进行自主机械修复的编程活体胶系统

进行自主机械修复的编程活体胶系统1.引言2.最近在生物材料和生物工程之间的接合处的研究努力已经导致探索工程化的活体材料(elm)的研究领域的出现1-3。elm可利用细胞机器的能力来合成具有不同功能性质的有用材料，并且理论上可在人造材料中重现或重构生物系统的独特的活体动态和自主特征，包括环境响应性、自愈合、自复制、重塑和适应性进化的能力1,4。因此，elm的发展代表材料性能和合成的新范式，其对未来智能和/或自主材料的设计具有重要的技术意义。迄今为止被证明的elm包括运用微生物来生产用于各种用途的功能性生物膜5-8，来制造自复制构建块(buildingbrick)9，来收获细菌纤维素产品10,11，来用作环境生物传感器12,13，来降解污染物14，和来用作用于肿瘤定位的声学报告物15，此外还有几个其它创新应用16-19。尽管有这些重要的进展，但是使当前elm适于进行按需机械操作以及适于如天然活体系统那样完成自主修复任务仍然是难以捉摸的。解决这些技术挑战需要有效且高效地利用现有技术的elm的活体动态和自主特征的策略。3.现在，由合成生物学家开发的大量工具采用日益复杂的基因回路实现细胞的稳健工程化，以感测生物输入并控制基因表达20,21。因此，来自合成生物学和材料科学的工程化工具的集成将很可能导致具有越来越复杂的动态功能性和更高自主水平的活体材料的开发。我们先前证明了活体细胞胶：这些elm包含用粘附性贻贝足蛋白工程化的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)生物膜，并且它们表现出水下粘附性和强的环境耐受性22。然而，除了考虑活体胶材料本身的性能之外，我们还受到海洋生物使用它们的蛋白粘附性材料来执行机械工作的方式的启发23,24，例如，采用沙塔蠕虫通过用蛋白粘合剂将沙子和贝壳的小块粘合在一起来建造它们复杂的管状住所的引人注目的过程(图1a)25。4.发明概述5.本发明提供关于进行按需机械操作的工程化的智能活体生物膜胶的材料和方法。通过合理地设计和组合不同的基因回路，我们开发能够完成任务的化学调节和光调节的活体胶系统，所述任务包括从溶液中捕获微球以形成活体复合涂层和光调节的空间靶向损伤修复。此外，我们展示用于自主修复的活体胶系统：在感测到从目的缺陷渗出的血液时，包含于该活体胶系统的两种细菌菌株定位至受损的部位，经由细胞-细胞通信网络通信，并且用其淀粉样蛋白胶组分堵塞渗出。所开发的方法得到工程化的活体材料(elm)，所述工程化活体材料(elm)包含用于在工业和医疗环境两者中自主修复，具有动态、自愈合和其它先前难以获得的材料性质，具有诸如杀灭河流病原体、治疗胃肠疾病和预防腐蚀的应用的智能胶。6.一方面，本发明提供一种用于进行自主机械修复的活体工程化的胶系统，所述系统包括：微生物细胞的生物膜，所述微生物细胞的生物膜包埋在细胞外基质中并且可操作地连接在可通过环境诱导的细胞-细胞通讯基因回路中以控制基因表达，所述细胞包括(a)产胶菌株，其分泌信号分子并且表达包含粘附结构域和生物膜蛋白结构域的融合蛋白，其中所述融合蛋白的表达由环境诱导剂诱导；和(b)表达酪氨酸酶的粘附增强菌株，其中所述酪氨酸酶的表达由所述产胶菌株分泌的信号分子诱导。7.在实施方案中：8.粘附结构域选自海洋生物蛋白粘附结构域(诸如贻贝足蛋白结构域或藤壶淀粉样蛋白粘附结构域)、金属结合肽/蛋白结构域、矿物质结合肽/蛋白结构域和三叶因子家族(tff)蛋白结构域；9.粘附结构域包含选自mfp3、mfp3s、mfp5、mfp8和mfp3s来源的肽的贻贝足蛋白结构域；10.生物膜选自大肠杆菌(e.coli)生物膜(基于csga)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)生物膜(基于tasa)、红茶菌(kombucha)生物膜(醋酸细菌(醋杆菌科(acetobacteraceae))和嗜高渗酵母)和酵母生物膜(基于sup35淀粉样蛋白)；11.生物膜蛋白结构域选自：tasa(枯草芽孢杆菌(b.subtilis))、csga(大肠杆菌)、psms(金黄色葡萄球菌(s.aureus))、rmbc(霍乱弧菌(v.cholera))、csga(阴沟肠杆菌(enterobactercloacae))、fapc(假单胞菌属(pseudomonasspp.))、csga(沙门氏菌属(salmonellaspp.))或pac(变异链球菌(streptococcusmutans))；12.生物膜蛋白结构域包含csga单体；13.环境诱导剂选自血液组分(例如血红素)，光(例如蓝光/红光/绿光)，热(heat)/上升的热气流(thermal)，盐/电解质浓度，ph，电子和小信号分子，诸如异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)、脱水四环素(atc)、胆汁酸或硫代硫酸盐；14.基因回路提供用于选自以下的信号的传感器，并且对选自以下的信号是环境响应性的：atc/蓝光、绿光/红光、血液/血红素、上升的热气流/热、ph、盐浓度、iptg、胆汁酸、硫代硫酸盐和电子；和/或15.微生物细胞选自：芽孢杆菌属(bacillusspp.)(例如枯草芽孢杆菌(b.subtilis))、假单胞菌属(pseudomonasspp.)(例如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))、葡萄球菌属(staphylococcusspp.)(例如金黄色葡萄球菌(s.aureus))、沙门氏菌属(salmonellassp.)(例如肠道沙门氏菌(s.enterica))、弧菌属(vibriospp.)(例如霍乱弧菌(v.cholera))、链球菌属(streptococcusspp.)(例如变异链球菌(streptococcusmutans))、肠杆菌属(enterobacterspp.)(例如阴沟肠杆菌(enterobactercloacae))、乳杆菌属(lactobacillusspp.)(例如植物乳杆菌(l.plantarum))或埃希氏菌属(escherichiaspp.)(例如大肠杆菌(e.coli))。16.一方面，本发明提供一种使用主题活体胶系统用于对机械装置或其组件的表面进行自主机械修复诸如密封缺陷的方法，所述方法包括以下步骤：在所述系统自主感测和修复缺陷的条件下，提供用所述系统涂覆的表面或将所述系统施加到表面。17.一方面，本发明提供一种使用主题活体胶用于对机械装置或其组件的表面进行自主机械修复诸如密封缺陷的方法，所述方法包括以下步骤：在所述系统自主感测和修复缺陷的条件下。18.一方面，本发明提供一种制备主题活体胶的方法，所述方法包括工程化和/或组合产胶菌株和粘附增强菌株以形成所述系统。19.本发明包括所述的具体实施方案的所有组合，如同每个组合已被着力地记述。20.附图简述21.图1.实现空间靶向或自主修复的环境响应性活体胶系统的生物启发的设计。使用环境响应性细胞胶的空间靶向或自主机械修复的示意图，所述环境响应性细胞胶由具有工程化和翻译后修饰的融合蛋白的活体生物膜系统组成，所述融合蛋白组合淀粉样蛋白纳米纤维和来自海洋贻贝的粘附肽。22.图2a-2i.化学诱导的活体胶系统及其实现的复合涂层的设计和表征。(a)显示atc诱导的活体胶系统及其集成的基因回路的设计的示意图。双菌株活体胶系统包括诱导产生csga-mfp3s和组成型产生ahl(atc接收方/csga-mfp3s+ahl发送方)的产胶菌株和受ahl诱导的核糖核酸调节子(ahl接收方/酪氨酸酶)调节的粘附增强菌株。两种菌株经由可扩散的细胞通讯信号ahl通讯。(b)tem图像、结晶紫(cv)染色和刚果红(cr)测定显示由工程化细菌在用atc诱导剂触发时产生的大量蛋白粘附组分。(c)黑色素检测和硝基四氮唑蓝(nbt)测定揭示活性酪氨酸酶由接受方菌株成功分泌。(d)用于测量纳米纤维的不对称粘附的胶体afm探针(金尖端的r＝10μm)的示意图说明。右边的图是显示标记的细菌和粘附淀粉样蛋白纳米原纤维的代表性afm图像。(e)通过金涂覆的(d＝20μm)探针测量的代表性力曲线。所有实验运行单一力模型。x轴(zsnr)表示样品表面和悬臂的静止位置之间的位移。(f)不同活体胶系统的粘附性能的比较。(g)说明活体胶系统捕获非粘性微球填料材料以形成复合涂层的用途的示意图。(h)粘附的微球的代表性荧光图像和扫描电子显微镜检查(sem)图像。(i)对atc诱导的双菌株系统和未诱导的对照在洗涤后保留的微球的量计数。23.图3a-3g.用于空间靶向损伤修复的蓝光感测活体胶系统的设计和表征。(a)说明蓝光调节的活体胶系统及其集成的基因回路的示意图。双菌株活体胶系统包含在蓝光存在下诱导产生csga-mfp3s并且组成型产生ahl(光接收方/csga-mfp3s+ahl发送方)的产胶菌株和受ahl诱导的核糖核酸调节子(ahl接收方/酪氨酸酶)调节的粘附增强菌株。两种菌株经由可扩散的细胞通讯信号ahl通讯。(b)在由编程的蓝光(470nm)调节的液体介质中活体胶的图案化生产，所述蓝光从商用数字投影仪(型号：aodian-m19，中国)发出。(c)结晶紫染色用于显现细胞胶图案。(d)曝光或没有曝光的该活体细胞胶的afm形态。(e)使用光诱导双菌株胶系统以精确的空间调节方式从溶液中捕获微球的微球图案化组装。(f)说明在对特定损伤部位曝光后活体胶实现的靶向修复系统的示意图，光感测胶系统通过表达最终将微球胶合在一起并填充裂缝中的缝隙的粘附性蛋白组分而响应。(g)使用荧光显微镜检查和扫描电子显微镜检查表征的成功修复的实践证明。24.图4a-4h.用于自主损伤修复的感测血液的活体胶系统的设计和表征。(a)说明血液诱导的活体胶系统及其集成的基因回路的示意图。活体胶系统包括两种菌株：携带血红素敏感性基因回路的快速产胶菌株，其在血液存在下诱导产生csga-mfp3s，并且组成型产生ahl(血红素接收方/csga-mfp3s+ahl发送方+csgbcefg)，和受ahl诱导的核糖核酸调节子(ahl接收方/酪氨酸酶)调节的粘附增强菌株。两种菌株经由可扩散的细胞通讯信号ahl通讯。(b)该活体胶系统的血液剂量响应。每个柱代表基于通过结晶紫染色测量的三个独立生物复制品在不同血液浓度下诱导的相对胶生物量(结晶紫染色的样品的相应数字图像在上面呈现)。(c)显示由血液触发的工程化细菌产生的大量蛋白粘附组分的tem图像。(d)用于所靶向的损伤的自主修复的示意图(包埋在受损的微流体装置内部的多孔膜)。在微流体管上特意凿出小孔(d＝1.6mm)，然后用多孔铝膜过滤器覆盖。膜上的孔(d＝400nm)将防止细菌进入微流体通道，但允许血红素分子扩散通过，因此部位特异性地触发周围细菌以产生蛋白粘附组分。(e)通过在不同血液流速(q)下运行的感测血液的活体胶系统自主实现的修复的sem图像。白色圆圈代表形成的胶涂层上的缺陷区域/部位。(f)用于评估修复效果的荧光渗漏实验。q1(2，3，4，5)是指如e中描述的在范围为10至120μl/h的不同血流下的修复。(g)显示通过两种感测血液活体胶系统实现的损伤修复的荧光渗漏实验(在10μl/h的血流下运行)和相应的sem图像(插图)。(h)两种不同类型的活体胶的爆破压力耐受性的比较。25.图5a-5d.为活体细胞胶系统构建的csga-mfps的质粒图谱。(a)显示由csga-mfps蛋白组成的atc调节的活体胶的设计的示意图。(b)atc诱导的csga-mfp3s。(c)atc-诱导的csga-mfp3。(d)atc-诱导的csga-mfp5。26.图6a-6c.通过细胞-细胞通讯基因回路实现的双菌株活体细胞胶系统的质粒图谱。(a)显示atc调节的双菌株活体胶系统的设计的示意图。(b)编码atc诱导的csga-mfp3s蛋白和ahl分子的表达的产胶菌株的质粒图谱。(c)编码ahl诱导的osmy-酪氨酸酶的表达的粘附增强菌株的质粒图谱。27.图7a-7c.通过细胞-细胞通讯基因回路实现的光调节的双菌株活体细胞胶系统的质粒图谱。(a)显示光调节的双菌株活体胶系统的设计的示意图。(b)编码蓝光调节的csga-mfp3s蛋白和ahl分子的表达的产胶菌株的质粒图谱。(c)在该系统中使用了编码ahl诱导的osmy-酪氨酸酶的表达的粘附增强菌株的质粒图谱。28.图8a-8e.通过细胞-细胞通讯基因回路实现的感测血液的双菌株活体细胞胶系统的质粒图谱。(a)显示感测血液/血红素的双菌株活体胶系统的设计的示意图。(b)编码组成型表达的chua蛋白和t7rna聚合酶的核心片段(t7核心)的pjfr-chua的质粒图谱。(c)组成型表达血红素敏感性转录阻抑物htrr和血红素诱导的σ片段的pjfr-htrr的质粒图谱。(d)编码在完整的t7rna聚合酶的严格控制下表达的重组csga-mfp3s和ahl分子的产胶菌株的质粒图谱。(e)粘附增强菌株的质粒图谱编码用于该系统的ahl诱导的osmy-酪氨酸酶的表达。注意(b)和(c)中显示的两种质粒都在感测血液的双菌株系统中被转化。29.图9.用于评估活体胶系统的粘附稳健性的爆破压力装置的设计。使用压力/流量控制器(型号：pg-mfc-8ch，precigenome，美国)在生物膜胶上施加压力，并且一旦封闭的荧光溶液从微流体通道中释放出来，就相应地记录爆破压力值。30.本发明的具体实施方案的描述31.应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且将向本领域技术人员提示根据其的各种修改或变化，并且根据其的各种修改或变化将包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用整体并入用于所有目的。32.从大肠杆菌(e.coli)胶的成功开发开始，我们合理地设计并组合了各种的基因回路以产生环境响应性活体胶系统(图1b)。我们表明，我们的活体胶系统能够可预测地实施动态的按需水下粘附，甚至完成自主修复任务。33.由于存在丰富的可用于大肠杆菌的工程化的刺激响应性基因回路21，我们最初关注于产生合适的基于大肠杆菌的活体胶以用于自动机械工作的elm系统(图1b)。先前的体外工作表明，由与贻贝足蛋白(mfp)融合的csga单体组成的卷曲淀粉样蛋白原纤维可作为强水下粘合剂起作用26。因此，我们首先测试了csga与mfp3(5.1kda)、mfp5(8.1kda)或mfp3s(5.0kda)24(表s1)的融合体是否可由大肠杆菌功能性地产生和分泌。将三种融合构建体分别导入适当的大肠杆菌宿主菌株，并通过脱水四环素(atc)响应性核糖核酸调节紧密调节其相应的蛋白表达(图5a-5d)5。刚果红(cr)染色、结晶紫(cv)测定和透射电子显微镜检查(tem)成像都显示，在三种设计中，csga-mfp3s融合蛋白可被大量分泌并组装到淀粉样蛋白粘附纳米原纤维中。34.此外，原子力显微镜检查(afm)胶体探针技术27显示，与csga对照相比，csga-mfp3s生物膜显示出显著增强的粘附。由于存在贻贝来源的融合结构域，含有csga-mfp3s的重组胶在酪氨酸酶后修饰后也表现出大大改善的粘附(标准化粘附力从37.8mn/m增加到126.9mn/m)。该观察结果与先前的发现一致，即酪氨酸酶催化的酪氨酸氧化成3,4-二羟基苯丙氨酸(多巴)显著改善了淀粉样纳米原纤维的水下粘附28。由于多巴可显著改善粘附性能，因此我们将用于酪氨酸酶(melc2)表达的ahl诱导的基因构建体29工程化(与渗透诱导蛋白y(osmy)融合用以促进分泌30，并与其伴侣melc1共表达以实现全部酶功能)到同时产生csga-mfp3s融合组分的相同菌株中。然而，工程化菌株在活体胶培养条件下表现出差的粘附性并且未附着于基底。cv和cr染色进一步揭示，微生物在进行酪氨酸酶的同时表达时不能产生足够量的csga-mfp3s胶组分，可能是由于过度代谢负荷或不期望的细胞内交联。35.为了避免这些问题，我们决定通过将“粘附增强菌株”(aes)引入“产胶菌株”(gps)系统中来采用“分工”策略。设计aes用于仅在局部环境中引发酪氨酸酶的表达和分泌，在所述局部环境中来自gps细胞的粘附性纳米原纤维已经被大规模产生和定位。gps中蛋白质胶组分的产生仍然由atc调节。为了实现对酪氨酸酶产生的时间和空间控制，我们利用基于细菌luxi-luxr群体感应系统的细胞通讯基因回路31。具体地，我们向gps中添加额外的编码luxi酶的atc-诱导的构建体，其产生可扩散的细胞通讯信号ahl。将相应的luxr蛋白与lux启动子(pluxr)一起整合到aes中，当一起培养这两种菌株时，导致ahl诱导的酪氨酸酶产生(图2a、图6a-6c)。36.按照该分工策略，蛋白胶组分和酶的同时产生证明在一般培养条件下是有效的。tem、cv和cr测定都证实了成功的化学触发的淀粉样纳米原纤维胶的产生(图2b)。黑色素检测测定与氮蓝四唑(nbt)染色(样品由于多巴或多巴醌残基而变成紫色)两者一起表明在该双菌株系统中显著的酪氨酸酶活性(图2c)，与显示在条带中具有适当分子量的酶的明显产生的蛋白质印迹分析一致。酪氨酸酶的催化活性和相对表达水平随时间的增加趋势(分别经由时间依赖性酪氨酸酶活性测定和qpcr评估)进一步证实了该双菌株细胞-细胞通讯系统在3天孵育期间的有效性。另外，与单独的gps系统产生的生物膜生物质的量相比，在双菌株系统中产生的生物膜生物质的量类似，暗示由aes引起的对生物膜生长的影响的水平可以忽略。随后的粘附测量(图2d)揭示，在培养物中包含配对的粘附增强菌株使标准化的粘附力(力/半径，f/r)升高到56.6mn/m。相比之下，没有其配对菌株的csga-mfp3s菌株和未诱导的双菌株系统分别具有38.1mn/m和接近0mn/m的粘附力值(图2e、2f)。当在没有其配对的粘附增强菌株的情况下培养时，该菌株的相应较低的值表明酪氨酸酶的分泌产生了一些粘附强度的改善。37.在开发基于大肠杆菌的产胶系统后，我们接着试图部署菌株以在检测环境刺激物后完成特异性粘附任务。最初，我们的目的是使用细菌从溶液中捕获漂浮的微球以产生活体复合涂层。我们在显微镜载玻片上将两种菌株与发射绿色荧光的微球(d＝14μm)一起培养，并添加诱导剂以触发胶的产生(图2g)。在冲洗载玻片以洗去未粘附的球体之后，荧光显微镜检查结果揭示，atc诱导的胶已将一批复杂且致密的微球捕集到玻璃表面，而对照(未诱导的样品)保留很少的残余物(图2h)。值得注意的是，即使在以100ml/min的水流速用水洗涤12小时后，该粘附仍持续，其中大多数目标保持附着(图2i)。可以想象，根据工程化的微生物和捕获的微球的功能性质，所得的活体复合涂层可以作为功能涂层应用于各种应用。例如，具有粘附和其它功能特征(即促进矿化或病毒裂解能力)的工程化的微生物可潜在地应用于生物介导的土壤改良32、居住建筑物建造9和河流病原体处理33。此外，假定捕获的微球可进一步用新的官能团修饰或甚至用其它功能纳米材料，诸如金属-有机框架34和无机功能颗粒35代替，这样的复合涂层可以在生物催化、人工光合作用和生物医学中找到广泛的应用。38.除了化学诱导和表面涂层，我们接下来开发了用于基于对光的响应性来精确地制造活体胶和活体复合涂层的空间控制系统。注意到蓝光照射(470nm)对微生物生长导致的影响可忽略，因此我们用公知的用于蓝光调节的基因表达的pdown系统代替atc诱导的基因回路(图3a、图7a-7c)36。将新菌株在m63培养基中共培养后，我们将培养液选择性地暴露于从标准led投影仪发射的蓝光图案(龙和凤的中国文化符号)(图3b)。我们发现这些微生物如所设计的那样工作，并且仅在用蓝色波长(470nm)光照射的区域处产生胶涂层，在cv染色(图3c)之后或在通过基于“nta-金属-his”配位化学37的分子识别与发射红色荧光的量子点完全结合之后显示清楚限定的图案。afm图像，以及基于cv和cr测定的定量生物质评估揭示，仅照射的样品区域显示大量的纳米原纤维，与具有少量蛋白产物的未暴露区域形成鲜明对比(图3d)。我们还进行了类似的实验，包括活体胶实现的液体介质中的那些漂浮的微球体的捕获，并且再次观察到包含细菌-球体混合涂层的高度空间分辨的图案(图3e)。39.已经证明了我们的光调节的胶可以可预测地实施动态水下粘附以在基底上形成空间分辨的图案，我们接下来探索使用该活性材料用于活性的、空间靶向的损伤修复工作的潜力(图3f)。为此，我们首先将细菌与荧光微球一起孵育到培养皿上划出的约6cm长的破损沟槽(100μm宽和50μm高)中。理论上，在暴露于被引导照射该沟槽的光后，在凹槽处被诱发的胶组分应将发射荧光的物质结合在一起，从而在空间上填满该间隙。实际上，荧光显微镜检查揭示在沟槽区域中的荧光信号比非照射区域强得多(图3g)。关于损伤修复，sem显示与原始沟槽相比，曝光区域含有许多胶组分，其使微球彼此聚集并聚集到基底表面，从而将它们保持在适当位置并填充损伤部位(图3g)。40.天然的活体生物体可以自我产生，甚至拥有自主修复的特征。在活体系统的生物自主性的启发下，我们接下来转向构建活体胶实现的可以感测血液(即血红素配位复合物)并通过修复微流体装置通道内的血液渗出部位来响应的自主修复系统。该系统目的在于使用于胃肠出血的治疗概念化。我们在我们的血液诱导的活体胶系统中保持了双菌株分工策略。然而，为了证明自修复特征，我们决定应用基因优化的大肠杆菌作为底架(chassis)(大肠杆菌jf1δcsg)，其实现在30℃以上(适于生物膜分泌的最高温度)快速表达和分泌相应的重组胶成分38。我们接下来构建了基于含有血红素转运蛋白(chua膜蛋白)和血红素敏感性转录阻抑物htrr39的血液活化基因网络的血液响应性基因回路并将其转化到宿主菌株中。该产胶细胞组成型表达了chua蛋白以确保血红素分子可有效转运至细胞中以与htrr相互作用，从而激活t7聚合酶并触发下游粘附蛋白组分的表达和分泌。此外，gps也组成型产生了ahl信号，ahl信号通过aes诱导了酪氨酸酶表达和分泌(图4a、图8a-8e)。接下来，我们通过改变不同的血液浓度进行实验以测试该血液诱导的胶系统的敏感性。cv和cr测定都揭示这些活体胶质材料能被低至百万分之十份(10ppm)水平的血液触发。它们在高于50ppm血液时达到最大产量(图4b)，如通过tem观察到的，显示围绕单个细胞的大量纳米原纤维(图4c)。值得注意的是，在不存在血液的情况下生长的细菌样品表现出几乎没有纳米原纤维形成(图4c)，暗示我们的操作系统的严谨性。41.已经确立了用于血液诱导的胶产生的能力，我们接下来转向开发能够自主损伤修复的活体系统。追求该想法，我们设计了一种实验装置以基于微流体装置和红细胞来模拟轻微受损的出血血管组织(图4d)。微流体装置的通道的尺寸为2.0cm长、200μm宽和80μm高，并且连接到输入和输出管道，可以通过该输入和输出管道泵送马血。对于损伤部位，我们在微流体通道中创建了小洞(d＝1.6mm)，然后用含有孔(每个孔的d＝400nm)网络的氧化铝膜覆盖小洞。考虑到孔尺寸，我们预期该受损装置将能够使血红素渗到培养基中，在所述培养基中培养血液感测菌株和配对的粘附增强菌株。理想地，工程化菌株将主动定位于损伤部位，并且堵塞模拟的破裂部位的所有400nm孔(图4d)。42.当被(以血流，q＝10μl/小时)泵送马血的微流体装置被浸入双菌株培养液中时，发现在渗出的膜表面上成功地触发了活体胶产生。如sem所揭示的(图4e)，活体胶填充在孔中并形成了覆盖受损部位的稳健涂层。相比之下，在对照组(在相同培养溶液下没有泵送血液修复的微流体装置)中，渗出部位的膜表面仅被少量细菌污染。因此，sem结果清楚地表明，当暴露于渗出的血液后，活体胶的修复效果显著。为了进一步评估血液流速是否会影响涂层形态和修复效果，我们在范围从10至120μl/小时的不同流量下进行类似的修复实验。我们发现，尽管在所有情况下发生涂层形成，但当血流超过60μl/小时，在涂层表面上增加量的涂层缺陷开始出现，这可能归因于局部阻碍细菌聚集和生物膜形成的较高流动压力(图4e)。43.接下来，我们在胶介导的自主修复之前和之后进行渗出实验以评价密封的稳健性。为了定量检测，我们使用了cy3分子作为荧光标记物：cy3具有特定的线性浓度-荧光关系，并且具有与血红素相似的分子量(mw＝616.5)。将50μmcy3溶液以快速流速(250μl/小时)泵送通过破损的并随后修复的微流体装置。定期(以每10分钟间隔)测量在周围溶液中的pbs缓冲液中的cy3的荧光强度。渗漏实验表明，发现荧光泄漏与在超过60μl/小时的血流下运行的那些活体胶修复样品相关(图4f)，与前述sem观察结果一致，显示一旦血流超过60μl/小时，则在多孔损伤部位上开始形成涂层缺陷(图4e)。因此，这些结果证明我们的血液感测活体胶可以在低和中等血流速度下成功地进行自主修复工作。44.为了证实aes是否将确实增强我们的双菌株活体胶系统中的修复效果，我们在单独的gps的存在下(在10μl/小时的血流下)进行了用于出血诱导修复的另外的测试。sem形态表征和荧光渗漏测试表明，与双菌株胶系统(gps+aes)类似，单独的gps能够在损伤部位的多孔表面上形成致密的生物膜材料，并且能够阻断荧光染料溶液的渗漏(图4g)。然而，双菌株体系的粘附性能和爆破压力耐受性均优于单独gps系统的粘合性能和爆破压力耐受性。具体地，如通过afm胶体探针技术所测量的，双菌株胶系统表现出比单独gps系统的粘附能(2.64±0.36mj/m2)显著更高水平的粘附能(4.38±0.36mj/m2)。对于爆破压力耐受性测试(图9)，双菌株胶系统可以耐受约385±30pa的压力，与单独gps系统的低得多的耐压性(184±11pa)形成鲜明对比(图4h)。总之，这些结果再次证实我们的活体胶设计的分工策略的有效性，并且还表明出血诱导的胶系统中aes的存在增强了gps在粘附强度和机械稳健性方面的性能。尽管双菌株系统具有这些优点，但是在不使用酪氨酸酶和因此高cu2+浓度的情况下运行的更生物相容的单独gps系统可能是对于不需要更高机械性质的体内应用的更好选择。45.先前的研究表明，藤壶淀粉样粘合剂的固化可以被认为是特定的伤口愈合过程，其中纳米原纤维组装和交联成网络与血液凝固具有相似性40。类似地，我们的生物启发的活体胶在某种程度上模拟了天然的血液凝固过程41：血液感测细菌首先感测并迁移到受损部位上以形成弱的栓塞(类似于血小板栓子的形成)，然后分泌粘附的淀粉样纳米纤维胶以稳定栓塞(类似于血液凝块的形成)。我们的系统可以借鉴生物学来设计甚至更智能和更有效的活体胶系统。例如，我们的系统中的淀粉样组分可以用纤维蛋白原来源的含rgd的蛋白结构域或肽官能化以产生更生物相容的胶。另外，通过基因控制用粘附性淀粉样纳米原纤维补充的凝血酶的分泌，可以增强胶性能。46.讨论47.对海洋生物的稳健的生物粘附系统的不断加深的理解已经显著地推进了生物启发粘合剂的发展，包括各种基于小分子的、聚合物的和蛋白质的粘合剂42-46。尽管它们具有令人印象深刻的粘附性能，但这样的生物启发的粘合剂缺乏激发它们的天然粘合剂系统的“活体”属性。进一步地，我们先前证明了具有再生能力和环境耐受性的枯草芽孢杆菌生物膜胶22。然而，该活体胶没有像海洋粘合剂系统那样利用活体系统的全部潜能以自主地响应环境刺激。这里，我们已经开发了作为一种新型粘合剂的环境响应性活体胶系统，其可以执行各种按需机械操作任务，包括从溶液中捕获非粘性微球以形成活体复合涂层和以空间受控的方式进行靶向修复。此外，我们显示了这些系统可被编程以通过自主地感测刺激(血液)和修复微流体装置中的渗漏孔来进行粘附修复。48.参考文献49.1.nguyen,p.q.,courchesne,n.d.,duraj-thatte,a.,praveschotinunt,p.&joshi,n.s.(2018).engineeredlivingmaterials:prospectsandchallengesforusingbiologicalsystemstodirecttheassemblyofsmartmaterials.advmater30,e1704847.50.2.gilbert,c.&ellis,t.(2019).biologicalengineeredlivingmaterials:growingfunctionalmaterialswithgeneticallyprogrammableproperties.acssynthbiol8,1-15.51.3.chen,a.y.,zhong,c.&lu,t.k.(2015).engineeringlivingfunctionalmaterials.acssynthbiol4,8-11.52.4.ball,p.(2018).syntheticbiology—engineeringnaturetomakematerials.mrsbulletin43,477-484.53.5.chen,a.y.etal.(2014).synthesisandpatterningoftunablemultiscalematerialswithengineeredcells.natmater13,515-523.54.6.nguyen,p.q.,botyanszki,z.,tay,p.k.r.&joshi,n.s.(2014).programmablebiofilm-basedmaterialsfromengineeredcurlinanofibres.natcommun5,4945.55.7.cao,y.etal.(2017).programmableassemblyofpressuresensorsusingpattern-formingbacteria.natbiotechnol35,1087-1093.56.8.huang,j.etal.(2019)programmableandprintablebacillussubtilisbiofilmsasengineeredlivingmaterials.natchembiol15,34-41.57.9.heveran,c.m.etal.(2020).biomineralizationandsuccessiveregenerationofengineeredlivingbuildingmaterials.matter2,481-494.58.10.florea,m.etal.(2016).engineeringcontrolofbacterialcelluloseproductionusingagenetictoolkitandanewcellulose-producingstrain.proceedingsofthenationalacademyofsciences113,e3431-e3440.59.11.gilbert,c.etal.(2019).livingmaterialswithprogrammablefunctionalitiesgrownfromengineeredmicrobialco-cultures.biorxiv,2019.2012.2020.882472,doi:10.1101/2019.12.20.882472.60.12.liu,x.etal.(2018).3dprintingoflivingresponsivematerialsanddevices.advmater30,1704821.61.13.tang,t.-c.etal.(2020).toughhydrogel-basedbiocontainmentofengineeredorganismsforcontinuous,self-poweredsensingandcomputation.biorxiv,2020.2002.2011.941120,doi:10.1101/2020.02.11.941120.62.14.sun,g.l.,reynolds,e.e.&belcher,a.m.(2020).usingyeasttosustainablyremediateandextractheavymetalsfromwastewaters.naturesustainability3,303-311.63.15.bourdeau,r.w.etal.(2018).acousticreportergenesfornoninvasiveimagingofmicroorganismsinmammalianhosts.nature553,86-90.64.16.gonzález,l.m.,mukhitov,n.&voigt,c.a.(2020).resilientlivingmaterialsbuiltbyprintingbacterialspores.natchembiol16,126-133.65.17.dai,z.etal.(2019).versatilebiomanufacturingthroughstimulus-responsivecell–materialfeedback.natchembiol15,1017-1024.66.18.schaffner,m.,rühs,p.a.,coulter,f.,kilcher,s.&studart,a.r.(2017).3dprintingofbacteriaintofunctionalcomplexmaterials.scienceadvances3,eaao6804.67.19.hay,j.j.etal.(2018).bacteria-basedmaterialsforstemcellengineering.advmater30,1804310.68.20.callura,j.m.,cantor,c.r.&collins,j.j.(2012).geneticswitchboardforsyntheticbiologyapplications.proceedingsofthenationalacademyofsciences109,5850-5855.69.21.meyer,a.j.,segall-shapiro,t.h.,glassey,e.,zhang,j.&voigt,c.a.(2019).escherichiacoli“marionette”strainswith12highlyoptimizedsmall-moleculesensors.natchembiol15,196-204.70.22.zhang,c.etal.(2019).engineeredbacillussubtilisbiofilmsaslivingglues.materialstoday28,40-48.71.23.stewart,r.j.,ransom,t.c.&hlady,v.(2011).naturalunderwateradhesives.jpolymscipolphys49,757-771.monitorgastrointestinalhealth.science360,915-918.88.40.dickinson,g.h.etal.(2009).barnaclecement:apolymerizationmodelbasedonevolutionaryconcepts.jexpbiol212,3499-3510.89.41.periayah,m.h.,halim,a.s.&matsaad,a.z.(2017).mechanismactionofplateletsandcrucialbloodcoagulationpathwaysinhemostasis.intjhematoloncolstemcellres11,319-327.90.42.rose,s.etal.(2014).nanoparticlesolutionsasadhesivesforgelsandbiologicaltissues.nature505,382-385.91.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技术特征：
1.一种用于进行自主机械修复的活体工程化的胶系统，所述系统包括微生物细胞的生物膜，所述微生物细胞的生物膜包埋在细胞外基质中并且可操作地连接在环境诱导的细胞-细胞通讯基因回路中以控制基因表达，所述细胞包括：产胶菌株，其分泌信号分子并表达包含粘附结构域和生物膜蛋白结构域的融合蛋白，其中所述融合蛋白的表达由环境诱导剂诱导；以及表达酪氨酸酶的粘附增强菌株，其中所述酪氨酸酶的表达由所述产胶菌株分泌的信号分子诱导。2.权利要求1所述的系统，其中所述粘附结构域选自海洋生物蛋白粘附结构域(诸如贻贝足蛋白结构域或藤壶淀粉样蛋白粘附结构域)、金属结合肽/蛋白结构域、矿物质结合肽/蛋白结构域和三叶因子家族(tff)蛋白结构域。3.权利要求1所述的系统，其中所述粘附结构域包含选自mfp3、mfp3s、mfp5、mfp8和mfp3s来源的肽的贻贝足蛋白结构域。4.权利要求1所述的系统，其中所述生物膜选自大肠杆菌生物膜(基于csga)、枯草芽孢杆菌生物膜(基于tasa)、红茶菌生物膜(醋酸菌(醋杆菌科)和嗜高渗酵母)和酵母生物膜(基于sup35淀粉样蛋白)。5.权利要求3所述的系统，其中所述生物膜选自大肠杆菌生物膜(基于csga)、枯草芽孢杆菌生物膜(基于tasa)、红茶菌生物膜(醋酸菌(醋杆菌科)和嗜高渗酵母)和酵母生物膜(基于sup35淀粉样蛋白)。6.权利要求1所述的系统，其中所述生物膜蛋白结构域选自：tasa(枯草芽孢杆菌)、csga(大肠杆菌)、psms(金黄色葡萄球菌)、rmbc(霍乱弧菌)、csga(阴沟肠杆菌)、fapc(假单胞菌属)、csga(沙门氏菌属)或pac(变异链球菌)。7.权利要求3所述的系统，其中所述生物膜蛋白结构域选自：tasa(枯草芽孢杆菌)、csga(大肠杆菌)、psms(金黄色葡萄球菌)、rmbc(霍乱弧菌)、csga(阴沟肠杆菌)、fapc(假单胞菌属)、csga(沙门氏菌属)或pac(变异链球菌)。8.权利要求1所述的系统，其中所述生物膜蛋白结构域包含csga单体。9.权利要求3所述的系统，其中所述生物膜蛋白结构域包含csga单体。10.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的系统，其中所述环境诱导剂选自血液组分(例如血红素)，光(例如蓝光/红光/绿光)，热/上升的热气流，盐/电解质浓度，ph，电子，和小信号分子，诸如异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)、脱水四环素(atc)、胆汁酸或硫代硫酸盐。11.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的系统，其中所述基因回路提供用于选自以下的信号的传感器，并且对选自以下的信号是环境响应性的：atc/蓝光、绿光/红光、血液/血红素、上升的热气流/热、ph、盐浓度、iptg、胆汁酸、硫代硫酸盐和电子。12.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的系统，其中所述微生物细胞选自：芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌)、沙门氏菌属(例如肠球菌)、弧菌属(例如霍乱弧菌)、链球菌属(例如变异链球菌)、肠杆菌属(例如阴沟肠杆菌)、乳杆菌属(例如植物乳杆菌)或埃希氏菌属(例如大肠杆菌)。13.一种使用权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的活体胶系统用于对机械装置或其组件的表面进行自主机械修复诸如密封缺陷的方法，所述方法包括以下步骤：在其中所述系统自主感测和修复缺陷的条件下，提供涂覆所述系统的表面或将所述系统施加到表面。
14.一种制备权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的活体胶系统用于对机械装置或其组件的表面进行自主机械修复诸如密封缺陷的方法，所述方法包括以下步骤：在其中所述系统自主感测和修复缺陷的条件下。15.一种制备权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的活体胶系统的方法，所述方法包括工程化和/或组合所述产胶菌株和粘附增强菌株以形成所述系统。

技术总结
一种用于进行自主机械修复的活体工程化的胶系统，所述系统包括微生物细胞的生物膜，所述微生物细胞的生物膜包埋在细胞外基质中并且可操作地连接在可通过环境诱导的细胞-细胞通讯基因回路中以控制基因表达。胞通讯基因回路中以控制基因表达。


技术研发人员：钟超 安柏霖 王艳怡 蒋晓宇
受保护的技术使用者：上海科技大学
技术研发日：2021.08.16
技术公布日：2023/7/22