用于免疫疗法的APC靶向单元的制作方法

用于免疫疗法的apc靶向单元
技术领域
1.本发明涉及免疫疗法，诸如癌症免疫疗法，或用于微生物感染的免疫疗法和疫苗，所述微生物感染诸如细菌或病毒感染。具体地，本发明涉及用于通过施用特异性融合多肽或编码所述融合多肽的核酸来预防或治疗癌症或微生物感染的方法和产品。


背景技术：

2.患者恶性肿瘤的治疗传统上集中于通过手术、放射疗法和/或化学疗法使用细胞毒性药物以旨在优先杀死恶性细胞而不是杀死非恶性细胞的用药方案根除/去除恶性组织。
3.除了使用细胞毒性药物之外，最近的方法集中于靶向癌细胞中的特异性生物标记物，以减少传统化学疗法产生的全身性副作用。靶向癌症相关抗原的单克隆抗体疗法已被证明在延长许多恶性病的预期寿命方面相当有效。尽管作为成功的药物，靶向癌症相关抗原或抗原的单克隆抗体本质上只能被开发成靶向已知并出现在多个患者中的表达产物，这意味着绝大多数癌症特异性抗原不能通过这种类型的疗法来解决，因为大量癌症特异性抗原仅出现在来自单个患者的肿瘤中，参见下文。
4.早在20世纪50年代末，burnet和thomas提出的免疫监视理论就提出，淋巴细胞识别并消除表现出抗原决定簇改变的自体细胞(包括癌细胞)，今天人们普遍认为免疫系统在很大程度上抑制癌变。然而，免疫监视并不是100％有效的，在寻求提高/刺激免疫系统根除癌细胞的能力的情况下，设计癌症疗法是一项持续的任务。
5.一种方法是诱导针对癌症相关抗原的免疫性，但尽管这种方法有潜力，但它与抗体疗法有相同的缺点，即只能处理有限数量的抗原。
6.即使不是全部，也有很多肿瘤表达突变。这些突变可能产生新的可靶向抗原(新生抗原(neo-antigen))，如果有可能在临床相关的时间框架内识别新生抗原及其抗原决定簇，则这些抗原潜在地在特异性t细胞免疫疗法中有用。由于目前的技术有可能对细胞基因组进行全测序，并分析改变的或新的表达产物的存在，因此有可能设计基于新生抗原的个性化疫苗。然而，迄今为止，提供满意临床结果的尝试大多数失败了。
7.自20世纪90年代初以来已经详细研究的一种疫苗接种方式是核酸疫苗接种(也称为dna疫苗接种)，其中dna以非病毒质粒的形式施用至哺乳动物的体细胞，导致质粒中包含的基因的表达；在dna疫苗接种中，编码的物质是一种或多种免疫原性多肽，一旦由体细胞产生，所述免疫原性多肽将能够诱导免疫反应。这种方法很有吸引力，因为它避免了使用昂贵的重组表达系统生产临床级纯度的蛋白质免疫原的需要。然而，已经证明很难从施用的dna中获得足够高的表达水平，以在人中产生令人满意的免疫应答。
8.抗原呈递细胞(apc)对于有效的适应性免疫应答是至关重要的，并且是在它们的表面上展示与主要组织相容性复合体(mhc)复合的抗原的细胞。所述细胞包括巨噬细胞、b细胞和树突细胞，并且向辅助t细胞呈递外来抗原。此外，病毒感染的细胞或癌细胞可以向细胞毒t细胞呈递源自细胞内部的抗原。结果，靶向抗原呈递细胞提供了诱导较佳的免疫反
应的机会。
9.对于提供针对外来作用剂(诸如微生物，包括细菌和病毒)的改善的或有效的疫苗，以及针对肿瘤细胞的疫苗，诸如抗癌疫苗，特别是可以有效地靶向细菌和病毒抗原以及新生抗原并在免疫接种的人中诱导临床上显著的免疫应答的核酸疫苗，一直存在着需求。
10.发明目的
11.本发明的实施方案的目的是提供多肽构建体以及编码所述多肽构建体的核酸分子，其具有较佳的抗微生物或抗肿瘤效应，并且所述构建体能够比已知的疫苗引起甚至更高的t细胞应答。
12.本发明的实施方案的进一步目的是提供多肽构建体以及编码所述多肽构建体的核酸分子，其被设计为引导和辅助apc摄取细菌或病毒来源的抗原单元，或癌症新生表位，任选地激活apc，接着激活细胞因子级联，从而能够提供针对癌症、细菌或病毒的非常有效的保护性免疫。
13.本发明的实施方案的进一步目的是提供使用所述多肽构建体和编码所述多肽构建体的核酸分子的方法。


技术实现要素：

14.本发明人已经设计了新的和改良的多肽构建体和编码所述多肽构建体的核酸分子，产生了新一代核酸(dna或rna)免疫疗法，诸如利用抗原呈递细胞(apc)-靶向单元的新生表位免疫疗法或靶向感染原的免疫疗法。
15.本发明人已经发现对apc的靶向可以用来增强免疫治疗效应，同时保持了新生表位疫苗的抗肿瘤活性，使得能够获得比已知的疫苗引起甚至更高的t细胞应答的较佳的抗肿瘤效应。还发现病毒抗原，诸如sars-cov-2刺突蛋白，可以成功地利用基本上相同的技术来解决。
16.因此，在第一方面，本发明涉及融合多肽，所述融合多肽包含：
17.i)至少一个抗原单元；
18.ii)至少一个抗原呈递细胞(apc)靶向单元，所述抗原呈递细胞(apc)靶向单元靶向树突细胞；
19.iii)任选地，多聚单元，诸如二聚单元，所述多聚单元提供所述融合多肽多聚化为包含两个或更多个抗原单元和两个或更多个抗原呈递细胞(apc)靶向单元。
20.在第二方面，本发明涉及表达载体，所述表达载体包含编码本发明所述的融合多肽的核苷酸序列。
21.在进一步的方面，本发明涉及至少两个表达构建体的系统，包含：i)第一表达构建体，其包含编码至少一个抗原单元的核苷酸序列，和ii)第二表达构建体，其包含编码至少一个靶向树突细胞的抗原呈递细胞(apc)靶向单元的核苷酸序列。
22.在进一步的方面，本发明涉及一种治疗特征为展现特异性疾病抗原单元的疾病的方法，所述特异性疾病抗原单元诸如未被患者中的正常细胞展现的表位，或所述表位是所述患者外源的，所述方法包括施用免疫原性有效量的包含本发明所述的融合多肽的组合物，或所述组合物包含本发明所述的至少一种表达载体、或本发明所述的至少两个表达构建体的系统，由此使所述患者中的体细胞表达所述表达载体内包含的所述核苷酸序列；所
述方法任选地进一步包括施用药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。
23.在进一步的方面，本发明涉及一种在哺乳动物患者中治疗肿瘤(诸如恶性肿瘤)或诱导治疗作用或改善针对此类肿瘤的免疫应答的方法，其中所述肿瘤展现未被所述患者中非肿瘤细胞展现的表位(新生表位)，所述方法包括施用免疫原性有效量的包含本发明所述的融合多肽的组合物，或所述组合物包含至少一种本发明所述的表达载体、或本发明所述的至少两个表达构建体的系统，由此使所述患者中的体细胞表达所述表达载体内包含的所述核苷酸序列；所述方法任选地进一步包括施用药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。
24.在进一步的方面，本发明涉及一种预防或治疗细菌或病毒感染的方法，所述细菌或病毒的特征为展现所述细菌或病毒的特异性抗原单元，和/或一组表位，所述方法包括施用免疫原性有效量的包含本发明所述的融合多肽的组合物，或所述组合物包含至少一种本发明所述的表达载体、或本发明所述的至少两个表达构建体的系统，由此使患者中的体细胞表达所述表达载体内包含的所述核苷酸序列；所述方法任选地进一步包括施用药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。优选地，所述病毒感染优选是β冠状病毒，诸如sars冠状病毒，且特别是sars-cov-2的感染，在此实施方案中，所述融合多肽可以是上面公开的那些中的任一个，其中所述抗原单元衍生自β冠状病毒。
25.在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，免疫原性有效量的组合物经肠胃外施用，诸如经由肌内途径、真皮内途径、透皮途径、皮下途径、静脉内途径、动脉内途径、鞘内途径、脊髓内途径、鞘内途径、脑室内途径、腹膜内途径、鼻内途径、阴道途径、眼内途径或肺途径施用；经由经口途径、舌下途径、经颊途径或肛门途径施用；或局部施用。
26.在一些实施方案中，药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂是水性缓冲溶液。在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液是台氏缓冲液(tyrode's buffer)。在一些实施方案中，所述台氏缓冲液具有下列组成：140mm nacl，6mm kcl，3mm cacl2，2mm mgcl2，10mm 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)ph 7.4，和10mm葡萄糖。在一些实施方案中，所述台氏缓冲液的浓度为约35％v/v。在一些实施方案中，所述水性缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液。
27.在一些实施方案中，所述方法包括施用免疫原性有效量的包含至少一种如权利要求10-15中任一项所限定的表达载体的组合物，其中所述表达载体的有效剂量为0.1μg-25mg，诸如0.5μg-20mg、5μg-15mg、50μg-10mg和500μg-8mg，尤其是约0.0001mg、约0.0005mg、约0.001mg、约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg和约8mg。
28.在一些实施方案中，所述方法包括施用免疫原性有效量的组合物，所述组合物进一步包含有效量的两亲性嵌段共聚物，所述两亲性嵌段共聚物包含聚(环氧乙烷)和聚环氧丙烷的嵌段，诸如p188。
附图说明
29.图1:图示了合适的融合多肽的一个推荐设计和编码它的dna。在此实例中，该构建体包含apc靶向单元(为ccl3或其他细胞因子/趋化因子)；二聚单元，其包含来自igg3的铰链(h1和h4)和ch3；和抗原单元，所述抗原单元是新生表位。
30.图2:图示了如图1中所示的dna疫苗的作用机制。
31.图3:图示了用于本发明所述的融合多肽设计的不同的apc靶向单元。a)图示了实施例1的构建体，而b)图示了实施例2的构建体。
32.图4:来自aldevron的pumvc4的质粒图谱。
33.细节在实施例和seq id no:29中提供。
34.图5:作为apc靶向设计的实例的pumvc4 mccl19 s16a的质粒图谱。pumvc4载体含有编码以下的插入物：kozak序列，作为apc靶向单元的鼠ccl19，来自人igg的铰链1、铰链4和ch3，接着是5个新生表位c22、c23、c38、c25、c30。
35.图6:在用和疫苗质粒接种的小鼠中肿瘤体积减小。
36.apc靶向疫苗与对照组(未处理小鼠或用空的假质粒处理的小鼠)相比较。*:p《0.05(kruskal-wallis检验)。详情参见实施例1。
37.图7:示意图显示了检测c22 mhc i多聚体。
38.图显示了在用试验性dna疫苗接种小鼠后与c22肽反应的鼠cd8+t细胞的频次。详情参见实施例1。
39.图8:在来自用和疫苗质粒接种的小鼠的t细胞中的ifn-y产生。详情参见实施例1。
40.图9:在用和疫苗质粒接种的小鼠中肿瘤体积减小。详情参见实施例2。
41.图10:示意图显示了检测c22 mhc i多聚体。
42.图显示了在用试验性dna疫苗接种小鼠后与c22肽反应的鼠cd8+t细胞的频次。详情参见实施例2。
43.图11:在来自用和疫苗质粒接种的小鼠的t细胞中的ifn-y产生。详情参见实施例2。
44.图12:在用和疫苗质粒接种的小鼠中肿瘤体积减小。详情参见实施例3。
45.图13:示意图显示了检测c22 mhc i多聚体。图显示了在用试验性dna疫苗接种小鼠后与c22肽负载的mhc i四聚体反应的鼠cd8+t细胞的频次。详情参见实施例3。
46.图14:在来自用和疫苗质粒接种的小鼠的t细胞中的ifn-y产生。详情参见实施例3。
47.图15:图示了编码本发明所述的融合蛋白的独立单元的dna设计。图示了实施例4的构建体。
48.图16:在用和疫苗质粒接种的小鼠中肿瘤体积减小。详情参见实施例4。
49.图17:示意图显示了检测c22 mhc i多聚体。图显示了在用试验性dna疫苗接种小鼠后与c22肽负载的mhc i四聚体反应的鼠cd8+t细胞的频次。详情参见实施例4。
50.图18:本发明所述的dna设计。
51.图19:用于所选择的apc靶向候选物的设计的示意性图示。
52.图20:本发明的融合蛋白的示意性图示。
53.图21:本发明的载体的质粒图谱。
54.图22:条形图，显示了在elispot测定中从脾细胞中的ifn-γ释放。
55.图23:散点图和条形图，显示了由本发明的构建体所诱导的抗体滴度。
56.图24:条形图，显示了血清的sars-cov-2中和活性之间的比较。
具体实施方式
57.dna免疫疗法或疫苗，诸如包含靶向树突细胞的apc靶向元件的dna新生表位免疫疗法预期具有较佳的效应，诸如抗肿瘤效应，并且与不采用dna技术相比可以引起更高的t细胞应答，其原因为i)引导和辅助apc摄取新生表位，和/或ii)激活apc，接着激活细胞因子级联。
58.本发明所述的融合多肽构建体包含抗原单元，诸如癌症、细菌或病毒抗原的抗原单元，诸如包含该微生物的表位的细菌或病毒抗原的抗原单元，或包含表位、新生表位、诸如未被患者中的非肿瘤细胞展现的t细胞表位的抗原单元。
59.抗原单元可以衍生自病毒或衍生自细菌。可以衍生抗原单元并且用于与本发明的融合多肽一起使用的病毒的实例包括，但不限于例如，hiv、hcv、cmv、hpv、流感病毒、腺病毒、逆转录病毒、小核糖核酸病毒、冠状病毒等。逆转录病毒抗原的非限制性实例诸如来自人免疫缺陷病毒(hiv)抗原的逆转录病毒抗原，诸如gag、pol和env基因的基因产物，nef蛋白，逆转录酶，和其他hiv成分；肝炎病毒抗原，诸如乙型肝炎病毒的s、m和l蛋白，乙型肝炎病毒的前-s抗原，和其他肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎)病毒成分，诸如丙型肝炎病毒rna；流感病毒抗原，诸如血细胞凝集素和神经氨酸酶和其他流感病毒成分；麻疹病毒抗原，诸如麻疹病毒融合蛋白和其他麻疹病毒成分；风疹病毒抗原，诸如蛋白el和e2以及其他风疹病毒成分；轮状病毒抗原，诸如vp7sc和其他轮状病毒成分；巨细胞病毒抗原，诸如包膜糖蛋白b和其他巨细胞病毒抗原成分；呼吸道合胞病毒抗原，诸如rsv融合蛋白，m2蛋白和其他呼吸道合胞病毒抗原成分；单纯疱疹病毒抗原，诸如即刻早期蛋白、糖蛋白d和其他单纯疱疹病毒抗原成分；水痘带状疱疹病毒抗原，诸如gpl、gpll和其他水痘带状疱疹病毒抗原成分；日本脑炎病毒抗原，诸如蛋白e、m-e、m-e-nsl、nsl、ns1-ns2a、80％ e和其他日本脑炎病毒抗原成分；狂犬病毒抗原，诸如狂犬病毒糖蛋白、狂犬病毒核蛋白和其他狂犬病毒抗原成分。病毒抗原的其他实例参见fundamental virology，第二版，fields，b.n.和knipe，d.m.编(raven press，new york，1991)。
60.待掺入到本发明所述的融合多肽的抗原单元可以衍生自腺病毒、逆转录病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、轮状病毒、汉坦病毒、冠状病毒、披膜病毒、黄病毒、棒状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠弧病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、痘病毒、嗜肝dna病毒或海绵状病毒。在某些具体的非限制实例中，病毒抗原是从hiv、cmv、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、流感病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、风疹病毒；呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、eb病毒、日本脑炎病毒、狂犬病毒、流感病毒和/或感冒病毒中的至少一个获得的肽。
61.术语“抗原单元”表示物质的区域，诸如，外来微生物被免疫系统的特异性识别成分(抗体、t细胞)识别的部分。
[0062]“新生表位(neo-epitope)”是一种抗原决定簇(通常是mhc i类或ii类限制性表
位)，由于缺乏编码新生表位的基因，它在个体中不作为正常体细胞的表达产物存在，但在同一个体的突变细胞(如癌细胞)中作为表达产物存在。因此，从免疫学的观点来看，新生表位真正是非自身的，尽管它是自体来源的，因此它可以被表征为个体中的肿瘤特异性抗原，其中它构成表达产物。由于是非自身的，新生表位具有能够在个体中引发特异性适应性免疫应答的潜力，其中所引发的免疫应答对含有所述新生表位的抗原和细胞是特异性的。另一方面，新生表位对个体具有特异性，因为相同的新生表位在其他个体中成为表达产物的可能性极小。因此，几个特征使新生表位与例如肿瘤特异性抗原的表位形成对比：后者通常在相同类型的多种癌症中发现(因为它们可以是活化癌基因的表达产物)和/或它们将存在于非恶性细胞中，尽管数量很少，因为相关基因在癌细胞中过度表达。
[0063]“新生肽”是这样的肽(即最多约50个氨基酸残基的聚氨基酸)，其在序列中包含本文定义的新生表位。新生肽通常是“天然的”，即新生肽的整个氨基酸序列构成可以从个体中分离的表达产物的片段，但是新生肽也可以是“人工的”，这意味着它由新生表位的序列和1或2个附接的氨基酸序列构成，其中至少一个氨基酸序列不是天然与所述新生表位相缔合的。在后一种情况下，附接的氨基酸序列可以简单地充当新生表位的运载体，或者甚至可以提高新生表位的免疫原性(例如，通过促进抗原呈递细胞对新生肽的加工，提高新生肽的生物半衰期，或者改变溶解度)。
[0064]“新生抗原(neo-antigen)”是包含新生表位的任何抗原。典型地，新生抗原将由蛋白质构成，但是取决于其长度，新生抗原也可以与新生表位或新生肽相同。
[0065]
术语“氨基酸序列”是由肽键连接的氨基酸残基在肽和蛋白质链中的顺序。序列通常以n到c末端方向列出。
[0066]
本发明所述的融合多肽构建体进一步包括至少一个抗原呈递细胞(apc)靶向单元。
[0067]
抗原呈递细胞(apc)是在它们的细胞表面上展现与主要组织相容性复合体(mhc)复合的抗原的细胞，该展现已知为抗原呈递的过程。专职抗原呈递细胞包括巨噬细胞、b细胞和树突细胞，它们将外来抗原呈递给辅助t细胞，而病毒感染的细胞(或癌细胞)可以将源自细胞内部的抗原呈递给细胞毒t细胞。抗原呈递细胞(apc)靶向单元是适合于特异性靶向这些apc的任何分子或配体，诸如通过特异性靶向apc上的不同表面分子而特异性靶向这些apc。
[0068]
根据本发明使用的合适的靶向单元包括下列各项以及对应的人序列：
[0069]
分子功能seq idmccl3apc靶向seq id no:36mccl4apc靶向seq id no:37mccl5apc靶向seq id no:38mccl19apc靶向seq id no:39mxcl1apc靶向seq id no:40mccl20apc靶向seq id no:41mccl21apc靶向seq id no:42gm-csfapc靶向seq id no:43分泌信号，小鼠血清白蛋白分泌信号seq id no:44
抗鼠dec-205fvapc靶向seq id no:45抗鼠clec9 fvapc靶向seq id no:46clec9配体apc靶向seq id no:47mflt3lapc靶向seq id no:48
[0070]
根据本发明使用的合适的靶向单元公开在下列中的任一个中：takashi sato等人，blood.2011mar 24；117(12):3286
–
3293；cagan gurer等人，blood.2008aug 15；112(4):1231
–
1239；wan-lun yan等人，immunotherapy(2017)9(4)，347
–
360；gerty schreibelt等人，blood，8march 2012，volume 119，number 10；和zhongyi yan等人，oncotarget，vol.7，no.26，may2016，p.40437。
[0071]
定义
[0072]
如本文所用，“未成熟树突细胞(imdc)”是指原始未成熟树突细胞的亚型，特征是表达一种或多种经典树突细胞表面标志物cd1a、cd11c、cd11b、cd40、hladr和主要组织相容性复合物ii类(mhc-ii)。
[0073]
如本文所用，“成熟树突细胞(mdc)”是指树突细胞的亚型，特征是表面成熟标志物诸如cd80、cd83和cd86的水平上调。
[0074]“表达构建体”在本发明上下文中是核苷酸序列，它包含必需的遗传元件，允许宿主细胞表达该表达构建体中存在的编码序列——这样，该表达构建体整合到表达载体中，典型地质粒或病毒中。表达构建体将最少包括启动子/增强子区和被起始密码子起始和被终止密码子终止的编码序列。另外，表达构建体可以包含核糖体结合位点，和转录终止序。另外，各种调控元件可以包括在表达构建体中。
[0075]
如本文所用“接头”是指适合于将两个或更多个不同的或相同的直链肽序列或亚基组装成多聚多肽的任何化合物。该术语包括在肽化学中发现有用的任何接头。由于多聚多肽或融合多肽可以以直链的方式通过标准肽键组装或连接，因此术语接头还包括“间隔肽”，也称作“间隔序列”。要理解的是接头可以用来分隔本发明的融合多肽中编码的新生表位，或接头可以用来将融合多肽的新生表位单元与融合多肽的抗原呈递细胞(apc)靶向单元分隔开。
[0076]
接头可以是“刚性的”，意指它基本上不允许它所连接的两个氨基酸序列相对于彼此自由地移动。类似地，“柔性的”接头允许通过该接头连接的两个序列相对于彼此基本上自由地移动。在含有超过一个新生表位的编码的表达构建体中，两种类型的接头都是有用的。
[0077]
可以被本发明中使用的表达载体编码的感兴趣的接头在下表中列出：
[0078]
类型名称序列柔性fsgsggga(seq id no:1)柔性flgsgggagsggga(seq id no:2)柔性fv1gsgggagsgggagsggga(seq id no:3)柔性fv2gsgggagsgggagsgggagsggga(seq id no:4)柔性fmgenlyfqsgg(seq id no:5)刚性rl1kpepkpapapkp(seq id no:6)刚性rl2aeaaakeaaaka(seq id no:7)
刚性rmsacycels(seq id no:8)柔性 sgggssgggs(seq id no:9)柔性 ggggsggggs(seq id no:10)柔性 ssgggssggg(seq id no:11)柔性 ggsggggsgg(seq id no:12)柔性 gsgsgsgsgs(seq id no:13)铰链h1elktplgdttht(seq id no:59)铰链h4epkscdtpppcprcp(seq id no:60)柔性 gggssgggsg(seq id no:70)柔性 gggss(seq id no:71)柔性 gggssgggssgggss(seq id no:72)柔性 glggl(seq id no:73)柔性 glgglaaa(seq id no:74)
[0079]
在一些实施方案中，接头是肽序列。在一些实施方案中，接头不是肽序列。在一些实施方案中，接头不是支链肽序列。
[0080]
在一些实施方案中，接头本身不包含衍生自新生表位序列和/或抗原呈递细胞(apc)靶向单元的肽序列或与该新生表位序列和/或抗原呈递细胞(apc)靶向单元相同的肽序列。
[0081]
在一些实施方案中，接头衍生自免疫球蛋白分子(ig)，诸如衍生自igg。
[0082]
在一些实施方案中，接头是铰链区或包含铰链区，诸如柔性铰链区，诸如衍生自免疫球蛋白分子(ig)，诸如衍生自igg的铰链区。
[0083]
根据本发明使用的备选的合适接头：
[0084]
分子功能seq id no:dhlx蛋白二聚化seq id no:49hmhd2(人igm)二聚化seq id no:51胶原蛋白三聚结构域三聚化seq id no:52p53合成蛋白四聚化seq id no:53t4 fibritin结构域三聚化seq id no:69
[0085]
因此，在一些实施方案中，接头包含或由衍生自igm的铰链区组成，和/或包含或由衍生自由seq id no:51编码的序列的二聚基序组成。
[0086]
在一些实施方案中，接头包含或由三聚结构域组成，诸如胶原蛋白三聚结构域，诸如衍生自由seq id no:52编码的序列的三聚结构域。
[0087]
在一些实施方案中，接头包含或由衍生自hmhd2或dhxl的二聚基序组成，任选地进一步包含铰链区，诸如本文所述的h1。
[0088]
在一些实施方案中，接头包含或由四聚结构域组成，诸如衍生自p53的结构域，诸如衍生自由seq id no:53编码的序列的四聚结构域，任选地进一步包含铰链区，诸如本文所述的h1。
[0089]
根据本发明使用的合适接头还记载于下列中的任一个中：ana alvarez-cienfuegos等人，scientific reports 2016，6:28643|doi:10.1038/srep28643；
j.sanchez-arevalo lobo等人，int.j.cancer:119，455
–
462(2006)；oliver seifert等人，protein engineering，design&selection vol.25no.10pp.603
–
612，2012；和willuda等人，the journal of biological chemistry vol.276，no.17，issue of april 27，pp.14385
–
14392，2001。
[0090]
如本文所用的“免疫原性运载体”或“药学上可接受的运载体”是这样的分子或部分，其上可以偶联免疫原或半抗原以便增强针对所述免疫原/半抗原的免疫应答或者使得能够引发针对所述免疫原/半抗原的免疫应答。在经典情况下，免疫原性运载体是相对大的分子(诸如破伤风类毒素、klh、白喉类毒素等)，其可以被融合或缀合至本身免疫原性不足的免疫原/半抗原——典型地，免疫原性运载体能够引发强烈的针对由免疫原和免疫原性运载体构成的组合物质的t-辅助淋巴细胞应答，而这反过来提供经改善的通过b-淋巴细胞和细胞毒性淋巴细胞的针对所述免疫原的应答。最近，在某种程度上不得不用所谓的通用型t-辅助表位(即被群体中大部分的hla单倍型所识别并且引发t-辅助淋巴细胞应答的较短的肽)来替代大的运载体分子。
[0091]“t-辅助淋巴细胞应答”为基于这样的肽所引发的免疫应答，所述肽能够与抗原呈递细胞中的mhc ii类分子(例如，hla ii类分子)相结合，并且作为在所述肽与呈递所述肽的mhc ii类分子之间的复合物的t-细胞受体识别的结果，刺激动物物种中的t-辅助淋巴细胞。
[0092]“免疫原”为能够在其免疫系统面对该免疫原的宿主中诱导适应性免疫应答的物质。如此，免疫原是“抗原”这一较大属类的亚组，抗原是可以被免疫系统特异性地识别(例如，当被抗体所结合时，或者备选地，当与mhc分子相结合的抗原的片段被t-细胞受体所识别时)但不一定能够诱导免疫性的物质——但是抗原总是能够引发免疫性，这意味着具有经建立的针对该抗原的记忆免疫的宿主将会发动针对该抗原的特异性免疫应答。
[0093]“半抗原”为这样的小分子，其既不能诱导也不能引发免疫应答，但是如果其被缀合至免疫原性运载体，则当免疫系统面对所述半抗原运载体缀合物后能够诱导识别该半抗原的抗体或tcr。
[0094]“适应性免疫应答”为对于面对抗原或免疫原作出响应的免疫应答，其中所述免疫应答特异于所述抗原/免疫原的抗原决定簇——适应性免疫应答的例子为抗原特异性抗体产生的诱导或者t-辅助淋巴细胞或细胞毒性淋巴细胞的抗原特异性诱导/激活。
[0095]“保护性适应性免疫应答”为作为对于用抗原进行免疫接种(人工的或天然的)的反应而在受试者中所诱导出的抗原特异性免疫应答，其中所述免疫应答能够保护所述受试者对抗所述抗原或者包括所述抗原的病理学相关作用剂的后续攻击。典型地，预防性疫苗接种旨在建立针对一种或几种病原体的保护性适应性免疫应答。
[0096]“免疫系统的刺激”意指物质或物质组合物展现出一般性的、非特异性的免疫刺激效应。许多佐剂和推定的佐剂(诸如某些细胞因子)共享刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激作用剂的结果是免疫系统增加的“警觉度”，这意味着用免疫原同时或顺次地进行免疫接种诱导了相比于单独地使用该免疫原而言显著更有效的免疫应答。
[0097]
术语“多肽”在本文上下文中旨在意指2至50个氨基酸残基的短肽、50至100个氨基酸残基的寡肽和多于100个氨基酸残基的多肽。此外，该术语还旨在包括蛋白质，即包含至少一个多肽的功能性生物分子；当包含至少两个多肽时，这些多肽可以形成复合物，共价连
4.0(www.cbs.dtu.dk/services/netmhcpan-4.0/；jurtz v等人，j immunol(2017)，ji1700893；doi:10.4049/jimmunol.1700893)。该方法基于经典ms衍生配体和pmhc亲和数据的组合进行训练。另一个例子是netmhcstabpan-1.0(www.cbs.dtu.dk/services/netmhcstabpan-1.0/；rasmussen m等人，接收于j of immunol，june 2016)。这种方法是在使用下述测定的体外pmhc稳定性测量的数据集上训练的，在所述测定中每个肽在体外合成并与mhc分子复合。该测定不涉及细胞处理，测量pmhc稳定性的环境有些人工形成。该方法总体上不如netmhcpan-4.0准确。美国专利10,055,540描述了一种使用经典ms检测配体鉴定新生表位的方法。使用类似技术的其他专利申请公开是wo2019/104203、wo2019/075112、wo2018/195357(mhc ii类特异性)和wo2017106638。最后，mhcflurry:(doi:doi.org/10.1016/j.cels.2018.05.014；https://github.com/openvax/mhcflurry)就像是在ms检测的配体数据和pmhc亲和力上训练的netmhcpan。肽-mhc ii类相互作用预测方法也在最近的出版物garde c等人，immunogenetics，doi:doi.org/10.1007/s00251-019-01122-z中公开。在该出版物中，从mhc ii类洗脱的天然加工肽被用作训练集的一部分，并且如果被验证为配体，则指定结合目标值为1，如果为阴性，则为0。
[0106]
通常，这些预测系统采用人工神经网络(ann)：ann可以识别非线性相关性：非线性相关性的量化不是一项容易的任务，因为很难通过简单的计算来计算。这主要是由于非线性相关比线性相关用需要更多的参数描述，并且可能在所有特征被综合考虑时首先出现。因此，需要考虑所有特征，以便捕捉特征之间的依赖性。
[0107]
为了进一步提高所选的编码的新生表位提供有效免疫应答的可能性，可以优选使用欧洲专利申请号：19197295.9和19197306.4(均于2019年9月13日提交)中公开的技术。这些申请公开了能够确定肽和mhc分子之间结合的稳定性的技术，以及能够确定新生表位的mhc结合的稳定性作为新生表位检测和选择的一部分的技术。简而言之，从稳定性测定中获得的数据例如被用作ann的训练集的一部分，并且ann随后可以对鉴定的肽根据它们对相关mhc分子的预测结合稳定性来进行排序。
[0108]
当对患者施用核酸疫苗时，患者体内会产生相应的基因产物(如所需的抗原)。在一些实施方案中，包含优化的重组多核苷酸的核酸疫苗载体可被递送至人以诱导治疗性或预防性免疫应答。
[0109]
质粒和其他dna载体通常更有效地将基因转移到肌肉组织。还报道了通过口服施用将dna载体递送到粘膜表面的可能性，并且dna质粒已被用于将基因直接导入肌肉以外的其他组织。dna疫苗主要通过肌内注射、基因枪递送、喷射注射(使用诸如来自pharmajet的装置等装置)或电穿孔引入动物体内；这些施用模式中的每一种都适用于本公开的方法。导入后，质粒通常保持游离体状态，没有复制。编码蛋白的表达已被证明能持续较长时间，提供对b细胞和t细胞的刺激作用。
[0110]
在确定在本文公开的治疗方法中施用的载体的有效量时，医生评估载体毒性、待治疗癌症的进展以及抗载体抗体的产生(如果有的话)。施用可以通过单次或分次剂量来完成，通常是一系列的时间间隔施用。在本文公开的方法中，在时间隔开的系列中，每次免疫的有效人剂量为0.1μg至500mg，优选表达载体的剂量为0.1μg至25mg。也就是说，在本文公开的方法的实践中，通常在人体中使用0.5μg至20mg的剂量，并且剂量通常为5μg至15mg、50μg至10mg和500μg至8毫克，并且特别感兴趣的剂量是约0.0001mg、约0.0005mg、约0.001mg、
约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg和约8mg。
[0111]
采用有效剂量的一系列免疫通常构成一系列2、3、4、5、6或更多个剂量。例如，多个(例如》6个)剂量可能是相关的，以便长时间控制恶性肿瘤，并且在这种情况下，疫苗载体中编码的新生表位的确切选择可以随着时间的推移而改变，以响应恶性细胞的基因组和蛋白质组的变化。当且如果恶性细胞产生新的新生表位时，这些新生表位可以方便地被包含作为疫苗的靶标。
[0112]
本文公开的方法中使用的疫苗包含一种或多种表达载体；例如，疫苗可以包含多个表达载体，每个表达载体能够在哺乳动物细胞中自主表达核苷酸编码区以产生至少一种免疫原性多肽。表达载体通常包括真核启动子序列，诸如强真核启动子的核苷酸序列，可操作地连接到一个或多个编码区。本文的组合物和方法可以涉及使用任何特定的真核启动子，并且多种多样的真核启动子是已知的；诸如cmv或rsv启动子。启动子相对于宿主细胞可以是异源的。所用的启动子可以是组成型启动子。所用的启动子可以包括增强子区和内含子区，以提高表达水平，诸如使用cmv启动子时的情况。
[0113]
本领域已知的许多质粒可用于生产核酸疫苗。核酸疫苗的合适实施方案采用使用质粒vr1012(vical inc.，san diego calif.)、pcmvi.ubf3/2(s.johnston，university of texas)、ptvg4(johnson等人，2006，vaccine 24(3)；293-303)、pvax1(thermo fisher scientific，见上文和下面的实施例)或pcdna3.1(invitrogen corporation，carlsbad，calif.)作为载体的构建体。
[0114]
此外，本发明所述的载体构建体有利地包含免疫刺激序列(iss)。在疫苗载体中使用这种序列的目的是增强针对编码的新生表位的t细胞应答，特别是th1细胞应答，这种应答是由掺入toll样受体tlr3、tlr7-tlr8和tlr9和/或胞质rna受体(诸如但不限于rig-1、mda5和lgp2)的激动剂的佐剂引发的(desmet等人2012.nat.rev.imm.12(7)，479-491)。
[0115]
使用iss的一种可能性是模拟细菌感染，通过用非甲基化的富含cg的基序(所谓的cpg基序)刺激激活tlr9，该基序为6个碱基，一般序列为nncgnn(其在细菌dna中的频率比在哺乳动物dna中高20倍)，或者作为直接施用的小合成dna寡核苷酸(odn)，其包含部分或全部硫代磷酸酯化主链，或者通过将cpg基序掺入dna载体主链。免疫刺激性cpg可以是dna主链的一部分，也可以集中在iss中，其中cpg序列通常位于新生表位编码序列的终止密码子和多聚腺苷酸尾编码序列之间(即iss位于终止密码子和多聚腺苷酸信号之间)。然而，由于在较长的dna分子中cpg序列发挥作用与它们的位置无关，因此它们的位置原则上可以在疫苗载体中的任何地方，只要cpg基序的存在不干扰载体表达疫苗抗原编码区的能力即可。
[0116]
如果在疫苗中作为单独的odn存在，其中odn起免疫佐剂的作用，则含有cpg基序的寡核苷酸通常通过所选择的递送技术与dna疫苗一起共同施用/配制，并且通常构成包含序列nncgnn或反向互补序列的dna的六聚体或更长的多聚体。用于此目的的有用odn可以例如从invivogen(5rue jean rodier，f-31400，toulouse，france)商购得到，该公司销售一系列a类、b类和c类odn。其实例有：
[0117]
odn1585(5
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ggggtcaacgttgagggggg-3
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[0118]
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gggggacgatcgtcgggggg-3
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[0119]
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ggggacgacgtcgtggggggg-3
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[0120]
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tccatgacgttcctgatgct-3
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[0121]
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[0122]
odn2006(5
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tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3
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[0123]
odn2007(5
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tcgtcgttgtcgttttgtcgtt-3
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[0124]
odnbw006(5
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tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3
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[0125]
odn d-sl01(5
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tcgcgacgttcgcccgacgttcggta-3
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[0126]
odn2395(5
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tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3
′
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[0127]
odn m362(5
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tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-3
′
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[0128]
odn d-sl03(5
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tcgcgaacgttcgccgcgttcgaacgcgg-3
′
)，seq id no：25
[0129]
在这12种odn中，大写的核苷酸是磷酸二酯，小写的核苷酸是硫代磷酸酯，下划线表示回文序列。
[0130]
当cpg序列存在于质粒骨架中时(从而成为“自我佐剂化的”)，根据本发明，可以存在任何数量的可能的nngcnn或nncgnn序列，其或者是相同的序列，或者是cpg基序的非相同序列，或者是可以形成茎环结构的回文序列。例如，以下cpg基序是令人感兴趣的：aacgac和gtcgtt，但也有ctcgtt和gctgtt。使用这种cpg编码序列的一个例子是商购的ptvg4疫苗载体骨架中摘录的以下序列:
…
agatctaacgacaaaacgacaaaacgacaaggcgccagatctggcgtttcgttttgtcgttttgtcgttagatct
…
(seq id no:26)，其中带下划线的核苷酸构成了存在于ptvg4质粒载体序列中的cpg。
[0131]
另一种可能性是模拟rna病毒感染，通过添加双链(ds)rna来激活tlr3，这种双链rna可以作为合成的rna寡聚物，如poly i:c(聚肌苷酸-聚胞苷酸)、poly i:cu12(尿苷取代的poly i:c)，或者是合成的rna寡核苷酸(orn)的形式；与odn方法中一样，将这些rna分子添加到疫苗中是获得佐剂效果的一种方式。备选地，dsrna可以在dna载体主链中编码，在接种疫苗后，它将被转录成rna——在这种情况下，dna疫苗因此编码免疫原性佐剂。这种方式可以包括编码长度高达100个碱基对的发夹rna的dna序列，其中该序列是非特异性的。此外，所述dna可以同时包括odn和编码已知序列的orn。因此，该dna既可以转录成能够激活tlr3和/或胞质rna受体如rig-1、mda5和lgp2的双链rna，同时包含激活tlr9的odn。包括/编码免疫刺激性cpg和dsrna的特定dna序列的例子是例如5'-ggtgcatcga tgcagggggg-3'(seq id no:27)和5'-ggtgcatcga tgcagggggg tatatatata ttgaggacag gttaagctcc ccccagctta acctgtcctt caatatata tata-3'(seq id no:28)(参考:wu等人，2011，vaccine 29(44):7624-30)。
[0132]
当iss存在于dna疫苗载体中时，将使用cpg基序激活tlr9的方法与免疫刺激rna的编码序列的存在相结合来激活tlr3和/或胞质rna受体(如rig-1、mda5和lgp2)是可能的，也是有利的；参见grossmann c等人，2009，bmc.immunology 10:43和desmet等人，2012.nat.rev.imm.12(7)，479
–
491。同样地，在疫苗中作为独立的佐剂(单独或组合)掺入orn和odn可以与在dna疫苗载体中掺入两种类型的iss相结合。
[0133]
与cpg基序的情况一样，编码免疫刺激性rna iss的dna将优选存在于终止密码子和多聚腺苷酸化信号之间，但可以存在于载体的任何部分，只要这不损害预期多肽表达产物的产生即可。
[0134]
在一些具体的实施方案中，iss包含在疫苗组合物中，并且在特定的实施方案中，
这通过掺入免疫活性和药学上可接受量的poly i:c和/或poly ic:u12来实现。poly i:c由错配的双链rna(dsrna)组成，一条链是肌苷酸的聚合物，另一条链是胞苷酸的聚合物。poly ic:u12是poly i:c的变体，其中尿苷被引入poly i:c链中。在这种情况下，这两种物质将起免疫佐剂的作用，即为本身不引起特异性适应性免疫应答，但增强针对疫苗抗原(或在本情形中，编码的抗原)的特异性适应性免疫应答的物质。
[0135]
poly i:c或poly ic:u12(诸如)将优选存在于组合物中，从而达到0.1-20毫克的有效剂量的表达载体/施用的施用剂量；也就是说，调节组合物中存在的量，以达到每次施用的这种剂量。优选地，poly i:c或poly ic:u12的施用剂量为0.2至15mg的有效剂量的表达载体/施用，诸如0.3至12mg、0.4至10mg和0.5至8mg，优选约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3.1mg、3.2mg、3.3mg、3.4mg、3.5mg、3.6mg、3.7mg、3.8mg、3.9mg和4.0mg。特别优选每次施用在0.5至2.0mg的范围内。
[0136]
在一些具体实施方案中，所述疫苗组合物可以包含两亲性嵌段共聚物，所述两亲性嵌段共聚物包含聚(环氧乙烷)和聚环氧丙烷的嵌段，诸如泊洛沙姆，即由聚氧化丙烯(聚(环氧丙烷))的中央疏水链侧接聚氧化乙烯(聚(环氧乙烷))的两条亲水链构成的非离子三嵌段共聚物。一个特别优选的两亲性嵌段共聚物是泊洛沙姆188(basf的p188)。两亲性嵌段共聚物的施用剂量可以为每次施用有效剂量的表达载体的0.2％w/v至20％w/v，诸如0.2％w/v至18％w/v、诸如0.2％w/v至16％w/v、诸如0.2％w/v至14％w/v、诸如0.2％w/v至12％w/v、诸如0.2％w/v至10％w/v、诸如0.2％w/v至8％w/v、诸如0.2％w/v至6％w/v、诸如0.2％w/v至4％w/v、诸如0.4％w/v至18％w/v、诸如0.6％w/v至18％w/v、诸如0.8％w/v至18％w/v、诸如1％w/v至18％w/v、诸如2％w/v至18％w/v、诸如1％w/v至5％w/v、诸如2％w/v至4％w/v。特别优选的是每次施用在0.5％w/v-5％w/v的范围内。
[0137]
因此，本发明所述的疫苗组合物，诸如dna疫苗组合物，可以包含药学上可接受的两亲性嵌段共聚物，所述两亲性嵌段共聚物包含聚(环氧乙烷)和聚环氧丙烷的嵌段，详细描述如下：
[0138]
所述两亲性嵌段共聚物在定义标题下进行了更普遍地描述，但是优选地两亲性嵌段共聚物是泊洛沙姆或泊洛沙胺。泊洛沙姆的性质仅略有不同，但优选泊洛沙姆407和188，尤其是泊洛沙姆188。
[0139]
当两亲性嵌段共聚物是泊洛沙胺时，优选的类型是式(peo-ppo)4-ed的连续泊洛沙胺，其中peo是聚(环氧乙烷)，ppo是聚(环氧丙烷)，ed是亚乙二胺基。这些分子获得了类似于x的形状，其中peo-ppo基团从中央亚乙二胺基突出出来。特别优选的泊洛沙胺是分别以注册商标904、704和304销售的那些泊洛沙胺。这些泊洛沙胺的特征如下：904的总平均分子量为6700，ppo单元的总平均分子量为4020，peo百分比约为40％。704的总平均分子量为5500，ppo单元的总平均分子量为3300，peo百分比约为40％；而304的总平均分子量为1650，ppo单元的总平均分子量为990，peo百分比约为40％。
[0140]
当用于本文公开的方法中时，所述两亲性嵌段共聚物在疫苗组合物中的浓度可以
优选为2-5％w/v，诸如约3％w/v。
[0141]
如在本文中所用，“peo-ppo”或“两亲性嵌段共聚物”是包含聚(环氧乙烷)(“peo”)嵌段和聚(环氧丙烷)(“ppo”)嵌段或由其组成的线性或支化共聚物。有用的peo-ppo两亲性嵌段共聚物的典型实例具有通式结构peo-ppo-peo(“泊洛沙姆”)、ppo peo ppo、(peo ppo-)4ed(“泊洛沙胺”)、和(ppo peo-)4ed(“反向泊洛沙胺”)，其中“ed”是亚乙二胺基。
[0142]“泊洛沙姆”是一种线性两亲性嵌段共聚物，由一个聚(环氧乙烷)(“peo”)嵌段偶联到一个聚(环氧丙烷)(“ppo”)嵌段偶联到一个peo嵌段上构成，即式eoa-pob-eoa的结构，其中eo是环氧乙烷，po是环氧丙烷，a是2-130的整数，b是15-67的整数。泊洛沙姆通常使用3位标识符命名，其中前2位乘以100提供ppo含量的近似分子量，其中最后一位乘以10表示peo含量的近似百分比。例如，“泊洛沙姆188”是指包含分子量≈1800(对应于b≈31ppo)的ppo嵌段和大约80％(w/w)的peo(对应于a≈82)的聚合物。然而，已知这些值在一定程度上有所不同，根据生产商数据表，诸如研究级f68和临床级p188等商业产品都是泊洛沙姆188，但它们的分子量变化很大(在7,680和9,510之间)，为这些特定产品提供的a和b值分别表示为约79和28。这反映了嵌段共聚物的异质性，意味着a和b的值是最终配方中的平均值。
[0143]“泊洛沙胺”或“连续泊洛沙胺”(以商品名市售)是x形嵌段共聚物，其带有四个peo-ppo臂，通过peo-ppo-基团中的游离oh基团和乙二胺中的伯胺基团之间的键连接到中央乙二胺，而“反向泊洛沙胺”同样是x形嵌段共聚物，其带有四个ppo-peo臂，通过ppo-peo-基团中的游离oh基团和乙二胺中的伯胺基团之间的键连接到中央乙二胺。
[0144]
核酸疫苗还可以编码包含含有新生表位的一种或多种免疫原性多肽的融合产物。质粒dna也可以使用减毒细菌作为递送系统来递送，这种方法适用于口服施用的dna疫苗。细菌用独立复制的质粒转化，该质粒在减毒细菌在宿主细胞中死亡后释放到宿主细胞的细胞质中。
[0145]
包括编码所需抗原的dna在内的dna疫苗可以以任何合适的形式引入宿主细胞，包括单独的片段、线性化质粒、环状质粒、能够复制的质粒、附加体、rna等。优选地，所述基因包含在质粒中。在某些实施方案中，质粒是表达载体。能够表达遗传物质的单个表达载体可以使用标准重组技术产生。
[0146]
施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、真皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服，以及局部、经皮，通过吸入或栓剂，或粘膜组织，诸如通过灌洗阴道、直肠、尿道、颊部和舌下组织。换言之，施用途径可以选自肠胃外途径中的任何一种，诸如通过肌内途径、真皮内途径、经皮途径、皮下途径、静脉内途径、动脉内途径、鞘内途径、髓内途径、鞘内途径、脑室内途径、腹膜内途径、鼻内途径、阴道途径、眼内途径或肺部途径；通过经口途径、舌下途径、经颊途径或肛门途径施用；或者局部施用。
[0147]
典型的施用途径包括肌内、腹膜内、真皮内和皮下注射。基因构建体可以通过包括但不限于传统注射器、无针注射装置、“微喷射轰击基因枪”或其他物理方法如电穿孔(“ep”)、“流体动力学方法”或超声波的方式施用。dna疫苗可以通过任何可用于递送dna的方法来递送，只要dna被表达并且所需的抗原在细胞中被制造即可。
[0148]
在一些实施方案中，本文公开的dna疫苗组合物通过已知的转染试剂递送或与已知的转染试剂组合递送，所述转染试剂诸如阳离子脂质体、碳氟化合物乳液、脂质螺旋体
(cochleate)、小管、金颗粒、可生物降解的微球或阳离子聚合物。脂质螺旋体运输媒介物是稳定的磷脂钙沉淀剂，由磷脂酰丝氨酸、胆固醇和钙组成；这种无毒且非炎性的转染试剂可以存在于消化系统中。可生物降解的微球包含聚合物，如聚(丙交酯-共-乙交酯)，一种可用于生产转染用的dna微胶囊的聚酯。基于脂质的微管通常由螺旋缠绕的两层脂质组成，它们的边缘相互连接而包装在一起。当使用小管时，核酸可以布置在其中心中空部分，用于递送和控制释放到动物体内。
[0149]
dna疫苗也可以通过微球输送到粘膜表面。生物粘附微球可以使用不同的技术制备，并且可以被定制以粘附到任何粘膜组织，包括在眼睛、鼻腔、泌尿道、结肠和胃肠道中发现的粘膜组织，提供了疫苗的局部和全身控制释放的可能性。将生物粘附微球应用于特定的粘膜组织也可用于局部疫苗作用。在一些实施方案中，粘膜疫苗递送的替代方法是将编码特定蛋白抗原基因的质粒dna表达载体直接施用到粘膜表面。
[0150]
公开的dna质粒疫苗是根据使用的施用方式配制的。通常，dna质粒疫苗是可注射的组合物，它们是无菌的，和/或无热原和/或无颗粒物的。在一些实施方案中，优选使用等渗制剂。通常，等渗性添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些实施方案中，等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水是优选的；一种优选的溶液是台氏缓冲液。在一些实施方案中，稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，在制剂中添加允许制剂在室温或环境温度下延长时间稳定的稳定剂，诸如lgs或其他聚阳离子或聚阴离子。
[0151]
本文公开的组合物中的第二种成分是药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂，其优选为缓冲溶液的形式。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂如基于林格氏右旋糖的补充剂等。防腐剂和抗微生物剂包括抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。优选的防腐剂包括福尔马林、硫柳汞、新霉素、多粘菌素b和两性霉素b。
[0152]
在优选的实施方案中，缓冲溶液是被称为“台氏缓冲液”的溶液，在优选的实施方案中，台氏缓冲液的组成为：140mm nacl，6mm kcl，3mm cacl2，2mm mgcl2，10mm 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)ph 7.4和10mm葡萄糖。台氏缓冲液(或替代品)的浓度通常约为35％v/v，但根据悬浮质粒的含水量，浓度可能会有很大差异——因为缓冲液是生理上可接受的，所以它可以占组合物水相的任何百分比。
[0153]
此外，在优选实施方案中，缓冲溶液是pbs，并且在优选的实施方案中，pbs的组合物组成为每1ml溶液0.28mg磷酸二氢钾、1.12mg二水合磷酸氢二钠和9.0mg氯化钠。
[0154]
可以包括额外的运载体物质，并且可以包含蛋白质、糖等。这种运载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性运载体的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水。
[0155]
本发明的具体实施方案
[0156]
如上所述，本发明涉及融合多肽，其包含：
[0157]
i)至少一个抗原单元；
[0158]
ii)至少一个抗原呈递细胞(apc)靶向单元，所述抗原呈递细胞(apc)靶向单元靶向树突细胞；
[0159]
iii)任选地，多聚单元，诸如二聚单元，所述多聚单元提供所述融合多肽多聚化为包含两个或更多个抗原单元和两个或更多个抗原呈递细胞(apc)靶向单元。
[0160]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元由至少一个表位的氨基酸序列组成或包含至少一个表位的氨基酸序列，所述至少一个表位为来自患者的肿瘤细胞的新生表位。
[0161]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元不包含来自患者的肿瘤细胞的新生表位。
[0162]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元是细菌或病毒抗原，诸如包含至少一个细菌或病毒表位的氨基酸序列的抗原单元。
[0163]
在一些实施方案中，apc靶向单元靶向成熟树突细胞(mdc)。
[0164]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元选自ccl19和ccl21，诸如人形式的ccl19和ccl21。
[0165]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元靶向受体ccr7。
[0166]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元选自ccl3、ccl4、ccl5、ccl20或xcl1，诸如人形式的ccl3、ccl4、ccl5、ccl20或xcl1。
[0167]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元靶向未成熟树突细胞(imdc)。
[0168]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元靶向选自ccr1、ccr3、ccr5、ccr6和xcr1的受体。
[0169]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元由抗体结合区组成或包含抗体结合区，所述抗体结合区具有对抗原呈递细胞上的靶表面分子诸如clec9a或dec205的特异性，诸如抗-clec9a、抗-dec205或其变体，诸如抗-clec9a fv、抗-dec205 fv。
[0170]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元所述apc靶向单元由配体组成或包含配体，所述配体诸如clec9肽配体。
[0171]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元选自xcl1、gm-csf、抗-dec-205fv、抗-clec9 fv和clec9配体。
[0172]
在一些实施方案中，所述apc靶向单元是细胞因子，诸如gm-csf、诸如结合cd116的apc靶向单元。
[0173]
在一些实施方案中，所述抗原单元通过接头连接到所述靶向单元，所述接头诸如gs接头，诸如具有氨基酸序列gsgsgsgsgs(seq id no:13)的接头，或衍生自免疫球蛋白分子(ig)诸如igg的接头，诸如通过形成链间共价键促成多聚化的接头。在一些实施方案中，所述接头是或包含铰链区，诸如ig诸如igg-衍生的铰链区，并且通过形成链间共价键，诸如二硫键促成多聚化，和/或通过形成非共价相互作用(范德华相互作用、疏水相互作用和亲水相互作用，包括极性相互作用和离子键合)促进多聚化。在一些实施方案中，接头包含羧基端c结构域(ch3结构域)，诸如ig的羧基端c结构域(cγ3结构域)，或与所述c结构域基本上同源的序列，诸如igg3的ch3结构域。在一些实施方案中，所述铰链和ch3结构域通过氨基酸gggss序列(seq id no:66)连接，诸如通过氨基酸gggss的三重复序列(即序列gggssgggssgggss；seq id no:72)。铰链和ch3结构域之间的备选连接可以经由氨基酸序列gggssgggsg(seq id no:70)。在一些实施方案中，所述接头包含二聚基序或任何其他多聚结构域，所述二聚基序或所述其他多聚结构域通过疏水相互作用参与多聚化，诸如通过ch3结构域。在一些实施方案中，所述接头包含铰链区，所述铰链区包含衍生自igg的h1+h4或h4，所述igg诸如igg2或igg3。
[0174]
在一些实施方案中，所述至少一个抗原单元由下列组成或包含下列：至少或约5个，诸如至少或约10个、至少或约15个、至少或约20个、至少或约25个和至少或约30个表位。
[0175]
在一些实施方案中，所述至少一个抗原单元包含至少一个表位，在所述肿瘤细胞或在传染性细菌或病毒中鉴定的表位/抗原中所述至少一个表位表现出高于平均值诸如前25％的mhc结合稳定性。
[0176]
在一些实施方案中，所述至少一个抗原单元是细菌或病毒抗原。
[0177]
在此类实施方案中，抗原单元可以包含衍生自β-冠状病毒(尤其是衍生自刺突蛋白)的氨基酸序列，诸如衍生自sars冠状病毒(尤其是衍生自刺突蛋白)的氨基酸序列，且优选衍生自sars-cov-2的氨基酸序列，且尤其是衍生自sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸序列。特别感兴趣(和本文例证的)实施方案要求所述氨基酸序列是来自sars-cov-2刺突蛋白的核糖体结合蛋白(rbd)。因此，在重要的实施方案中，所述氨基酸序列由下列组成或包含下列：ncbi参考序列号：yp_009724390的残基319-541或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，诸如与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
[0178]
在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白包含多聚单元，诸如二聚单元，能够形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或更高阶的多聚体。合适的多聚单元的实例在前面对可用于本发明中的接头的讨论中提供并且包括具有氨基酸序列seq id no.:seq id no:49、51、52、53和69的那些。
[0179]
本发明进一步涉及至少两个表达构建体的系统，包含：i)第一表达构建体，其包含编码至少一个抗原单元的核苷酸序列，和ii)第二表达构建体，其包含编码至少一个靶向树突细胞的抗原呈递细胞(apc)靶向单元的核苷酸序列。
[0180]
在一些实施方案中，所述第一表达构建体包含编码如根据本发明所定义的至少一个抗原单元的核苷酸序列。
[0181]
在一些实施方案中，所述第二表达构建体包含编码如根据本发明所定义的靶向树突细胞的至少一个抗原呈递细胞(apc)靶向单元的核苷酸序列。
[0182]
在一些实施方案中，所述第一表达构建体包含编码至少一个抗原单元的核苷酸序列并且进一步包含编码多聚单元(诸如二聚单元)的核苷酸序列，所述多聚单元提供所述至少一个抗原单元的多聚化。
[0183]
在一些实施方案中，所述至少两个表达构建体在相同的表达载体上表达，诸如处在两个不同的启动子的控制下。
[0184]
在一些实施方案中，所述至少两个表达构建体由至少两个不同的载体表达。
[0185]
实施例1
[0186]
对作为用于递送新生表位的apc靶向单元的趋化因子的评估
[0187]
本项研究的目的是测试本发明的apc靶向dna疫苗诱导新生肽特异性t细胞、减少肿瘤生长的能力，并监测疫苗对接种小鼠健康的影响。
[0188]
用于dna疫苗接种的质粒基于可从aldevron获得的市售pumvc4
tm
载体。
[0189]
根据制造商的文件，pumvc4
tm
是一种4479kb的质粒载体，可在大肠杆菌(e.coli)中允许进行高拷贝数复制，并在大多数哺乳动物细胞中高水平瞬时表达感兴趣的编码蛋白。该载体(见图4)包含以下元件:
[0190]
1)用于在广泛哺乳动物细胞中高水平表达的人巨细胞病毒立即早期(cmv)启动子，
[0191]
2)用于mrna的有效转录终止和多聚腺苷酸化的兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号，
[0192]
3)用于在大肠杆菌中选择的卡那霉素抗性基因，和
[0193]
4)来自氨苄青霉素抗性基因的免疫刺激序列(iss)，使得它理想的用于在体内引发免疫应答。
[0194]
pumvc4
tm
质粒的全序列在seq id no:29中给出。
[0195]
构建了用pumvc4作为主链和引导s16a中的新生表位的apc靶向单元生成的5个表达载体。用作apc靶向单元的各种趋化因子在下表中列出：
[0196]
apc靶向单元sequence id nomccl3seq id no:36mccl4seq id no:37mccl5seq id no:38mccl19seq id no:39mxcl1seq id no:40
[0197]
5个s16a新生表位首先通过对小鼠结肠癌细胞系ct26和来自balb/c小鼠的正常组织样品的全外显子组测序并通过选择仅在癌细胞中发现的肽来鉴定。在实验中，评价小鼠针对所鉴定的新生表位产生免疫应答的能力。
[0198]
如下构建pumvc4 apc靶向s16a：通过将包含apc靶向单元(seq id 36-43)的dna插入物、人igg3铰链1、铰链4和ch3结构域(seq id no:31、32和34)和经密码子优化(用于在小鼠中表达)的编码含有连续偶联的5个新生表位c22、c23、c25、c30和c38(seq id no:61-65)的肽的dna连接到pumvc4表达盒中，参见图5。作为对照，使用包含不含apc靶向单元的插入物但编码人igg3铰链1、铰链4和ch3结构域以及相同的5个新生表位c22、c23、c25、c30和c38(seq id no:61-65)的pumvc4质粒。在pumvc4 apc靶向s16a载体中，插入物还包含kozak共有序列以有效地启动翻译。在实验(也在下面的实施例中)中使用的5个新生表位氨基酸序列在下表中给出：
[0199]
肽aa序列seq id no:c22qietqqrkfkasrasilsemkmlkekrseq id no:61c23vilpqapsgpsyatylqpaqaqmltppseq id no:62c25dtlsamsnpramqvllqiqqglqtlatseq id no:63c30dgqlellaqgaldnalssmgalhalprseq id no:64c38rlhvvkllasalstnaaaltqellvldseq id no:65
[0200]
溶解在无菌水中的质粒pumvc4 mccl3 s16a、pumvc4 mccl4s16a、pumvc4 mccl5 s16a、pumvc4 mccl19 s16a、pumvc4 mxcl1s16a和(空)pumvc4各自与泊洛沙姆188(来自basf的)和台氏缓冲液混合以获得在台氏缓冲液中3％w/v泊洛沙姆188和0.05μg/μl质粒的组合物。
[0201]
与所述dna组合测试的两亲性嵌段共聚物为下面通式的p188(或在本公开中只称作kolliphor，或f 68)：
[0202][0203]
研究计划
[0204]
相对于第0天的ct26肿瘤接种，小鼠在第-16天、第-9天、第-3天、第5天和第12天接受了测试疫苗的免疫接种。每次免疫由分别在左胫骨和右胫骨注射50μl疫苗组成。在接种后的第7天，从试验动物获得用于四聚体测定中进行c22 mhc i测试的血液样品。
[0205]
6个14只小鼠的组分别接受下列疫苗组合物：
[0206]
1.pumvc4 mccl3 s16a 5μg+kolliphor
[0207]
2.pumvc4 mccl4 s16a 5μg+kolliphor
[0208]
3.pumvc4 mccl5 s16a 5μg+kolliphor
[0209]
4.pumvc4 mccl19 s16a 5μg+kolliphor
[0210]
5.pumvc4 mxcl1 s16a 5μg+kolliphor
[0211]
6.pumvc4 5μg+kolliphor
[0212]
7.未处理
[0213]
第8组未致敏小鼠(mice，即首次用于免疫的小鼠)包括5只动物。
[0214]
四聚体测定如下进行:
[0215]
产生mhc i类分子，并负载稳定肽，通过将分子暴露于紫外光，该稳定肽与c22表位交换。通过与荧光标记的链霉亲和素偶联，mhc i类分子被多聚化。为了鉴定新生肽阳性的cd8
+
t细胞，用多聚体和荧光团缀合的抗cd3、抗cd4和抗cd8抗体对细胞进行共染色。然后通过流式细胞术分析样品，并计算mhc:c22阳性cd8
+
的分数。
[0216]
为了测量t细胞激活，进行下述再刺激实验：
[0217]
脾细胞用5个包含新生肽的疫苗刺激。在脾细胞样品中，抗原呈递细胞加工新生肽并随后将它们呈递到t细胞，导致同源的cd4
+
和cd8
+
t细胞激活。激活的t细胞增加细胞因子合成，包括干扰素γ(ifn-γ)。通过elispot分析检测产生ifn-γ的t细胞。
[0218]
结果
[0219]
免疫对肿瘤生长的效应显示在图6中：对于接受5μgpumvc4 apc靶向s16a质粒载体与共聚物kolliphor的小鼠，预防性免疫导致肿瘤体积减小50-100％。与用5μg不含apc靶向s16a的pumvc4和kolliphor处理相比，在用5μg pumvc4 mccl19 s16a与kolliphor处理的组中肿瘤减小显著提高。
[0220]
在肿瘤接种后第7天时收集来自全部小鼠的全血，并用荧光团标记的c22 mhc i四聚体染色。用编码c22的pumvc4 apc靶向s16a疫苗免疫高频次地诱导c22新生肽特异性cd8
+
t细胞(平均0.3-0.6的频次)。参见图7。
[0221]
用s16a质粒免疫接种诱导能够响应于后续用新生肽刺激产生ifnγ的t细胞，而来自未用s16a免疫的动物的样品在用新生肽刺激后未展现细胞因子信号。参见图8。
[0222]
此外，dna疫苗被小鼠良好耐受；没有观察到副作用的征象，并且在整个研究期间小鼠的体重连续增加，从体重改变的增加显然可见，这指示健康和未受影响的小鼠。
[0223]
[0224][0225]
结论
[0226]
kolliphor递送的包含不同apc靶向单元和s16a新生表位的pumvc4质粒载体产生ct26抗肿瘤效应。与对照组相比，低至5μg dna的剂量导致显著高的肿瘤体积auc减小，证明apc靶向dna疫苗的高功效。s16a新生肽再刺激显示了在接受s16a质粒载体的各组间在脾细胞中的类似t细胞免疫原性谱，不依赖于apc靶向单元。
[0227]
疫苗被小鼠良好耐受；没有观察到副作用的征象，并且在整个研究期间小鼠的体重连续增加，这指示健康和未受影响的小鼠。
[0228]
实施例2
[0229]
对作为用于递送新生表位的apc靶向单元的其他趋化因子、细胞因子、fv片段和肽的评估
[0230]
在此研究中，我们希望测试其他趋化因子和细胞因子以及趋化因子家族以外的apc靶向分子，诸如识别apc上的受体的抗体或结合apc的表面受体的小肽配体，是否能够诱导新生肽特异性t细胞和减少肿瘤生长至如前一研究中所观察到的相同程度。此外，我们希望监测疫苗对接种小鼠健康的影响。
[0231]
用于dna疫苗接种的质粒基于可从aldevron获得的市售pumvc4
tm
载体。
[0232]
构建了用pumvc4作为主链和引导s16a中的新生表位的apc靶向单元生成的8个表达载体。用作apc靶向单元的各种趋化因子、fv片段和肽配体在下表中列出：
[0233]
apc靶向单元sequence id nomccl19seq id no:39mccl20seq id no:41mccl21seq id no:42mgm-csfseq id no:43抗-mdec-205fv片段seq id no:45抗-mclec-9fv片段seq id no:46clec9配体seq id no:47flt3配体seq id no:48
[0234]
研究计划
[0235]
相对于第0天的ct26肿瘤接种，小鼠在第-15天、第-8天、第-1天、第6天和第13天接受了测试疫苗的免疫接种。每次免疫由分别在左胫骨和右胫骨注射50μl疫苗组成。在接种后的第-2天和第8天，从试验动物获得用于四聚体测定中进行c22 mhc i测试的血液样品。
[0236]
9个13只小鼠的组分别接受下列疫苗组合物：
[0237]
1.pumvc4 mccl19 s16a 5μg+kolliphor
[0238]
2.pumvc4(空)5μg+kolliphor
[0239]
3.pumvc4抗mclec9 fv s16a 5μg+kolliphor
[0240]
4.pumvc4 mclec-9配体s16a 5μg+kolliphor
[0241]
5.pumvc4 mccl20 s16a 5μg+kolliphor
[0242]
6.pumvc4 mccl21 s16a 5μg+kolliphor
[0243]
7.pumvc4抗mdec-205fv s16a 5μg+kolliphor
[0244]
8.pumvc4 mflt3l s16a 5μg+kolliphor
[0245]
9.pumvc4 mgm-csf s16a 5μg+kolliphor
[0246]
第10组未致敏小鼠包括5只动物。
[0247]
实验的读数为肿瘤体积、对循环中新生表位-特异性cd8
+
t细胞和从脾分离的功能性新生表位-特异性t细胞的测量值。
[0248]
结果
[0249]
免疫对肿瘤生长的效应显示在图9中：对于接受5μg pumvc4 apc靶向s16a质粒载体与共聚物kolliphor的小鼠，与5μg pumvc4 apc和kolliphor相比，预防性免疫导致肿瘤
尺寸减小50-100％。
[0250]
在第-2天时收集来自全部小鼠的全血，并用荧光团标记的c22 mhc i四聚体染色。用编码c22的pumvc4 apc靶向s16a疫苗免疫高频次地诱导c22新生肽特异性cd8
+
t细胞(平均0.3-0.6的频次)。参见图10。该效应显著地好于不含新生肽的对照空载体(平均0.1频次以下)。
[0251]
在终点时，用全部含有s16a的质粒免疫接种诱导能够响应于后续用新生肽刺激产生ifnγ的衍生自脾的t细胞。来自未用s16a免疫的动物(空质粒和未致敏小鼠)的样品在用新生肽刺激后未展现细胞因子信号。参见图11。
[0252]
此外，dna疫苗被小鼠良好耐受；没有观察到副作用的征象，并且在整个研究期间小鼠的体重连续增加，从体重改变的增加显然可见，这指示健康和未受影响的小鼠。
[0253]
[0254][0255]
结论
[0256]
kolliphor递送的包含不同apc靶向单元和s16a新生表位的pumvc4质粒载体产生
ct26抗肿瘤效应和循环c22新生肽特异性cd8
+
t细胞。与对照组相比，低至5μg dna的剂量导致肿瘤体积减小，证明apc靶向dna疫苗的高功效。s16a新生肽再刺激显示了在接受s16a质粒载体的各组间在脾细胞中的类似t细胞免疫原性谱，不依赖于apc靶向单元。此外，dna疫苗被小鼠良好耐受，如通过实验期间的体重改变评估的那样。
[0257]
实施例3
[0258]
对用于递送新生表位的apc靶向技术的各种多聚单元的评估
[0259]
在此研究中，我们希望测试含有来自人igg3的片段以外的多聚单元的apc靶向新生表位疫苗是否能够诱导新生肽特异性t细胞和减少肿瘤生长，所述多聚单元诸如其他免疫球蛋白(ig)、合成蛋白或胶原蛋白片段。此外，我们希望监测疫苗对接种小鼠健康的影响。
[0260]
用于dna疫苗接种的质粒基于可从aldevron获得的市售pumvc4
tm
载体。
[0261]
构建了用pumvc4作为主链和作为引导s16a中的新生表位的apc靶向单元的ccl19生成的5个新表达载体。用于各个构建体的各种多聚单元在下表中列出：
[0262]
分子功能seq id no:gs接头(用于单体)无多聚化seq id no:13dhlx蛋白二聚化seq id no:49hmhd2(人igm)二聚化seq id no:51胶原蛋白xviii三聚结构域三聚化seq id no:52p53合成蛋白四聚化seq id no:53
[0263]
新dna构建体与含有igg3二聚结构域(seq id no:59、60和34)的mccl19 h1h4ch3 s16a构建体比较。参见图18和19中的概述。
[0264]
研究计划
[0265]
相对于第0天的ct26肿瘤接种，小鼠在第-14天、第-7天、第1天、第8天和第15天接受了测试疫苗的免疫。每次免疫由分别在左胫骨前肌和右胫骨前肌注射50μl疫苗组成。在接种后的第7天，从试验动物获得用于四聚体测定中进行c22 mhc i测试的血液样品。
[0266]
7个13只小鼠的组分别接受下列疫苗组合物：
[0267]
1.pumvc4(空)5μg+kolliphor
[0268]
2.pumvc4 mccl19 s16a单体5μg+kolliphor
[0269]
3.pumvc4 mccl19 h1h4ch3 s16a 5μg+kolliphor
[0270]
4.pumvc4 mccl19 h1dhlx s16a 5μg+kolliphor
[0271]
5.pumvc4 mccl19 h1p53 s16a 5μg+kolliphor
[0272]
6.pumvc4 mccl19 hmhd2 s16a 5μg+kolliphor
[0273]
7.pumvc4 mccl19 m胶原蛋白xviii s16a 5μg+kolliphor
[0274]
第8组未致敏小鼠包括4只动物。
[0275]
实验的读数为相对于第一次免疫时体重的体重改变、肿瘤体积减小、循环中新生表位-特异性cd8
+
t细胞和从脾分离的功能性新生表位-特异性t细胞的测量值。
[0276]
结果
[0277]
免疫对肿瘤生长的效应显示在图12中：对于接受5μg含有新生表位s16a的质粒载体pumvc4 mccl19组合kolliphor的所有组小鼠，与5μg空质粒和kolliphor相比，预防性免
疫导致肿瘤尺寸减小50-100％。接受含有多聚单元(为ig来源或胶原蛋白)的dna设计的组效果最佳。
[0278]
在第7天时收集来自全部小鼠的全血，并用荧光团标记的c22 mhc i四聚体染色。用编码c22的pumvc4 ccl19 s16a疫苗免疫全部产生可检测水平的c22新生肽特异性cd8
+
t细胞(平均0.3-5％的频次)。参见图13。对含igg的设计(h1h4ch3和hmhd2，平均约2％的频次)该效应最突出，对于单体和三聚体(单体和h胶原蛋白xviii，平均超过1％的频次)效应中等，显著优于合成蛋白设计(h1dhlx和h1p53，平均低于0.5％的频次)和空质粒对照。
[0279]
在终点时，用全部含s16a的质粒免疫接种诱导能够响应于后续用新生肽刺激产生ifnγ的衍生自脾的t细胞。来自未用s16a免疫的动物(空质粒和未致敏小鼠)的样品在用新生肽刺激后未展现细胞因子信号。参见图14。
[0280]
此外，dna疫苗被小鼠良好耐受；没有观察到副作用的征象，并且在整个研究期间小鼠的体重连续增加，从体重改变的增加显然可见，这指示健康和未受影响的小鼠。
[0281]
[0282][0283]
结论
[0284]
kolliphor递送的包含mccl19、不同多聚单元和s16a新生表位的pumvc4质粒载体产生50-100％的ct26抗肿瘤效应。接受具有多聚单元(为ig来源或胶原蛋白)的dna设计的
组的效应最佳。在第7天时的新生表位特异性cd8+t细胞应答对应于抗肿瘤效应，并且在终点时的功能性t细胞水平(通过ifnγ分泌测量)在接受含有新生表位的dna设计的各组间是相当的。此外，dna疫苗被小鼠良好耐受，如通过实验期间的体重改变评估的那样。
[0285]
实施例4
[0286]
对用于递送新生表位的apc靶向技术的独立单元的组合/解离的评估
[0287]
在此研究中，我们希望测试对于apc靶向新生表位疫苗，所有三个模块：apc靶向、多聚结构域和新生表位是否需要物理连接在一起作为融合蛋白产物来最佳地工作，或者是否趋化因子仅作为佐剂存在就足够以及是否新生表位的二聚体/分泌有助于抗肿瘤效应和t细胞应答。鼠ccl19用作趋化因子用于全部dna构建体。参见图15中的概述。
[0288]
用于dna疫苗接种的质粒基于可从aldevron获得的市售pumvc4
tm
载体。
[0289]
利用pumvc4作为主链生成三个新的表达载体，包含单独mccl19(seq id no:39)、单独新生表位s16a或分泌信号(secsig)、igg3的二聚结构域h1h3ch3(seq id no:59、60和34)和s16a新生表位。列举在图15中。
[0290]
新dna构建体及其组合与编码融合蛋白的mccl19 h1h4ch3 s16a构建体(下面称为mccl19 s16a二聚体)以及mccl19 s16a单体比较。
[0291]
研究计划
[0292]
相对于第0天的ct26肿瘤接种，小鼠在第-14天、第-7天、第1天、第8天和第15天接受了测试疫苗的免疫。每次免疫由分别在左胫骨前肌和右胫骨前肌注射50μl疫苗组成。在接种后的第9天，从试验动物获得用于四聚体测定中进行c22 mhc i测试的血液样品。
[0293]
8个13只小鼠的组分别接受下列疫苗组合物：
[0294]
1.pumvc4(空)10μg+kolliphor
[0295]
2.pumvc4 mccl19 s16a二聚体5μg+kolliphor
[0296]
3.pumvc4 mccl19 s16a单体
[0297]
4.pumvc4 mccl19 5μg+pumvc4 s16a 5μg+kolliphor
[0298]
5.pumvc4 mccl19 5μg+pumvc4 secsig h1h4ch3 s16a 5μg+kolliphor
[0299]
6.pumvc4 secsig h1h4ch3 s16a 5μg+kolliphor
[0300]
7.pumvc4 mccl19 5μg+kolliphor
[0301]
8.pumvc4 s16a 5μg+kolliphor
[0302]
第9组未致敏小鼠包括4只动物。
[0303]
实验的读数为相对于第一次免疫时体重的体重改变、肿瘤体积减小以及循环中新生表位-特异性cd8
+
t细胞的测量值。
[0304]
结果
[0305]
免疫对肿瘤生长的效应显示在图16中：对于接受mccl19和新生表位的所有组小鼠，无论所述组分是被编码为融合蛋白还是被编码为单独的蛋白产物，预防性免疫均导致肿瘤尺寸减小。包含secsig、h1h4ch3二聚结构域和新生表位的非靶向融合蛋白也具有显著的抗肿瘤效应，表明新生表位的分泌和二聚化提高了抗肿瘤效应。
[0306]
在第9天时收集来自全部小鼠的全血，并用荧光团标记的c22 mhc i四聚体染色。用全部包含表位c22(它是s16a的一部分)的疫苗免疫产生可检测水平的c22新生肽特异性cd8
+
t细胞(平均0.5-15％的频次)。参见图17。对融合蛋白设计(mccl19 s16a二聚体和
mccl19 s16a单体，平均为约4％的频次)该效应最突出，而单个mccl19产物与包含secsig、h1h4ch3二聚结构域和新生表位的非靶向融合蛋白的组合也产生高t细胞水平(平均超过1.5％的频次)，显著好于单个组分(mccl19和s16a，平均低于0.5％的频次)和空质粒对照的效应。
[0307]
此外，dna疫苗被小鼠良好耐受；没有观察到副作用的征象，并且在整个研究期间小鼠的体重连续增加，从体重改变的增加显然可见，这指示健康和未受影响的小鼠。
[0308]
[0309][0310]
结论
[0311]
kolliphor递送的包含mccl19、不同多聚单元和s16a新生表位的pumvc4质粒载体产生50-100％的ct26抗肿瘤效应。接受具有多聚单元(为ig来源或胶原蛋白)的dna设计的组的效应最佳。在第7天时的新生表位特异性cd8+t细胞应答对应于抗肿瘤效应，并且在终点时的功能性t细胞水平(通过ifnγ分泌测量)在接受含有新生表位的dna设计的各组间是
相当的。此外，dna疫苗被小鼠良好耐受。
[0312]
实施例5
[0313]
使用来自sars-cov-2的刺突蛋白的apc靶向
[0314]
本研究的目的是比较利用kolliphor递送的使用刺突受体结合结构域(rbd)的apc(cll19)靶向dna质粒与利用氢氧化铝佐剂化的重组rbd的性能。目标是在微中和测定中测定t细胞应答的幅度，诱导体液抗原特异性抗体应答的能力，和生成的抗体终止病毒感染细胞的能力。
[0315]
制作大量载体设计，其中p0055(见下)在本研究中进行评价。所选择的rbd通过切下氨基酸arg319至phe541取自全长sars-cov-2刺突蛋白(acc id:yp_009724390.1)。载体设计示意性地显示在图20中。
[0316]
与测试的构建体p0055相比较，已经构建了p0069，目的是增加表达水平。类似地，已经构建了p0072，目的是：1)增加表达水平，2)形成表达产物的三聚体而不是二聚体，但仍然待测试。
[0317]
p0075和p0083是对照，设计用于分别研究多聚化和ccl19靶向的效应。
[0318]
表达载体p0055在图21中作为质粒图谱显示，并作为seq id no 67列出。该质粒编码的rbd序列作为seq id no:68提供。
[0319]
动物研究详情
[0320]
小鼠在第0、7、14、21和28天接受测试dna质粒免疫。每次免疫由分别在左胫骨前肌和右胫骨前肌中肌内注射50μl dna质粒组成。重组rbd疫苗的用药方案为初次免疫20μg蛋白，接着在第14和28天时两次20μg加强免疫。每次免疫由皮下注射100μl rbd+氢氧化铝疫苗组成。在第35天处死动物。
[0321]
4组(组1-4)小鼠(分别5、7、7和5只个体)指定为下列处理：
[0322]
组1：质粒p0053
–
ptgv4-ccl19(假处理，即不含刺突蛋白的dna质粒)，25μg。
[0323]
组2：质粒p0055(即，具有靶向单元ccl19和来自刺突蛋白的rbd的dna质粒ptgv4)，25μg。
[0324]
组3：在2％铝胶中的rbd蛋白，20μg。
[0325]
组4：铝胶2％。
[0326]
读数为体重变化(基于3次每周一次的测量)和基于血液采样(在第19天和在第35天)和脾采样(在第35天)的测量值。进行的测量为测定血液中的抗-rbd igg、脾t-细胞激活(用肽再刺激的脾细胞上的ifn-γ释放elispot)以及体外对sars-cov-2的中和。
[0327]
结果
[0328]
图22显示了条形图，显现了从来自组2的小鼠的t细胞中的ifn-γ释放。t细胞用任一种肽或伴刀豆球蛋白a(cona，ifn-γ释放的阳性对照)再刺激。两个最左边的条显示了来自未刺激细胞和用无关肽刺激的细胞的释放。混合物1、2和3通过将来自rbd蛋白的肽根据下面的分布重叠而构建：
[0329]
混合物rbd1:cov2_s-319，cov2_s-325，cov2_s-331，cov2_s-337，cov2_s-343，cov2_s-349，cov2_s-355，cov2_s-361，cov2_s-367，cov2_s-373，cov2_s-379，cov2_s-385
[0330]
混合物rbd2:cov2_s-391，cov2_s-397，cov2_s-403，cov2_s-409，cov2_s-415，cov2_s-421，cov2_s-427，cov2_s-439,cov2_s-445，cov2_s-451，cov2_s-457
[0331]
混合物rbd3:cov2_s-463，cov2_s-469，cov2_s-475，cov2_s-481，cov2_s-487，cov2_s-493，cov2_s-499，cov2_s-505，cov2_s-511，cov2_s-517，cov2_s-523，cov2_s-529
[0332]
用混合物2和3刺激的细胞表现出比未刺激或用无关肽刺激的两组显著更高的ifn-γ释放。
[0333]
图23显示了对来自第35天的小鼠的血清中总rbd特异性igg的elisa测量，关于组1和组4是汇集的安慰剂处理的血清，同时测定组2和组3的各只小鼠。得到的终点滴度在图23中显示为条形图。用p0055ccl-19rbd免疫显示成功地在免疫小鼠中在细胞外表达rbd蛋白，得到了强效体液反应，因为所达到的抗体滴度与重组刺突rbd与氢氧化铝达到的滴度相当。
[0334]
最后，图24显示了条形图，显现了4个测试组中的抗体和来自康复期患者血清的抗体的中和效应。清楚可见，来自组2的小鼠产生的抗体与组3和康复期患者产生的抗体的中和效力相当。这支持了利用刺突蛋白或其片段进行apc靶向的应用。
[0335]
结论
[0336]
本发明的构建体使用刺突rbd设计诱导了强t细胞应答。此外，利用本发明所述的刺突rbd设计能够诱导与重组刺突rbd+2％铝剂(alum)相同幅度的体液应答。最后，诱导的抗体滴度显示与康复期患者血清相当的中和效力。
[0337]
本发明所述的apc靶向单元：
[0338]
[0339][0340]
序列：
[0341]
seq id no:1:
[0342]
gsggga
[0343]
seq id no:2:
[0344]
gsgggagsggga
[0345]
seq id no:3:
[0346]
gsgggagsgggagsggga
[0347]
seq id no:4:
[0348]
gsgggagsgggagsgggagsggga
[0349]
seq id no:5:
[0350]
genlyfqsgg
[0351]
seq id no:6:
[0352]
kpepkpapapkp
[0353]
seq id no:7:
[0354]
aeaaakeaaaka
[0355]
seq id no:8:
[0356]
sacycels
[0357]
seq id no:9:
[0358]
sgggssgggs
[0359]
seq id no:10:
[0360]
ggggsggggs
[0361]
seq id no:11:
[0362]
ssgggssggg
[0363]
seq id no:12:
[0364]
ggsggggsgg
[0365]
seq id no:13:
[0366]
gsgsgsgsgs
[0367]
seq id no:14:
[0368]
ggggtcaacgttgagggggg
[0369]
seq id no:15:
[0370]
gggggacgatcgtcgggggg
[0371]
seq id no:16:
[0372]
ggggacgacgtcgtggggggg
[0373]
seq id no:17:
[0374]
tccatgacgttcctgatgct
[0375]
seq id no:18:
[0376]
tccatgacgttcctgacgtt
[0377]
seq id no:19:
[0378]
tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
[0379]
seq id no:20:
[0380]
tcgtcgttgtcgttttgtcgtt
[0381]
seq id no:21:
[0382]
tcgacgttcgtcgttcgtcgttc
[0383]
seq id no:22:
[0384]
tcgcgacgttcgcccgacgttcggta
[0385]
seq id no:23:
[0386]
tcgtcgttttcggcgcgcgccg
[0387]
seq id no:24:
[0388]
tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat
[0389]
seq id no:25:
[0390]
tcgcgaacgttcgccgcgttcgaacgcgg
[0391]
seq id no:26:
[0392]
agatctaacgacaaaacgacaaaacgacaaggcgccagatctggcgtttcgttttgtcgttttgtcgttagatct
[0393]
seq id no:27:
[0394]
ggtgcatcga tgcagggggg
[0395]
seq id no:28:
[0396]
ggtgcatcga tgcagggggg tatatatata ttgaggacag gttaagctcc ccccagctta acctgtccttcaatatata tata
[0397]
seq id no:29:载体主链；来自aldevron的pumvc4a
[0398]
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccg
ggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcatgctatactgtttttggcttggggtctatacacccccgcttcctcatgttataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactccaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcacgtgggcccggtaccgtatactctagagcggccgcggatccagatctttttccctcgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttatttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatcagtatttggtttagagtttggcaacatatgccattcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccagggcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttag
tctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccccccccccccattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcagattggctat
[0399]
seq id no:30:增强子，起始kozak序列，不含atg
[0400]
cgccgccacc
[0401]
seq id no:31:二聚体铰链1，人igg3
[0402]
gagctcaaaaccccacttggtgacacaactcacaca
[0403]
seq id no:32:二聚体铰链4，人igg3
[0404]
gagcccaaatcttgtgacacacctcccccgtgcccaaggtgccca
[0405]
seq id no:33:二聚体gly-ser接头
[0406]
ggcggtggaagcagcggaggtggaagtgga
[0407]
seq id no:34:二聚体ch3，人igg3
[0408]
ggacagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcagcgggcagccggagaacaactacaacaccacgcctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacatcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgcttcacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
[0409]
seq id no:35:二聚体gly-leu接头
[0410]
ggcctcggtggcctg
[0411]
seq id no:36:apc靶向mccl3
[0412]
atgaaggtctccaccactgcccttgctgttcttctctgtaccatgacactctgcaaccaagtcttctcagcgccatatggagctgacaccccgactgcctgctgcttctcctacagccggaagattccacgccaattcatcgttgactattttgaaaccagcagcctttgctcccagccaggtgtcattttcctgactaagagaaaccggcagatctgcgctgactccaaagagacctgggtccaagaatacatcactgacctggaactgaatgcc
[0413]
seq id no:37:apc靶向mccl4
[0414]
atgaagctctgcgtgtctgccctctctctcctcttgctcgtggctgccttctgtgctccagggttctcagcaccaatgggctctgaccctcccacttcctgctgtttctcttacacctcccggcagcttcacagaagctttgtgatggattactatgagaccagcagtctttgctccaagccagctgtggtattcctgaccaaaagaggcagacagatctgtgctaaccccagtgagccctgggtcactgagtacatgagtgacttggag
[0415]
seq id no:38:apc靶向mccl5
[0416]
atgaagatctctgcagctgccctcaccatcatcctcactgcagccgccctctgcacccccgcacctgcc
tcaccatatggctcggacaccactccctgctgctttgcctacctctccctcgcgctgcctcgtgcccacgtcaaggagtatttctacaccagcagcaagtgctccaatcttgcagtcgtgtttgtcactcgaaggaaccgccaagtgtgtgccaacccagagaagaagtgggttcaagaatacatcaactatttggagatgagc
[0417]
seq id no:39apc靶向mccl19atggccccccgtgtgaccccactcctggccttcagcctgctggttctctggaccttcccagccccaactctggggggtgctaatgatgcggaagactgctgcctgtctgtgacccagcgccccatccctgggaacatcgtgaaagccttccgctaccttcttaatgaagatggctgcagggtgcctgctgttgtgttcaccacactaaggggctatcagctctgtgcacctcctgaccagccctgggtggatcgcatcatccgaagactgaagaagtcttctgccaagaacaaaggcaacagcaccagaaggagccctgtgtct
[0418]
seq id no:40:apc靶向mxcl1
[0419]
atgagacttctcctcctgactttcctgggagtctgctgcctcaccccatgggttgtggaaggtgtggggactgaagtcctagaagagagtagctgtgtgaacttacaaacccagcggctgccagttcaaaaaatcaagacctatatcatctgggagggggccatgagagctgtaatttttgtcaccaaacgaggactaaaaatttgtgctgatccagaagccaaatgggtgaaagcagcgatcaagactgtggatggcagggccagtaccagaaagaacatggctgaaactgttcccacaggagcccagaggtccaccagcacagcgataaccctgactggg
[0420]
seq id no:41:apc靶向mccl20
[0421]
atggcctgcggtggcaagcgtctgctcttccttgctttggcatgggtactgctggctcacctctgcagccaggcagaagcagcaagcaactacgactgttgcctctcgtacatacagacgcctcttccttccagagctattgtgggtttcacaagacagatggccgatgaagcttgtgacattaatgctatcatctttcacacgaagaaaagaaaatctgtgtgcgctgatccaaagcagaactgggtgaaaagggctgtgaacctcctcagcctaagagtcaagaagatg
[0422]
seq id no:42:apc靶向mccl21
[0423]
atggctcagatgatgactctgagcctccttagcctggtcctggctctctgcatcccctggacccaaggcagtgatggagggggtcaggactgctgccttaagtacagccagaagaaaattccctacagtattgtccgaggctataggaagcaagaaccaagtttaggctgtcccatcccggcaatcctgttctcaccccggaagcactctaagcctgagctatgtgcaaaccctgaggaaggctgggtgcagaacctgatgcgccgcctggaccagcctccagccccagggaaacaaagccccggctgcaggaagaaccggggaacctctaagtctggaaagaaaggaaagggctccaagggctgcaagagaactgaacagacacagccctcaagagga
[0424]
seq id no:43:apc靶向gm-csf
[0425]
atgtggctgcagaatttacttttcctgggcattgtggtctacagcctctcagcacccacccgctcacccatcactgtcacccggccttggaagcatgtagaggccatcaaagaagccctgaacctcctggatgacatgcctgtcacgttgaatgaagaggtagaagtcgtctctaacgagttctccttcaagaagctaacatgtgtgcagacccgcctgaagatattcgagcagggtctacggggcaatttcaccaaactcaagggcgccttgaacatgacagccagctactaccagacatactgccccccaactccggaaacggactgtgaaacacaagttaccacctatgcggatttcatagacagccttaaaacctttctgactgatatcccctttgaatgcaaaaaaccaggccaaaaa
[0426]
seq id no:44:apc t分泌信号上的分泌信号，小鼠血清白蛋白
[0427]
atgaaatgggtgacctttctgctgctgctgtttgtgagcggcagcgcgtttagcg
[0428]
seq id no:45:apc靶向抗鼠dec-205fv
[0429]
cggcccagccggccatggcggactacaaacaggctgttgtgactcaggaatcagcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaagtactggggctgttacaattagtaactatgccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaataggtggtaccaacaaccgagctccaggtgttcctgccagattctc
aggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggcacagactgaggatgaggcaatctatttctgtgctctatggtacaacaaccagtttattttcggcagtggaaccaaggtcactgtcctaggtggtggtggtggttctggtggtggtggatccggcggcggcggctctggcggcggcggctctgaggtccagctgcaacagtctggacctgtgctggtgaagcctggggcttcagtgaagatgtcctgtaaggcttctggaaacacattcactgactcctttatgcactggatgaaacagagccatggaaagagtcttgagtggattggaattattaatccttataacggcggtactagctacaaccagaaattcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagcctacatggagctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagaaacggggtgcggtactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcggcctcgggggcc
[0430]
seq id no:46:apc靶向抗鼠clec9 fv
[0431]
gcggcccagccggccatggcggactacaaacaggctgttgtgactcaggaatcagcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaagtaaaagcagccagagcgtgctgtatgatgaaaacaaaaaaaactatctggccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaataggttgggcgagcaccggcgaaagcaaccgagctccaggtgttcctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggcacagactgaggatgaggcaatctatttctgttattatgattttccgccgttcggcagtggaaccaaggtcactgtcctaggtggtggtggtggttctggtggtggtggatccggcggcggcggctctggcggcggcggctctgaggtccagctgcaacagtctggacctgtgctggtgaagcctggggcttcagtgaagatgtcctgtaaggcttctaacgcggcgatttatatgcactggatgaaacagagccatggaaagagtcttgagtggattggaattcgcattcgcacccgcccgagcaaatatgcgaccgattatgcggatagcgtgcgcggcagctacaaccagaaattcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagcctacatggagctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtcgcgcgaccgaagatgtgccgttttattactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcggcctcgggggcc
[0432]
seq id no:47:apc靶向clec9配体tggcccaggttccacagcagcgtgttccacacccac
[0433]
seq id no:48:apc靶向mflt3l
[0434]
atgacacctgactgttacttcagccacagtcccatctcctccaacttcaaagtgaagtttagagagttgactgaccacctgcttaaagattacccagtcactgtggccgtcaatcttcaggacgagaagcactgcaaggccttgtggagcctcttcctagcccagcgctggatagagcaactgaagactgtggcagggtctaagatgcaaacgcttctggaggacgtcaacaccgagatacattttgtcacctcatgtaccttccagcccctaccagaatgtctgcgattcgtccagaccaacatctcccacctcctgaaggacacctgcacacagctgcttgctctgaagccctgtatcgggaaggcctgccagaatttctctcggtgcctggaggtgcagtgccagccggactcctccaccctgctgcccccaaggagtcccatagccctagaagccacggagctcccagagcctcggcccaggcag
[0435]
seq id no:49:二聚体，dhlx蛋白
[0436]
ggagaactggaggaattacttaaacatctcaaggagttgctcaaaggccctaggaagggagaactggaggaactcctcaaacatctcaaggagttactaaaggga
[0437]
seq id no:50:二聚体，gs-接头
[0438]
ggcagcggcagcggcagcggcagcggcagc
[0439]
seq id no:51:二聚体，hmhd2(人igm)
[0440]
gccgaactcccgcccaaggtgtccgtgttcgtccctccccgcgatgggttcttcggcaatccacgaaaatccaaactgatttgtcaggccaccggcttctccccccgacagatccaggtgagttggctacgagagggtaaacaggtggggagcggagtgaccactgaccaggtgcaggccgaggccaaggaaagcggacccacaacatacaaagtgacaagcactctgacgattaaggagtcagactggctcggccaatccatgtttacatgccgggttgatcacagagggttgaccttc
caacagaacgcatccagtatgtgcgttccagat
[0441]
seq id no:52:三聚体胶原蛋白三聚结构域
[0442]
gctgggcaggtgaggatctgggccacataccagaccatgctggacaagatccgggaggtgccggagggctggctcatctttgtggccgagagggaagagctctatgtacgcgttagaaatggcttccggaaggtgctgctggaggcccggacagccctcccgagaggcacgggcaatgag
[0443]
seq id no:53:四聚体p53合成蛋白*
[0444]
aagcctctggacggagagtatttcactctccagatccggggccccgaaaggttcgaaatgttccgggagcttaacgaggccttggagctgaaagacgcacaggccggaaaggaaccg
[0445]
seq id no:54:
[0446]
qietqqrkfkasrasilsemkmlkekr
[0447]
seq id no:55:
[0448]
vilpqapsgpsyatylqpaqaqmltpp
[0449]
seq id no:56:
[0450]
dtlsamsnpramqvllqiqqglqtlat
[0451]
seq id no:57:
[0452]
dgqlellaqgaldnalssmgalhalpr
[0453]
seq id no:58:
[0454]
rlhvvkllasalstnaaaltqellvld
[0455]
seq id no:59:二聚体铰链1，人igg3蛋白序列:
[0456]
elktplgdttht
[0457]
seq id no:60:二聚体铰链4，人igg3蛋白序列:
[0458]
epkscdtpppcprcp
[0459]
seq id no:61c22新生表位氨基酸序列:
[0460]
qietqqrkfkasrasilsemkmlkekr
[0461]
seq id no:62c23新生表位氨基酸序列:
[0462]
vilpqapsgpsyatylqpaqaqmltpp
[0463]
seq id no:63c25新生表位氨基酸序列:
[0464]
dtlsamsnpramqvllqiqqglqtlat
[0465]
seq id no:64c30新生表位氨基酸序列:
[0466]
dgqlellaqgaldnalssmgalhalpr
[0467]
seq id no:65c38新生表位氨基酸序列:
[0468]
rlhvvkllasalstnaaaltqellvld
[0469]
seq id no:66:备选gs-接头:
[0470]
gggss
[0471]
seq id no:67》p0055_ptvg4_mccl19_h1h4ch3_刺突_rbd:
[0472]
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcc
cacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactccaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattccgccgccaccatggccccccgtgtgaccccactcctggccttcagcctgctggttctctggaccttcccagccccaactctggggggtgctaatgatgcggaagactgctgcctgtctgtgacccagcgccccatccctgggaacatcgtgaaagccttccgctaccttcttaatgaagatggctgcagggtgcctgctgttgtgttcaccacactaaggggctatcagctctgtgcacctcctgaccagccctgggtggatcgcatcatccgaagactgaagaagtcttctgccaagaacaaaggcaacagcaccagaaggagccctgtgtctgagctcaaaaccccacttggtgacacaactcacacagagcccaaatcttgtgacacacctcccccgtgcccaaggtgcccaggcggtggaagcagcggaggtggaagtggaggacagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcagcgggcagccggagaacaactacaacaccacgcctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacatcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgcttcacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggcctcggtggcctggcggccgcgagggtgcagccgactgagagtatcgttcgtttccctaacattacgaacctatgtccgtttggagaggtatttaatgctaccagattcgcatcagtctatgcttggaacaggaaacggatatcaaactgcgtggccgactatagcgttctctacaacagtgcctcttttagcactttcaagtgctacggagtctccccaaccaagctaaacgacctgtgcttcacaaacgtctacgctgactcctttgtcatcagaggcgatgaggtgcggcaaatcgcacctggacaaactggaaaaatcgccgactataactataagctgcccgatgactttactggatgcgtgatcgcttggaattcaaacaatctcgacagtaaggtaggaggcaattacaactacctttatcggctcttccgaaaatcaaacctgaaaccctttgagcgtgatatctcgactgaaatttaccaagctggcagcactccttgcaacggagtggagggcttcaattgttactttcctctgcagagctacggattccaacctacaaacggggtaggctaccaaccctaccgagtggtggtgctgagctttgagctgctccatgctccagcaactgtatgcggccctaagaagtcaactaacctggttaagaataaatgcgtcaacttttagggatccagatctaacgacaaaacgacaaaacgacaaggcgccagatctggcgtttcgttttgtcgttttgtcgttagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccattcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttca
gcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactcggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccccccccccccattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcagattggctat
[0473]
seq id no:68:用于p0055的受体结合结构域(rbd)
[0474]
rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnf
[0475]
seq id no:69:t4 fibritin三聚结构域
[0476]
gyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl
[0477]
seq id no:70:接头序列
[0478]
gggssgggsg
[0479]
seq id no:71:接头序列
[0480]
gggss
[0481]
seq id no:72:接头序列
[0482]
gggssgggssgggss
[0483]
seq id no:73:接头序列
[0484]
glggl
[0485]
seq id no:74:接头序列
[0486]
glgglaaa

技术特征：
1.融合多肽，其包含：i)至少一个抗原单元；ii)至少一个抗原呈递细胞(apc)靶向单元，所述抗原呈递细胞(apc)靶向单元靶向树突细胞；iii)任选地，多聚单元，诸如二聚单元，所述多聚单元提供所述融合多肽多聚化为包含两个或更多个抗原单元和两个或更多个抗原呈递细胞(apc)靶向单元。2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述抗原单元由至少一个表位的氨基酸序列组成或包含至少一个表位的氨基酸序列，所述至少一个表位为来自患者的肿瘤细胞的新生表位。3.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述抗原单元不包含来自患者的肿瘤细胞的新生表位。4.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述抗原单元是细菌或病毒抗原，诸如包含至少一个细菌或病毒表位的氨基酸序列的抗原单元。5.根据权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，所述apc靶向单元靶向成熟树突细胞(mdc)。6.根据权利要求1-5中任一项所述的融合多肽，所述apc靶向单元选自ccl19和ccl21，诸如人形式的ccl19和ccl21。7.根据权利要求1-6中任一项所述的融合多肽，所述apc靶向单元靶向受体ccr7。8.根据权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，所述apc靶向单元选自ccl3、ccl4、ccl5、ccl20或xcl1，诸如人形式的ccl3、ccl4、ccl5、ccl20或xcl1。9.根据权利要求8所述的融合多肽，所述apc靶向单元靶向未成熟树突细胞(imdc)。10.根据权利要求8或9所述的融合多肽，所述apc靶向单元靶向选自ccr1、ccr3、ccr5、ccr6和xcr1的受体。11.根据权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，其中所述apc靶向单元由抗体结合区组成或包含抗体结合区，所述抗体结合区具有对抗原呈递细胞上的靶表面分子诸如clec9a或dec205的特异性，诸如抗-clec9a、抗-dec205或其变体，诸如抗-clec9a fv、抗-dec205 fv。12.根据权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，其中所述apc靶向单元由配体组成或包含配体，所述配体诸如clec9肽配体。13.根据权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，所述apc靶向单元选自xcl1、gm-csf、抗-dec-205fv、抗-clec9 fv和clec9配体。14.根据权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，其中所述apc靶向单元是细胞因子，诸如gm-csf，诸如结合cd116的apc靶向单元。15.根据前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原单元通过接头连接到所述靶向单元，所述接头诸如gs接头，诸如具有氨基酸序列gsgsgsgsgs(seq id no:13)的接头，或衍生自免疫球蛋白分子(ig)诸如igg的接头，诸如通过形成链间共价键促成多聚化的接头和/或通过形成非共价键或相互作用促成多聚化的接头。16.根据权利要求15所述的融合多肽，其中所述接头是或包含：铰链区，诸如ig诸如igg-衍生的铰链区，dhlx蛋白，hmhd2，胶原蛋白三聚结构域，p53合成蛋白，或fibritin t4
三聚结构域，并且1)通过形成链间共价键，诸如二硫键或2)通过非共价相互作用促成多聚化。17.根据权利要求15-16中任一项所述的融合多肽，其中所述接头包含羧基端c结构域(ch3结构域)，诸如ig的羧基端c结构域(cγ3结构域)，或与所述c结构域基本上同源的序列，诸如igg3的ch3结构域。18.根据权利要求17所述的融合多肽，其中所述铰链和ch3结构域通过氨基酸gggss序列(seq id no:66)连接，诸如通过氨基酸gggss的三重复序列(seq id no:72)连接，或其中所述铰链和ch3结构域经由氨基酸序列gggssgggsg(seq id no:70)连接。19.根据权利要求15-18中任一项所述的融合多肽，其中所述接头包含二聚基序或任何其他多聚结构域，所述二聚基序或所述其他多聚结构域通过疏水相互作用参与多聚化，诸如通过ch3结构域参与多聚化。20.根据权利要求15-19中任一项所述的融合多肽，其中所述接头包含铰链区，所述铰链区包含衍生自igg的h1+h4或h4，所述igg诸如igg2或igg3。21.根据前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述至少一个抗原单元由下列组成或包含下列：至少或约5个，诸如至少或约10个、至少或约15个、至少或约20个、至少或约25个和至少或约30个表位。22.根据前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述至少一个抗原单元包含至少一个表位，在肿瘤细胞中鉴定的表位中所述至少一个表位表现出高于平均值诸如在前25％的mhc结合稳定性。23.根据前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述至少一个抗原单元是细菌或病毒抗原，诸如在细菌或病毒各自的抗原中所述细菌或病毒抗原表现出高于平均值诸如在前25％的mhc结合稳定性。24.根据权利要求23所述的融合多肽，其中所述抗原单元包含衍生自β-冠状病毒(尤其是衍生自刺突蛋白)的氨基酸序列，诸如衍生自sars冠状病毒(尤其是衍生自刺突蛋白)的氨基酸序列，且优选衍生自sars-cov-2的氨基酸序列，且尤其是衍生自sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸序列。25.根据权利要求24所述的融合多肽，其中所述氨基酸序列包含或构成来自sars-cov-2刺突蛋白的核糖体结合蛋白(rbd)。26.根据权利要求25所述的融合多肽，其中所述氨基酸序列由下列组成或包含下列：ncbi参考序列号：yp_009724390的残基319-541或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，诸如与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。27.根据前述权利要求中任一项所述的融合多肽，所述多聚单元，诸如二聚单元，能够形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或更高阶的多聚体。28.一种表达载体，包含编码如权利要求1-26中任一项中所限定的融合多肽的核苷酸序列。29.根据权利要求28所述的表达载体，所述核苷酸序列是cdna序列。30.根据权利要求28所述的表达载体，所述核苷酸序列是编码如权利要求1-27中任一项所限定的融合多肽的rna序列。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的表达载体，所述序列进一步包含或编码至少一个免疫刺激序列(iss)。32.根据权利要求31所述的表达载体，其中所述iss是包含至少一个cpg基序的寡脱氧核糖核苷酸(odn)，并且其中所述odn优选地包括硫代磷酸酯基。33.根据权利要求31所述的表达载体，其中所述iss是或包含寡核糖核苷酸。34.至少两个表达构建体的系统，包含：i)第一表达构建体，其包含编码至少一个抗原单元的核苷酸序列，和ii)第二表达构建体，其包含编码至少一个靶向树突细胞的抗原呈递细胞(apc)靶向单元的核苷酸序列。35.根据权利要求34所述的至少两个表达构建体的系统，其中所述第一表达构建体包含编码如权利要求2-4和21-26中任一项所限定的至少一个抗原单元的核苷酸序列。36.根据权利要求34-35中任一项所述的至少两个表达构建体的系统，其中所述第二表达构建体包含编码如权利要求5-14中任一项所限定的靶向树突细胞的至少一个抗原呈递细胞(apc)靶向单元的核苷酸序列。37.根据权利要求34-37中任一项所述的至少两个表达构建体的系统，其中包含编码至少一个抗原单元的核苷酸序列的所述第一表达构建体进一步包含编码多聚单元诸如二聚单元的核苷酸序列，所述多聚单元提供所述至少一个抗原单元的多聚化。38.根据权利要求34-37中任一项所述的至少两个表达构建体的系统，其中所述至少两个表达构建体在相同的表达载体上表达，诸如处在两个不同的启动子的控制下。39.根据权利要求34-37中任一项所述的至少两个表达构建体的系统，其中所述至少两个表达构建体由至少两个不同的载体表达。40.一种治疗特征为展现特异性疾病抗原单元的疾病的方法，所述特异性疾病抗原单元诸如未被患者中的正常细胞展现的表位，或所述表位是所述患者外源的，所述方法包括施用免疫原性有效量的包含如权利要求1-27中任一项所限定的融合多肽的组合物，或所述组合物包含至少一种如权利要求28-33中任一项所限定的表达载体、或根据权利要求34-39中任一项所述的至少两个表达构建体的系统，由此使所述患者中的体细胞表达所述表达载体内包含的所述核苷酸序列；所述方法任选地进一步包括施用药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。41.一种在哺乳动物患者中治疗肿瘤诸如恶性肿瘤或诱导治疗作用或改善针对此类肿瘤的免疫应答的方法，其中所述肿瘤展现未被所述患者中非肿瘤细胞展现的表位(新生表位)，所述方法包括施用免疫原性有效量的包含如权利要求1-22或当权利要求27关联于权利要求1-22时权利要求27中任一项所限定的融合多肽的组合物，或所述组合物包含至少一种如当权利要求28-33关联于权利要求1-22中任一项时的权利要求28-33中任一项所限定的表达载体、或当权利要求34-39关联于权利要求1-22中任一项时权利要求34-39中任一项所述的至少两个表达构建体的系统，由此使所述患者中的体细胞表达所述表达载体内包含的所述核苷酸序列；所述方法任选地进一步包括施用药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。42.一种治疗细菌或病毒感染的方法，所述细菌或病毒的特征为展现所述细菌或病毒的特异性抗原单元，所述方法包括施用免疫原性有效量的包含如权利要求1-27中任一项所限定的融合多肽的组合物，或所述组合物包含至少一种如权利要求28-33中任一项所限定
的表达载体、或权利要求34-39中任一项所述的至少两个表达构建体的系统，由此使患者中的体细胞表达所述表达载体内包含的所述核苷酸序列；所述方法任选地进一步包括施用药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂，其中所述病毒感染优选是β冠状病毒，诸如sars冠状病毒，且特别是sars-cov-2的感染，并且所述融合多肽是权利要求24-26中任一项所限定的。43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述患者是人。44.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述免疫原性有效量的组合物经肠胃外施用，诸如经由肌内途径、真皮内途径、透皮途径、皮下途径、静脉内途径、动脉内途径、鞘内途径、脊髓内途径、鞘内途径、脑室内途径、腹膜内途径、鼻内途径、阴道途径、眼内途径或肺途径施用；经由经口途径、舌下途径、经颊途径或肛门途径施用；或局部施用。45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂是水性缓冲溶液。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述水性缓冲溶液是台氏缓冲液。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述台氏缓冲液具有下列组成：140mm nacl，6mm kcl，3mm cacl2，2mm mgcl2，10mm 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)ph 7.4，和10mm葡萄糖。48.根据权利要求46-47中任一项所述的方法，其中所述台氏缓冲液的浓度为约35％v/v。49.根据权利要求45所述的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液。50.根据权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用免疫原性有效量的包含至少一种如权利要求10-15中任一项所限定的表达载体的组合物，其中所述表达载体的有效剂量为0.1μg-25mg，诸如0.5μg-20mg、5μg-15mg、50μg-10mg和500μg-8mg，尤其是约0.0001mg、约0.0005mg、约0.001mg、约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg和约8mg。51.根据权利要求40-50中任一项所述的方法，其中所述免疫原性有效量的组合物进一步包含有效量的两亲性嵌段共聚物，所述两亲性嵌段共聚物包含聚(环氧乙烷)和聚环氧丙烷的嵌段，诸如p188。52.如权利要求5-14中任一项所限定的抗原呈递细胞(apc)靶向单元，其用于治疗方法中，所述方法包括向哺乳动物患者的树突细胞引导抗原单元的步骤，所述抗原单元诸如包含所选择的表位，诸如在权利要求1-27中所限定的构建体中。

技术总结
本发明涉及免疫疗法和疫苗，诸如癌症免疫疗法，或用于微生物感染如细菌或病毒感染的疫苗。特别地，本发明涉及用于通过施用特异性融合多肽或编码所述融合多肽的核酸来预防或治疗癌症或微生物感染的方法和产品。疗癌症或微生物感染的方法和产品。疗癌症或微生物感染的方法和产品。


技术研发人员：B
受保护的技术使用者：伊沃逊生物科技股份公司
技术研发日：2021.07.14
技术公布日：2023/7/22