dmso中的校准曲线样品的溶液5μl、is溶液100μl，分别转移到滤板(“multi screen滤板0.45um，低结合”，millipore公司制)，进行过滤器过滤。向过滤后的试样中加入水50μl，作为lc-ms/ms用测定用试样。校准曲线用工作溶液如下制作。将代替标准曲线样品溶液5μl加入dmso 5μl的样品作为空白样品。
[0714]
校准曲线样品的溶液制作：对于dmso 190μl，加入溶解于dmso中的阿那匹韦、阿帕鲁胺、依巴司韦、度他雄胺、地拉罗司10mmol/l溶液各2μl，共计200μl，制成各测定对象物质的浓度为100μmol/l的溶液，制作下述(1)-(8)稀释系列。
[0715]
[(1)对于各测定对象物质100μmol/l溶液60μl，加入dmso 90μl，制成化合物40000nmol/l溶液。
[0716]
(2)对于各测定对象物质40000nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物12000nmol/l溶液。
[0717]
(3)对于各测定对象物质12000nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物4000nmol/l溶液。
[0718]
(4)对于各测定对象物质4000nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物1200nmol/l溶液。
[0719]
(5)对于各测定对象物质1200nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物400nmol/l溶液。
[0720]
(6)对于各测定对象物质400nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物120nmol/l溶液。
[0721]
(7)对于各测定对象物质120nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物40nmol/l溶液。
[0722]
(8)对于各测定对象物质40nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物12nmol/l溶液。]
[0723]
(1)-(8)的稀释系列由于以实际样品为基准时，浓度被调整成4倍，因此通过将由稀释系列调整后的浓度作为1/4倍量进行修正，作为校准曲线样品的浓度。
[0724]
校准曲线样品的浓度：(8)3nm、(7)10nm、(6)30nm、(5)100nm、(4)300nm、(3)1000nm、(2)3000nm
[0725]
对于dmso 190μl，加入溶解于dmso中的阿立哌唑、贝拉布韦、洛美他派、依鲁替尼、孟鲁司特10mmol/l溶液各2μl，共计200μl，制成各测定对象物质的浓度为100μmol/l的溶液。制作下述(1)-(8)稀释系列。
[0726]
[(1)对于各测定对象物质100μmol/l溶液6μl，加入dmso 144μl，制成化合物4000nmol/l溶液。
[0727]
(2)对于各测定对象物质4000nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物1200nmol/l溶液。
[0728]
(3)对于各测定对象物质1200nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物400nmol/l溶液。
[0729]
(4)对于各测定对象物质400nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物120nmol/l溶液。
[0730]
(5)对于各测定对象物质120nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物
40nmol/l溶液。
[0731]
(6)对于各测定对象物质40nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物12nmol/l溶液。
[0732]
(7)对于各测定对象物质12nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物4nmol/l溶液。
[0733]
(8)对于各测定对象物质4nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物1.2nmol/l溶液。]
[0734]
(1)-(8)的稀释系列由于以实际样品为基准时，浓度被调整成4倍，因此通过将由稀释系列调整后的浓度作为1/4倍量进行修正，作为校准曲线样品的浓度。
[0735]
校准曲线样品的浓度：(8)0.3nm、(7)1nm、(6)3nm、(5)10nm、(4)30nm、(3)100nm、(2)300nm
[0736]
[表30]
[0737][0738]
在表30中，dp为去簇电压(declustering potential)，ce为碰撞能量(collision energy)，cep为碰撞入口电压(collision entrance potential)。
[0739]
ms条件：(esi positive)curtain gas tm flow(cur)30,ionspray tm voltage(is)5500,temperature(tem)650,ion sourcegas1(gs1)20,ion source gas2(gs2)20
[0740]
[通过动态分析取得fu比]
[0741]
除了变更以下所示的条件以外，用与实施例1同样的方法计算大鼠-人之间的fu比。
[0742]
definition：
[0743]
在第一个生物学试样是大鼠、第二个生物学试样是人的情况下，将以下4个数据作为一组用于分析。
[0744]
数据1(eq1.cd1)：供体溶液中含有大鼠血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0745]
数据2(eq1.ca1)：供体溶液中含有大鼠血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0746]
数据3(eq2.cd2)：供体溶液中含有人血清、受体溶液中含有大鼠血清的平衡透析体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0747]
数据4(eq2.ca2)：供体溶液中含有人血清、受体溶液中含有大鼠血清的平衡透析体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0748]
estimated parameters：
[0749]
exp(fu1).initialvalue＝0.01；bounds＝[1e-05 1]；
[0750]
exp(fu2).initialvalue＝0.01；bounds＝[1e-05 1]；
[0751]
exp(koff1).initialvalue＝1；bounds＝[1e-05 10000]；
[0752]
exp(koff2).initialvalue＝1；bounds＝[1e-05 10000]；
[0753]
exp(cl1).initialvalue＝0.001；bounds＝[1e-07 100]；
[0754]
exp(cl2).initialvalue＝0.001；bounds＝[1e-07 100]；
[0755]
exp(dose1).initialvalue＝0.2115；bounds＝[0.01 0.3]；
[0756]
exp(dose2).initialvalue＝0.2114；bounds＝[0.01 0.3]；
[0757]
得到的结果如下所示。
[0758]
[表31]
[0759] fu比(大鼠/人)阿那匹韦3.34阿帕鲁胺2.50依巴司韦2.90度他雄胺1.94地拉罗司3.12阿立哌唑1.74贝拉布韦1.34洛美他派6.52依鲁替尼0.26孟鲁司特-[0760]
[比较例4～13]
[0761]
通过静态分析取得种差间的相对fu比(测定对象物质：与实施例4～13相同)
[0762]
与实施例4～13同样地制备供体溶液和受体溶液，开始透析反应，测定在透析反应
开始时起经过24小时的时刻的向各室添加的溶液中的测定对象物质的浓度。在多个孔中用同一血清测定特定对象物质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。将得到的数据应用于比较例1的式4，取得测定对象物质相对于各种种类的fu比(大鼠/人、血清浓度1/10)。
[0763]
得到的结果如下所示。
[0764]
[表32]
[0765] fu比(大鼠/人)阿那匹韦0.69阿帕鲁胺3.36依巴司韦0.18度他雄胺1.70地拉罗司1.39阿立哌唑0.98贝拉布韦0.84洛美他派0.57依鲁替尼0.23孟鲁司特-[0766]
[参考例4～13]
[0767]
静态分析(相对缓冲液)中的种差间的fu比的取得(测定对象物质：与实施例4～13相同)
[0768]
[供体(donor)溶液的制备]
[0769]
将阿那匹韦
·
阿帕鲁胺
·
依巴司韦
·
度他雄胺
·
地拉罗司
·
阿立哌唑
·
贝拉布韦
·
洛美他派
·
依鲁替尼
·
孟鲁司特作为测定对象物质，分别制备10mmol/l溶液。具体使用的各试样及其量如下述表33所示。
[0770]
[表33]
[0771][0772]
首先，制备测定对像物质的混合溶液(cocktail solution)。具体地，将阿那匹韦10mmol/l溶液2μl、阿帕鲁胺10mmol/l溶液2μl、依巴司韦10mmol/l溶液2μl、度他雄胺10mmol/l溶液2μl和地拉罗司10mmol/l溶液2μl与dmso 90μl混合，制备共计100μl的混合溶液。另外，将阿立哌唑10mmol/l溶液2μl、贝拉布韦10mmol/l溶液2μl、洛美他派10mmol/l溶液2μl、依鲁替尼10mmol/l溶液2μl和孟鲁司特10mmol/l溶液2μl与dmso 90μl混合，制备共计100μl的混合溶液。
[0773]
接着，使各种血清(大鼠血清、人血清)溶解。采集经溶解的各种血清，分别加入9倍量的磷酸缓冲生理盐水，对其溶液加入含有各自浓度为0.2μmol/l的阿那匹韦、阿帕鲁胺、依巴司韦、度他雄胺、地拉罗司的混合溶液1/1000倍量或含有各自浓度为0.2μmol/l的阿立哌唑、贝拉布韦、洛美他派、依鲁替尼、孟鲁司特的混合溶液1/1000倍量，制备供体溶液。具体使用的各试样的量如下述表34及下述35所示。此外，除硝苯地平以外使用的各试样与实施例1相同。
[0774]
[表34]
[0775][0776]
[表35]
[0777][0778]
[受体(acceptor)溶液的制备]
[0779]
按照与实施例4～13同样的步骤制备dmso浓度为0.1％(体积比)的受体溶液。
[0780]
[透析反应]
[0781]
将供体溶液变更为参考例4～13中制作的供体溶液，并且在下述条件下实施，除此以外，通过与参考例1同样的方法，取得各测定对象物质中的大鼠/人的fu值。
[0782]
表36表示对于将大鼠血清或人血清设为供体侧并将磷酸缓冲生理盐水设为受体侧的情况(试验a至c；相同条件)合计6种，分别在24小时的时刻实施测定的情形。
[0783]
[表36]
[0784][0785]
[透析反应后的采样]
[0786]
用与实施例4～13同样的步骤实施。
[0787]
[采样后的试样的预处理]
[0788]
对于采样后的试样20μl，加入dmso 10μl、is溶液100μl，分别转移到滤板(“multi screen滤板0.45um，低结合”，millipore公司制)，进行过滤器过滤。向过滤后的试样中加入水70μl，作为lc-ms/ms用测定用试样。is溶液的组成如下述表37所示。
[0789]
[表37]
[0790][0791]
校准曲线样品的制作：对于溶解于dmso中的阿那匹韦、阿帕鲁胺、依巴司韦、度他雄胺、地拉罗司混合溶液(各2μl)1μl，加入dmso 99μl，制成化合物2μmol/l混合溶液。对于溶解于dmso中的阿立哌唑、贝拉布韦、洛美他派、依鲁替尼、孟鲁司特混合溶液(各2μl)1μl，加入dmso 99μl，制成化合物2μmol/l混合溶液。制作下述(1)-(8)稀释系列及空白溶液。
[0792]
[(1)对于各测定对象物质2μmol/l溶液60μl，加入dmso 40μl，制成化合物1200nmol/l溶液。
[0793]
(2)对于各测定对象物质1200nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物400nmol/l溶液。
[0794]
(3)对于各测定对象物质400nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物120nmol/l溶液。
[0795]
(4)对于各测定对象物质120nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物40nmol/l溶液。
[0796]
(5)对于各测定对象物质40nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物12nmol/l溶液。
[0797]
(6)对于各测定对象物质12nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物4nmol/l溶液。
[0798]
(7)对于各测定对象物质4nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物1.2nmol/l溶液。
[0799]
(8)对于各测定对象物质1.2nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物0.4nmol/l溶液。]
[0800]
(1)-(8)的稀释系列由于以实际样品为基准时，浓度被调整成2倍，因此通过将由稀释系列调整后的浓度作为1/2倍量进行修正，作为校准曲线样品的浓度。
[0801]
校准曲线样品的浓度：(8)0.2nm(8)0.6nm、(7)2nm、(6)6nm、(5)20nm、(4)60nm、(3)200nm、(2)600nm
[0802]
[利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0803]
对于各个所述lc-ms/ms用测定用试样，使用下述测定仪器和测定条件，测定各室中的阿那匹韦、阿帕鲁胺、依巴司韦、度他雄胺及地拉罗司的浓度、以及阿立哌唑、贝拉布韦、洛美他派、依鲁替尼、孟鲁司特的浓度。在多个孔中用同一血清测定特定对象物质的浓度时，将在同一血清组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。
[0804]
(测定仪器)
[0805]
lc：waters acquity uplc
[0806]
ms：xevo-tqs#waa696(waters corporation,milford,massachusetts)
[0807]
柱：ymc-triart c18柱,30x 2.0mm id,s-1.9um,12nm
[0808]
(测定条件)
[0809]
柱温度：40℃(设定值)
[0810]
溶剂：a)0.1％甲酸水溶液
[0811]
b)0.1％甲酸乙腈溶液
[0812]
梯度条件：
[0813]
[表38]
[0814]
时间(分钟)a％b％0.080200.280200.435650.615850.85951.25951.380201.68020
[0815]
流速：0.6ml/min
[0816]
自动采样器温度：10℃(设定值)
[0817]
注入量(injection volume)：1μl(参考例5、7～13)，1.5μl(参考例6)
[0818]
[利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0819]
对于各个所述lc-ms/ms用测定用试样，使用下述测定仪器和测定条件，测定各室中的阿那匹韦浓度。
[0820]
(测定仪器)
[0821]
lc：waters acquity uplc
[0822]
ms：xevo-tqs#waa696(waters corporation，milford，massachusetts)
[0823]
柱：ymc-triart bio c4，30x 2.1mm id，s-1.9um，30nm
[0824]
(测定条件)
[0825]
柱温度：40℃(设定值)
[0826]
溶剂：a)0.1％甲酸水溶液
[0827]
b)0.1％甲酸乙腈溶液
[0828]
梯度条件：
[0829]
[表39]
[0830]
时间(分钟)a％b％0.060400.260400.415850.65950.81991.21991.4199
1.41604026040
[0831]
流速：0.6ml/min
[0832]
自动采样器温度：10℃(设定值)
[0833]
注入量(injection volume)：1μl
[0834]
[表40]
[0835][0836]
ms条件：
[0837]
esi positive
[0838]
capillary 2kv，cone 25v，source offset 50v，source temperature150℃，desolvation temperature 600℃，cone gas flow 150l/hr，collision gas flow 0.2ml/min，nebuliser gas flow 7bar
[0839]
得到的各测定对像物质的fu比(大鼠/人)的结果如下所示。
[0840]
[表41]
[0841] fu比(大鼠/人)阿那匹韦1.52阿帕鲁胺2.30依巴司韦1.46度他雄胺1.47地拉罗司3.53阿立哌唑1.45贝拉布韦1.21洛美他派2.77
依鲁替尼0.40孟鲁司特-[0842]
[评价例1]
[0843]
药物的人分布容积的预测方法
[0844]
使用在上述实施例1～13、比较例1～13及参考例1～13中求出的fu比，预测人的分布容积。
[0845]“分布容积”(v)是指以与血液或血浆中相同的浓度，在体内含有施用药物总量所需的理论上的液体量，分布容积＝体内药物量/血中浓度(例如l)。
[0846]
应用预测人分布容积的方法(非专利文献7：berry，l.m.，et al.(2011).
″
species differences in distribution and prediction of human v(ss)from preclinical data.
″
drug metab dispos 39(11)：2103-2116.)，对于每体重的稳态分布容积(大鼠)除去通过上述方法得到的药物的fu比(大鼠/人)，由此求出每体重的人分布容积的预测值。通过将得到的预测值与人分布容积的观测值比较，进行预测精度的验证。
[0847]
分布容积的预测式
[0848]
vss
人
(预测值)＝vss
大鼠
/rfu
[0849]
vss
大鼠
：大鼠的每体重的稳态分布容积(vss[l/kg])
[0850]
rfu：相对fu比(大鼠/人)
[0851]
使用下述稀释式，将参考例4～13中得到的稀释后的的fu值(大鼠、血清浓度1/10)、fu值(人、血清浓度1/10)修正为血清浓度1/1，对于在大鼠或人中fu值为0.01以下的化合物(即，难以得到平衡状态的化合物)，用于分布容积预测。
[0852]
稀释式
[0853]
式中，d表示稀释率，此次使用10倍稀释的血清，因此d＝10。
[0854]
上述稀释式参照下述文献。
[0855]
非专利文献8：riccardi k,cawley s,yates pd,et al.plasma protein binding of challenging compounds.j pharm sci.2015；104:2627-2636.
[0856]
非专利文献9：kalvass jc,maurer ts.influence of nonspecific brain and plasma binding on cns exposure:implications for rational drug discovery.biopharm drug dispos.2002；23:327-338.
[0857]
修正后的fu值的结果如下所示。
[0858]
[表42]
[0859][0860]
根据表42的结果，阿那匹韦、依巴司韦、度他雄胺、地拉罗司、阿立哌唑、贝拉布韦、洛美他派、依鲁替尼在大鼠或人中fu值为0.01以下，对于在该化合物中取得大鼠和人的分布容积的观测值的化合物，使用相对fu比实施分布容积预测。另外，除此之外，还使用了作为同样在大鼠或人中fu值为0.01以下的化合物的实施例1和3、比较例1和3以及参考例1和3中所使用的硝苯地平和布洛芬的相对fu比。通过预测得到的稳态分布容积(vdss、vss)的结果如下述表43、表44及图13-1～图13-3所示。
[0861]
[表43]
[0862][0863]
[表44]
[0864][0865]
在利用本发明方法的相对fu比(向供体侧室及受体侧室中分别加入来自任意种类的血清，从透析反应开始时起经过24小时为止进行透析反应，根据该时刻为止的浓度推移，通过动态分析取得的种差间fu比)中，以分布容积预测67％落入在误差1.25倍的范围内，以分布容积预测67％落入在误差1.5倍的范围内。绝对平均误差(absolute average fold errors，aafe)以分布容积预测为1.61倍。(图13-1)。
[0866]
在利用比较例方法的fu比(向供体侧室及受体侧室中分别加入来自任意种类的血清，从透析反应开始时起经过24小时为止进行透析反应，使用经过24小时的时刻的浓度比求出的fu值，计算动物与人的fu比的数值)中，以分布容积预测22％落入在误差1.25倍的范围内，以分布容积预测33％落入在误差1.5倍的范围内。aafe为2.38倍。(图13-2)。
[0867]
在利用参考例所示的现有公知方法求出的fu比中，以分布容积预测11％落入在误
差1.25倍的范围内，以分布容积预测56％落入在误差1.5倍的范围内，aafe为1.68倍。(图13-3)
[0868]
使用由本发明方法(动态分析)求出的相对fu比的分布容积预测的精度，相对于比较例所示的分布容积预测的精度，在误差1.25倍、误差1.5倍范围内，关于各aafe，预测精度优异。即，通过使用本发明的方法，可知对于难以达到平衡状态的测定对象物质也能够精度良好地取得相对fu比，能够用于分布容积预测。另外，参考例(相对缓冲液)的方法需要对于各化合物通过事先研究探索血清和缓冲液室中的化合物浓度接近平衡状态的时刻，但在本发明的方法(动态分析)中不需要，认为其是实用性更高的方法。
[0869]
[实施例14～20]
[0870]
通过动态分析取得同一种(人)
·
不同生物体试样之间(血清
·
肝微粒体)的相对fu比(测定对象物质：阿立哌唑、地拉罗司、拉帕替尼、替格瑞洛、酮康唑、伊曲康唑、rg12525)
[0871]
本发明的方法不仅能够比较异种血清，而且能够取得作为在同一种的不同生物体试样的fu比中使用的例子的血清vs肝微粒体的蛋白未结合型分数之比(fu血清vsf
u mic
之比)。将fu比(fu血清vsf
u mic
之比)、测定和分析对象物质设为阿立哌唑、地拉罗司、拉帕替尼、替格瑞洛、酮康唑、伊曲康唑、rg12525。这些提示可能竞争性地抑制作为肝药物代谢酶的cyp3a4，并且在人血清中的蛋白结合率高(fu值血清为0.01以下)。
[0872]
非专利文献10：(vieira,m.l.,et al.(2014)."evaluation of various static in vitro-in vivo extrapolation models for risk assessment of the cyp3ainhibition potential of an investigational drug."clin pharmacol ther 95(2):189-198.)，非专利文献11：hachad,h.,et al.(2010)."a useful tool for drug interaction evaluation:the university of washington metabolism and transport drug interaction database."hum genomics 5(1):61-72.，非专利文献12：chu,q.s.,et al.(2008)."aphase i and pharmacokinetic study of lapatinib in combination with letrozole in patients with advanced cancer."clin cancer res14(14):4484-4490.，非专利文献13：koch,k.m.,et al.(2017)."the effects of lapatinib on cyp3ametabolism of midazolam in patients with advanced cancer."cancer chemother pharmacol 80(6):1141-1146)。
[0873]
这些化合物只要根据现状的fda指导方针使用fu值人血清＝0.01，就被认为是ddi预测困难的化合物，但如果能够通过本发明的方法(动态分析)求出精度高的fu比(fu血清vsf
u mic
之比)，则可以期待ddi预测的精度改善。
[0874]
[表45
[0875][0876]
关于各测定对像物质，分别制备1mmol/l溶液。具体地，对于含有伊曲康唑的5mmol/l溶液2μl加入dmso 8μl，或者对于含有阿立哌唑、地拉罗司、拉帕替尼、替格瑞洛、酮康唑或rg12525的10mmol/l溶液2μl加入dmso 18μl而进行了调整。
[0877]
进而，关于rg12525，对1mmol/l溶液5μl加入dmso 5μl而制成0.5mmol/l溶液。另外，关于伊曲康唑和酮康唑，对1mmol/l溶液2μl加入dmso 8μl而制成0.2mmol/l溶液。
[0878]
接着，采集经溶解的人血清，分别加入9倍量的磷酸缓冲生理盐水，对于该溶液分别加入1/1000倍量的含有测定对象物质(阿立哌唑、地拉罗司、拉帕替尼、替格瑞洛、伊曲康唑、酮康唑或rg12525)的1mmol/l溶液。通过这样，制备血清浓度为10％(体积比)、dmso浓度为0.1％(体积比)的供体溶液。采集经溶解的人肝微粒体(20mg/ml)，分别加入199倍量的磷酸缓冲生理盐水，对于该溶液分别加入1/1000倍量的含有测定对象物质(阿立哌唑、地拉罗司、拉帕替尼或替格瑞洛)的1mmol/l溶液、1/1000倍量的含有rg12525的0.5mmol/l溶液、或1/1000倍量的测定对象物质(伊曲康唑或酮康唑)0.2mmol/l溶液。通过这样，制备微粒体浓度0.1mg/ml、dmso浓度为0.1％(体积比)的供体溶液。
[0879]
此外，除硝苯地平以外使用的各试样与实施例1相同。
[0880]
[受体(acceptor)溶液的制备]
[0881]
除了加入dmso溶液代替含有各测定对像物质的1mmol/l溶液以外，按照与供体溶液同样的步骤制备血清浓度10％(体积比)、dmso浓度0.1％(体积比)的受体溶液。
[0882]
[透析反应]
[0883]
将测定物质从硝苯地平变更为实施例14～20的各测定对象物质，并且将受体溶液用由人血清组成的溶液统一实施，除此以外，用与实施例1同样的方法实施。向各室中分注的供体溶液或受体溶液如下述表46所示。
[0884]
表46表示对于将人血清设为供体侧并将人血清设为受体侧的情况(试验a至h；相同条件)、以及将人肝微粒体设为供体侧并将人血清设为受体侧的情况(试验a至h：相同条件)合计8种，分别在0.5小时、2小时、4小时和20小时的时刻实施测定的情形。
[0885]
[表46]
[0886][0887]
[透析反应后的采样]
[0888]
将采集的供体溶液及受体溶液不使用淬火溶液而密封，将各试样在-80℃保存，直到供于预处理，除此以外，用与实施例1同样的方法实施。
[0889]
[采样后的试样的预处理]
[0890]
对于采样后的试样20μl，加入dmso 10μl、is溶液100μl，分别转移到滤板(“multi screen滤板0.45um，低结合”，millipore公司制)，进行过滤器过滤。向过滤后的试样中加入水70μl，作为lc-ms/ms用测定用试样。is溶液的组成如下述表47所示。
[0891]
[表47]
[0892][0893]
[利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0894]
校准曲线样品的制作：对溶解于dmso中的各测定对象物质(1mmol/l)1μl，加入dmso 99μl，制成化合物10μmol/l溶液。制作下述(1)-(8)稀释系列及空白溶液。
[0895]
[(1)对于各测定对象物质10μmol/l溶液60μl，加入dmso 40μl，制成化合物6000nmol/l溶液。
[0896]
(2)对于各测定对象物质600nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物2000nmol/l溶液。
[0897]
(3)对于各测定对象物质2000nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物600nmol/l溶液。
[0898]
(4)对于各测定对象物质600nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物200nmol/l溶液。
[0899]
(5)对于各测定对象物质200nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物60nmol/l溶液。
[0900]
(6)对于各测定对象物质60nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物20nmol/l溶液。
[0901]
(7)对于各测定对象物质20nmol/l溶液60μl，加入dmso 140μl，制成化合物6nmol/l溶液。
[0902]
(8)对于各测定对象物质6nmol/l溶液60μl，加入dmso 120μl，制成化合物2nmol/l溶液。]
[0903]
(1)-(8)的稀释系列由于以实际样品为基准时，浓度被调整成2倍，因此通过将由稀释系列调整后的浓度作为1/2倍量进行修正，作为校准曲线样品的浓度。
[0904]
校准曲线样品的浓度：(8)1nm(7)3nm、(6)10nm、(5)30nm、(4)100nm、(3)300nm、(2)1000nm、(1)3000nm
[0905]
对于人肝微粒体(0.1mg/ml)或人血清的空白试样20μl，加入校准曲线样品10μl，加入is溶液100μl，分别转移到滤板(“multi screen滤板0.45um，低结合”，millipore公司制)，进行过滤器过滤。向过滤后的试样中加入水70μl，作为lc-ms/ms用测定用试样。
[0906]
[利用lc-ms/ms的测定对象物质的浓度测定]
[0907]
对于各个所述lc-ms/ms用测定用试样，使用下述测定仪器和测定条件，测定各室中的阿立哌唑、地拉罗司、拉帕替尼、替格瑞洛、酮康唑、伊曲康唑或rg12525的浓度。在多个孔中用同一生物体试样种类(血清或人肝微粒体)测定特定对象物质的浓度时，将在同一生物体试样种类组的各孔中测定的浓度的平均值用于fu比的计算。
[0908]
(测定仪器)
[0909]
lc：waters acquity uplc
[0910]
ms：xevo-tqs#waa696(waters corporation，milford，massachusetts)
[0911]
柱：ymc-triart c18柱，30x 2.0mm id，s-1.9um，12nm
[0912]
(测定条件)
[0913]
柱温度：50℃(设定值)
[0914]
溶剂：a)0.1％甲酸水溶液
[0915]
b)0.1％甲酸乙腈溶液
[0916]
梯度条件：
[0917]
[表48]
[0918]
时间(分钟)a％b％0.09910.81991.61991.61991
[0919]
流速：0.6ml/min
[0920]
自动采样器温度：10℃(设定值)
[0921]
注入量(injection volume)：1μl
[0922]
ms条件：(esi positive)
[0923]
[表49]
[0924][0925]
除了如下所述变更各参数以外，用与实施例1同样的方法取得fu比。
[0926]
fu1：测定对象物质相对于供体溶液中所含有的生物学试样的fu值(计算值)
[0927]
fu2：测定对象物质相对于受体溶液中所含有的生物学试样的fu值(计算值)，其中，在供体溶液为人血清、受体溶液为人血清的情况下，fu2与fu1为相同值。
[0928]
ps：测定对象物质的透析膜透过清除率(固定值，1.5
×
10-4
l/h)
[0929]
记载(model、reaction、rules、definition、estimated parameters)并实施。
[0930]
reaction:
[0931]
eq1.donor1《-》eq1.acceptor1:+fu1*ps*eq1.donor1/vd1-fu1*ps*eq1.acceptor1/vd2
[0932]
eq2.donor2《-》eq2.acceptor2:+fu2*ps*eq2.donor2/vd1-fu1*ps*eq2.acceptor2/vd2
[0933]
eq2.donor2-》eq2.ad:+cl2*fu2*eq2.donor2/vd1-(koff2*eq2.ad)
[0934]
rules:
[0935]
与实施例1同样。
[0936]
definition：
[0937]
在第一个生物学试样是人血清、第二个生物学试样是人肝微粒体的情况下，将以
下4个数据作为一组用于分析。
[0938]
数据1(eq1.cd1)：供体溶液中含有人血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0939]
数据2(eq1.ca1)：供体溶液中含有人血清、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0940]
数据3(eq2.cd2)：供体溶液中含有人肝微粒体、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的供体溶液中的测定对象物质的浓度
[0941]
数据4(eq2.ca2)：供体溶液中含有人肝微粒体、受体溶液中含有人血清的平衡透析体系中的受体溶液中的测定对象物质的浓度
[0942]
estimated parameters:
[0943]
exp(fu1).initialvalue＝0.01；bounds＝[1e-05 1]；
[0944]
exp(fu2).initialvalue＝0.01；bounds＝[1e-05 1]；
[0945]
exp(koff2).initialvalue＝1；bounds＝[1e-05 10000]；
[0946]
exp(cl2).initialvalue＝0.001；bounds＝[1e-07 100]；
[0947]
exp(dose1).initialvalue＝0.2115；bounds＝[0.01 0.5]；
[0948]
exp(dose2).initialvalue＝0.2114；bounds＝[0.01 0.5]；
[0949]
将通过上述动态分析方法计算的fu(人、血清浓度1/10)用下述稀释式修正为血清浓度1/1，求出各测定对象物质的fu比(血清/微粒体)。
[0950]
稀释式
[0951]
式中，d表示稀释率，此次使用10倍稀释的血清，因此d＝10。
[0952]
得到的结果如下所示。
[0953]
[表50]
[0954] fu比(血清/微粒体)阿立哌唑0.0076地拉罗司0.0030拉帕替尼0.0060替格瑞洛0.0103酮康唑0.0116伊曲康唑0.0074rg125250.0002
[0955]
[比较例14～20]
[0956]
通过静态分析取得同一种(人)的不同生物体试样(人血清和微粒体)之间的相对fu比(测定对象物质：与实施例14～20相同)
[0957]
在通过与实施例4～13同样的方法求出fu比的情况下，作为透析反应，需要制备微粒体浓度0.1mg/ml、dmso浓度0.1％(体积比)的供体溶液及人血清浓度100％、dmso浓度0.1％(体积比)的受体溶液，但在实施例14～20的化合物是fu值很可能为0.01以下的高蛋白结合化合物、使用100％的人血清浓度的情况下(即，未用缓冲液稀释血清的情况下)，认
为难以得到平衡状态。因此，并没有对这些化合物进行利用与比较例4～13同样的方法的fu比计算。
[0958]
[参考例14～20]
[0959]
通过静态分析(相对缓冲液)取得同一种(人)的不同生物体试样(人血清和微粒体)的fu值(测定对象物质：与实施例14～20相同)
[0960]
采集经溶解的人血清，分别加入9倍量的磷酸缓冲生理盐水，对于该溶液分别加入1/1000倍量的化合物1mmol/l溶液。通过这样，制备血清浓度为10％(体积比)、dmso浓度为o.1％(体积比)的供体溶液。采集经溶解的人肝微粒体(20mg/ml)，分别加入199倍量的磷酸缓冲生理盐水，对于该溶液分别加入1/1000倍量的化合物1mmol/l溶液。通过这样，制备微粒体浓度0.1mg/ml、dmso浓度为0.1％(体积比)的供体溶液。
[0961]
[表51]
[0962][0963]
与实施例14～20同样地制备供体溶液和受体溶液，开始透析反应，测定在透析反应开始时起经过24小时的时刻的向各室添加的溶液中的测定对象物质的浓度。将得到的数据应用于参考例1的式5，取得fu值(微粒体)。另外，使用稀释式，与实施例14～20同样地，将稀释后的fu值(人、血清浓度1/10)修正为血清浓度1/1，求出fu值(人、血清浓度1/1)。
[0964]
[表52]
[0965][0966]
根据得到的fu值，求出各测定对象物质的fu比(血清/微粒体)。
[0967]
[表53]
[0968] fu比(血清/微粒体)阿立哌唑0.0033地拉罗司0.0046拉帕替尼0.0087替格瑞洛0.0065酮康唑0.0073伊曲康唑0.0041rg125250.0005
[0969]
[参考例21～27]
[0970]
基于参考例14～20的结果及fda指导的fu比的计算(测定对象物质：与实施例14～20相同)
[0971]
使用参考例14～20中取得的fu值(微粒体)和基于fda指导的各测定对象物质的fu值(血清)＝0.01的fu比(血清/微粒体)如下所示。
[0972]
[表54]
[0973] fu比(血清/微粒体)阿立哌唑0.0160地拉罗司0.0099拉帕替尼0.1972替格瑞洛0.0207酮康唑0.0091伊曲康唑0.0129rg125250.0129
[0974]
[评价例2]
[0975]
为了预测ddi风险，使用cyp3a4底物咪达唑仑作为探针化合物，求出人肝微粒体中的各化合物的抑制常数ki值。
[0976]
向经溶解的市售人肝微粒体(20mg/ml，xenotech公司制)24μl，加入0.1mol/l磷酸缓冲液3976μl，制成共计4000μl的人肝微粒体溶液(浓度o.12mg/ml)。或向市售的人肝微粒体(20mg/ml，xenotech公司制)37μl，加入0.1mol/l磷酸缓冲液5963μl，制成共计6000μl的人肝微粒体溶液(浓度0.12mg/ml)。准备浓度为最终添加浓度1000倍的稀释前测定对象化合物dmso溶液3μl，加入60％乙腈溶液87μl，制成共计90μl的测定对象化合物溶液。对于溶解50mmol/l咪达唑仑的溶液5μl，加入50％乙腈溶液70μl，制成共计75μl的溶液，对该溶液12μl，加入乙腈溶液63μl及水5925μl，制成共计6000μl的咪达唑仑溶液(浓度6.6μmol/l)。向市售的β-nadph(和光纯药)25mg加入0.1mol/l磷酸缓冲液3000μl，制成nadph溶液(10mmol/l)。将经调整的各溶液按下述顺序混合，制成抑制反应用溶液(共计100μl)，将添加nadph溶液后立即设为反应开始0分钟，在37℃边搅拌边使其反应5分钟。
[0977]
[表55]
[0978][0979]
[表56]
[0980] 抑制反应用溶液、测定对象化合物的添加浓度(μmol/l)阿立哌唑0(对照组)，0.94，1.88，3.75，7.5，15，30，60地拉罗司0(对照组)，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50，100拉帕替尼0(对照组)，1.25，2.5，5，10 20，40，80替格瑞洛0(对照组)，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50，100酮康唑0(对照组)，0.0012，0.004，0.011，0.03，0.1，0.3，0.9伊曲康唑0(对照组)，0.0014，0.004，0.012，0.04，0.11，0.33，1rg125250(对照组)，0.0823，0.247，0.741，2.22，6.67，20，60
[0981]
在代谢反应用溶液中反应后，回收35μl，与140μl的乙腈/异丙醇＝1/1溶液(含有2.5nmol/l 1-羟基咪达唑仑[13c3]和10nm华法林作为is)混合，用慢蛋白处理过滤器离心处理，将该样品作为lcms测定溶液。lcms测定溶液制作通过代谢反应生成的1-羟基咪达唑仑定量用和测定对象化合物(抑制剂)的实际浓度测定用共计2组，分别供于lcms定量分析。
[0982]
对于各测定化合物(抑制剂)，将0(对照组)下的1
‘
oh-咪达唑仑生成量设为100％，使用以下的式，求出50％抑制浓度(ic
50
)。
[0983]
ic
50
＝10
(log(b/a)
×
(50-a)/(b-a)+log(a))
[0984]
a：对照的大于50％的最近％(低浓度侧)
[0985]
b：对照的小于50％的最近％(高浓度侧)
[0986]
a：a时的化合物浓度(低浓度)
[0987]
b：b时的化合物浓度(高浓度)
[0988]
此次作为cyp3a4底物使用的咪达唑仑的添加浓度为0.33μmol/l，相对于文献中提示的km值2.06μmol/l，浓度足够低，因此求出的ic
50
直接用作ki值。(非专利文献14：takano，j.，et al.(2016).
″
the prediction of the relative importance of cyp3a/p-glycoprotein to the nonlinear intestinal absorption of drugs by advanced compartmental absorption and transit model.
″
drug metab dispos 44(11)：1808-1818.)各化合物的ki值如下所示。
[0989]
[表57]
[0990] ki值μmol/l阿立哌唑17.8地拉罗司49(最大添加浓度)以上拉帕替尼8.94替格瑞洛87(最大添加浓度)以上酮康唑0.034伊曲康唑0.023
rg125251.49
[0991]
地拉罗司和替格瑞洛没有达到显示50％抑制浓度的浓度，因此认为最大添加浓度以上的浓度为ki值。为了方便，使用最大添加浓度作为预测中使用的ki值。
[0992]
使用在上述实施例14～20、参考例14～20、参考例21～27中求出的fu比及fu值、抑制剂实验中使用的ki值，求出cyp3a4底物咪达唑仑的血中浓度-时间曲线下面积(auc)上升比(aucr)预测值，与观测值的aucr进行比较，由此预测ddi风险。
[0993]
并用抑制剂时的咪达唑仑的aucr(观测值)由非专利文献10-13引用，如下述表所示。此外，在同一剂量(dose)下有多个aucr记载的情况下，计算aucr的几何平均值，作为观测值。由于阿立哌唑和替格瑞洛的aucr没有数值记述，或者有对咪达唑仑的口服施用没有影响的记述，因此aucr(观测值)设为1。
[0994]
[表58]
[0995] 剂量(mg)cmax ng/mlaucr(观测值)阿立哌唑152421.00地拉罗司210403270.90拉帕替尼150024701.45替格瑞洛904031.00酮康唑12004681.367.13酮康唑24005877.2810.96伊曲康唑15014.111.91伊曲康唑2200163.935.05伊曲康唑3400317.525.07rg12525-110014821.09rg12525_260081861.01
[0996]
ddi预测中利用了下述应用净效应(net effect)的模型。
[0997][0998]
(非专利文献15：fda ddi guidance(2020))
[0999]
上述式中的符号的含义如下所述。
[1000][1001][1002]ki，u
[μmol/l]＝ki值
×
fu，mic
[1003]
ka为6[h-1
]，fa使用1。
[1004]
dose为各抑制剂的施用量[μmol]。
[1005]
cmax，total[μmol/l]
[1006]qent
使用了18[l/h/70kg](非专利文献16：yang，jamei et al.，2007)。
[1007]
关于fg，为了验证通过动态分析得到的fu比的预测精度，此次将1作为输入值。
[1008]
(非专利文献16：yang，j.，et al.(2007).
″
prediction of intestinal first-pass drug metabolism.
″
curr dmg metab 8(7)：676-684.)
[1009][1010]
[i]h[μmol/l](肝细胞中的抑制剂浓度)
[1011][1012]ki，u
[μmol/l]＝ki值
×
fu，mic
[1013]
ka[h-1]为6，fa，rb使用1。
[1014]
dose为各抑制剂的施用量[μmol]。
[1015]
cmax，total[μmol/l]
[1016]
fm使用0.93。
[1017]
qh使用了97[l/h/70kg](非专利文献17：yang，jamei et al.，2007)。
[1018]
(非专利文献17：yang，j.，et al.(2007).
″
misuse ofthe well-stirred model of hepatic drug clearance.
″
drug metab dispos 35(3)：501-502.)
[1019]
(非专利文献18：obach，r.s.，et al.(2006).
″
the utility of in vitro cytochrome p450 inhibition data in the prediction of drug-drug interactions.
″
j pharmacol exp ther 316(1)：336-348.)
[1020]
此外，
[1021]
[i]h/ki，u
[1022]
可以表示{f
u血清
/(f
umic
×ki
)}
×
{cmax，total+(ka×
fa×
dose/qh)
÷
rb}，对于f
u血清
/f
umic
的部分，使用fu比(血清/微粒体)。
[1023]
对于在肠道和肝中显示不可逆抑制的bg
·
bh以及显示诱导的cg
·
ch，此次认为是没有影响的抑制剂，分别将1作为输入值。
[1024]
预测得到的结果如图14-1～图14-3及下述表所示。
[1025]
[表59]
[1026]
aucr预测实施例14～20参考例14～20参考例21～27aafe1.121.171.37
[1027]
使用由本发明方法(动态分析)求出的相对fu比的ddi预测的精度，与现有方法所示的预测的精度相比优异。即，通过使用本发明的方法，可知对于难以达到平衡状态的测定对象物质也能够精度良好地取得相对fu比，能够用于ddi预测。
[1028]
产业上的可利用性
[1029]
关于基于非临床研究(使用小鼠、大鼠、狗、猴等的分析)的人药代动力学预测，各动物物种的血浆中未结合型分数(fraction unbound，fu)被认为是重要参数。
[1030]
本发明是一种能够直接检测药物的异种生物体试样之间的相对蛋白未结合型分数比(fu比)的新分析技术。通过将快速平衡透析和动态分析组合的分析体系，可以取得高准确性的fu比，通过基于血浆等中的游离体药物浓度的比，利用各动物物种的药代动力学参数，可以期待提高人药代动力学的推定精度。另外，认为是不仅对高蛋白结合率化合物，还可以对蛋白结合率从中等到非常低的化合物广泛利用的技术，可以期待作为今后的低中
分子制药研究整体中不可缺少的技术。
[1031]
例如，现状而言，作为人清除率预测方法精度最高的fcim法(非专利文献6)是通过各动物物种的清除率值及fu值的修正来预测人清除率值的方法，但对于高蛋白结合率化合物，由于难以取得fu值，因此其验证不充分。通过将由本发明得到的相对fu比应用于fcim法，可以期待能够进一步提高人清除率预测精度。
[1032]
另外，本发明不仅可以比较异种血清，还可以广泛用于异种生物体试样的fu比。例如，还可以求出肝微粒体的蛋白未结合型分数vs血清的蛋白未结合型分数(f
u mic vs fu血清的比)。由此，认为可以实现临床药物间相互作用(ddi)预测的精致化。
[1033]
美国fda的药物间相互作用的指导中要求，在具有药物代谢酶的抑制作用的药物中使用血浆中的最大血浆中未结合型药物浓度(imax，u)和未结合型抑制常数(ki，u)，用以下式预测药物间相互作用的程度。
[1034]
r1＝1+(imax,u/ki,u)
[1035]
该式可以使用最大血浆中总浓度(i
max
)、总浓度基准的抑制常数(ki)、血浆中未结合型分数(fu)、微粒体中未结合型分数(f
u，mic
)进行如下变换。
[1036]
r1＝1+(imax/ki)*(fu/fumic)
[1037]
另外，该指导考虑到蛋白结合率测定的不准确性，要求在fu小于0.01的情况下计算为fu＝0.01，由此过高评价相互作用的程度，导致必须实施本来不需要的临床药物间相互作用试验的风险。
[1038]
如果通过用本发明方法直接精致地求出fu/f
u,mic
比而能实现临床ddi预测的精致化，则跳过不需要的临床ddi试验，更快地向患者提供必要的药剂，在降低临床开发成本方面也具有高的有用性。
[1039]
符号说明
[1040]
i：透析室系统i
[1041]
ii：透析室系统ii
[1042]
m：半透膜
[1043]
a：第一生物学试样(a)
[1044]
b：第二生物学试样(b)
[1045]
1：供体侧室
[1046]
2：受体侧室
[1047]
3：测定对象物质
[1048]
4：来自第一生物学试样(a)的非特异性蛋白
[1049]
5：来自第二生物学试样(b)的非特异性蛋白
[1050]
10：供体侧室
[1051]
20：受体侧室

技术特征：
1.一种用于求出不同生物学试样之间的测定对象物质的相对未结合型分数比(相对f
u
比)的方法，其包括以下工序：(1)准备相邻室彼此被测定对象物质能够透过的半透膜隔开的室系统(i)的工序；(2)在所述室系统(i)内，在一个室(供体侧室)中添加含有第一生物学试样(a)及所述测定对象物质的供体溶液的工序；(3)在所述室系统(i)内，在与所述供体侧室不同的室(受体侧室)中添加含有第二生物学试样(b)的受体溶液的工序；(4)经时测定所述工序(2)的供体溶液和所述工序(3)的受体溶液中的所述测定对象物质的浓度的工序；以及(5)使用与在所述工序(4)中测定的测定对象物质的浓度相关的数据，计算相对f
u
比的工序。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以下工序：(6)准备相邻室彼此被使测定对象物质透过的半透膜隔开的、与所述室系统(i)不同的室系统(ii)的工序；(7)在所述室系统(ii)内，在一个室(受体侧室)中添加含有所述生物学试样(a)的受体溶液的工序；(8)在所述室系统(ii)内，在与所述受体侧室不同的室(供体侧室)中添加含有所述生物学试样(b)及所述测定对象物质的供体溶液的工序；(9)经时测定所述工序(7)的受体溶液和所述工序(8)的供体溶液中的所述测定对象物质的浓度的工序；以及(10)使用与在所述工序(9)中测定的测定对象物质的浓度相关的数据，计算相对f
u
比的工序。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述生物学试样(a)和/或(b)被缓冲液稀释。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述半透膜的分级分子量为50kda以下。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(a)中的所述测定对象物质的蛋白结合率为95％以上。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(b)中的所述测定对象物质的蛋白结合率为95％以上。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(a)是选自由微粒体级分、血液、血浆和血清组成的组中的一种。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(b)是选自由微粒体级分、血液、血浆和血清组成的组中的一种。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样是血清。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(a)来自哺乳动物。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述生物学试样(b)来自哺乳动物。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述测定对象物质的clogp为25以下。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述测定对象物质的分子量为5000以下。14.一种药物清除率的预测方法，其使用根据权利要求1至13中任一项所述的方法求出的所述f
u
比和所述生物学试样(a)或所述生物学试样(b)中任一者来源的种中的药物清除率数据，预测另一者生物学试样来源的种中的药物清除率。15.一种药物分布容积的预测方法，其使用根据权利要求1至13中任一项所述的方法求出的所述相对f
u
比和所述生物学试样(a)或所述生物学试样(b)中的任一者来源的种中的药物分布容积数据，预测另一者生物学试样来源的种中的药物分布容积。

技术总结
本发明的课题是提供准确且短时间求出包括高蛋白结合率化合物的化合物未结合型分数(f


技术研发人员：五十岚史彦 橘达彦 山内刚 藏本诗乃 松野富美代
受保护的技术使用者：中外制药株式会社
技术研发日：2021.12.17
技术公布日：2023/7/22