掺入杂交蘑菇菌株LA3782的蘑菇品系N-s34及其衍生物的制作方法

掺入杂交蘑菇菌株la3782的蘑菇品系n-s34及其衍生物
1.序列表
2.序列表文件b76090 listing sequence_st25.txt，文件尺寸为3000字节，创建日期为2020年7月21日，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及命名为n-s34的同核的双孢菇(agaricus bisporus)(lange)imbach蘑菇真菌品系培养物的开发，以及从品系n-s34获得的、传代的或以其他方式衍生的培养物。更特别地，本发明涉及掺入至少一组染色体的培养物，该染色体具有在品系n-s34中发现的染色体的基因型中存在的基因型。本发明还涉及f1杂交种，以及特别的传代自n-s34的f1杂交种菌株(命名为la3782)。该特定的菌株确实显示出收获作物，尤其是在第三次出菇潮(flush)中的极佳产量重量，以及蘑菇产品的非常好的保质期。本发明还涉及从品系n-s34和从所述杂交种菌株la3782衍生的、或传代的、或以其他方式开发的或获得的后代、品系和菌株。本发明还涉及使用上述培养物的方法。


背景技术：

4.可食用蘑菇双孢菇变种(agaricus bisporus(lange)imbach var.bisporus)是在世界各地广泛栽培的属于担子菌真菌的微生物。在欧洲和北美，其是栽培最广的蘑菇品种。根据最近的市场数据，“2017-2018年美国蘑菇作物的销售量总计9.17亿磅
……
2017-2018年美国蘑菇作物的销售额为12.3亿美元
……”
(usda nass，2019)。“2019年，欧洲栽培的双孢菇蘑菇生产和销售共计1,700,000公吨，市场价值约25亿欧元。该作物中的约12％，即200,000公吨是棕色菌盖蘑菇。”(sylvan,inc，内部市场分析)。
5.栽培蘑菇产业非常期望开发这种有价值的蘑菇真菌的新型杂交蘑菇菌株或品系，通常是为了提高作物的遗传多样性，特别是如果可以开发这些新型菌株或品系以在单个菌株、培养物、杂交种或品系中提供各种所需的性状或新的组合性状。
6.培养物是蘑菇菌株开发人员制备、维持和繁殖其工业微生物的手段。与其他微生物的培养物一样，使用本领域已知的各种微生物实验室方法和技术在无菌介质上制备、维持、繁殖和储存伞菌属(agaricus)的培养物。在洁净室或无菌转移罩内使用无菌性工具和无菌技术来操作纯培养物的细胞，用于各种目的，包括菌落繁殖和使用多种技术开发新型菌株。包括蘑菇“菌种体(spawn)”和“覆盖接种物(casing inoculum)”在内的商业培养接种物也使用大规模微生物生产方法制备，并以无菌包装中包含的基质介质上的纯培养物提供给终端用户。
7.这种培养物的一种用途是生产用于销售和消费的蘑菇。蘑菇在专用蘑菇农场的专门建造的结构中进行商业化栽培。虽然方法有很多变化，没有单一的标准化栽培方法，但以下描述代表典型的方法。由木质纤维素材料(如稻草)制备的堆肥，添加含氮材料，在合适的设施内完成和进行巴氏杀菌。蘑菇菌种体包括灭菌的易碎“载体基质”，在所述“载体基质”中通过接种无菌地掺入了一种蘑菇菌株的纯培养物，之后进行繁殖，将所述蘑菇菌种体与
巴氏杀菌的堆肥混合并在受控温度中孵育约13至约19天，在此期间，蘑菇培养物的菌丝体在堆肥的整体质量中定殖并开始消化堆肥。然后，将材料没有营养的“覆盖层”(如泥炭)放置在堆肥上，厚度为约1.5至约2英寸。可以将掺入了相同蘑菇培养物的额外“覆盖接种物”掺入到覆盖层中，以加速蘑菇的形成和收获，并提高覆盖表面中和表面上的菌丝体和蘑菇分布的均匀性。然后，仔细管理种植设施内的环境条件(包括温度和湿度)，以促进和控制培养物在覆盖/空气界面处从营养生长到生殖生长的转换。在覆盖后的另外约13至约18天，蘑菇将发育到适合收获和销售的正确阶段。
8.包含原始培养物的第一次出菇潮的蘑菇将在3至5天的时间段中被采摘。其他的蘑菇出菇潮将以约每周的间隔出现。在商业上，在种植设施中移除并更换堆肥之前，会生产和收获两到三次蘑菇的出菇潮。收获后，蘑菇会进行分级、分类、称重、包装和在冷藏条件下运输。与菌株相关的盈利取决于(1)收获作物的产量重量，疾病的净损失、损害和收获后重量损失，(2)收获或加工不同尺寸、重量、空间/时间行为以及类型或等级的蘑菇的不同劳动力和其他成本，以及(3)基于蘑菇产品质量和适销性的作物价值，这由外观、物理特征、收获后储存和销售期间的条件(即“保质期”效果)和产品的市场细分(例如，白菌盖与棕菌盖，或封闭的菌盖与打开的菌盖)所决定的。
9.对于许多生产者而言，每天或每周稳定收获蘑菇将解决收获和包装劳动力安排和管理方面的昂贵问题，以及与产品库存、储存和运输相关的问题。许多种植者都希望获得高产量并结合在出菇潮之间更均衡的产量。虽然稳定的生产(主要是单个菌株的生物学性状)减轻了其中一些代价高昂的问题，但还希望进一步以菌株形式解决收获后(或“保质期”)质量和价值下降的问题，包括(由于蒸发和呼吸作用)导致的可销售重量的损失，所述菌株在收获后储存期间在更长时间中保留更多的收获后重量、或产品质量的其他要素。
10.需要更多样化、更通用、盈利更多的双孢菇蘑菇菌种。为了满足对改良的、多样化的双孢菇蘑菇菌株的需求，蘑菇产业的各个实体已经制定了蘑菇菌株开发计划。蘑菇菌株开发计划的目标是在单一菌株、培养物、杂交种或品系中组合各种期望的性状。目前可用于蘑菇产业的菌株使得种植者能够成功生产蘑菇作物并盈利。有许多特征可以判断新型菌株比现有的菌株有所改良，或者在特定的生产设施或销售市场中更适合，或者在区域或全球产业中更适合。可以使用本领域公知的技术评估此类特征。
11.新的菌株是最优选的，是从单倍体同核品系(包括新型品系)之间的新杂交(融合)而成功开发的。因此，仍然需要新品系，其可以用于生产双孢菇蘑菇培养物和微生物的新杂交种菌株，所述新菌株继而提供改良的和/或新型特征组合用于生产者盈利，以及提供比之前其他双孢菇菌株改良的蘑菇产品。
12.在受让人的研究中心的近100年的蘑菇菌株开发中的受让人的总体操作经验中，要开发在所有必要的商业特征方面都可以接受的若干菌株是极其困难的。成功的结果是罕见而且通常是不可预测的，并且部分依赖于偶然鉴定的育种种群和品系，通过应用菌株开发技术，发现这些种群和品系表现出提高的产生一种或多种商业上可接受的菌株的能力或趋势。虽然，许多性状可能导致菌株在商业上不能被接受，三个最重要的合格性状是作物产量、作物生长时间和生产的蘑菇的外观/“质量”。因此，能够通过应用菌株开发技术生产可接受的新商业菌株的任何新型育种种群或品系，对蘑菇菌株开发人员和蘑菇产业都极具价值。
13.市场条件随时间而变化。消费者偏好波动和不断变化。出现新的病原体。原材料在价格、组分和可用性方面波动。因此，菌种体生产者和蘑菇生产者需要获得多样化的商业上可接受的菌株，其具有不同的、可供选择的特征组合，允许灵活有效地应对不断变化的市场或生产条件，包括可能无法预见的挑战(例如，病原体、农用化学品方案、特定的堆肥原料的可用性或逐年特性改变等)。遗传多样性导致表型特征的多样性，包括明显的特征和其他可能仅在变化或不可预测的条件下才变得明显或明确有价值的特征。
14.因此，普遍需要相对于其他商业生产的菌株具有不同的、多样的、新型基因型的商业上可接受的双孢菇菌株，原因有以下三个：
15.首先，已知在商业生产中与其他菌株的菌株营养不亲和性(incompatible)延缓病毒性疾病在栽培菌株之间的传播，这是由于不亲和菌株不能够彼此吻合(anastomose)(＝物理融合)和交换细胞质，或该能力有限。可以使用本领域公知的技术评估不亲和表型。在设施内交替或轮换使用不亲和的菌株可以通过在数周或数月内大幅降低传播/感染率，同时减少病毒性疾病贮主(reservoir)和压力，立即提高收获产量。因此，需要商业上可接受的蘑菇菌株，其与现在使用的其他商业菌株(具体是棕色菌盖的b14528/tuscan和br06/heirloom菌株)在遗传上不同、并且在营养上不亲和。菌株b14528已根据管理微生物保藏的布达佩斯条约，以nrrl登录号50900保藏在美国，伊利诺伊州，peoria的农业研究服务培养物保藏中心(agricultural research services culture collection)(nrrl)。菌株br06已根据管理生物保藏的布达佩斯条约，以atcc登录号pta-6876保藏在美国，马里兰州，rockville的美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)(atcc)。
16.其次，众所周知，当农作物产业广泛依赖于单一或仅两个遗传谱系时(即，造成近乎单一栽培的情况，就像现在大多数国家存在的棕色菌盖蘑菇一样)，由于出现疾病或其他条件，使得在整个设施甚至整个产业规模中发生不可预测的、灾难性作物歉收的风险增加。因此，从风险管理和粮食安全的角度来看，非常期望在扩大范围的商业可用菌株中同时提供遗传多样化和商业上可接受的表现和作物特征。
17.第三点，据了解，不同人以高度个性化的方式感知风味(“味道”)。未经训练和经训练的品尝者都对不同菌株生产的蘑菇有独特的偏好；没有单一的“味道最好”的蘑菇菌株，而是个人偏好的多样化集合。对菌盖颜色的偏好也多种多样且独特的。提供遗传多样化的蘑菇产品为消费者提供更多选择，消费者有更多机会可以找到成为个人“最爱”的蘑菇。消费者的选择和满意度增加支持了销售价格和销量的增加，对各方都有利。
18.因此，任何商业上可接受的具有新基因型的杂交种菌株、或育种品系在克服有限的遗传多样性以及全球作物恢复力的产业规模问题上、以及作物轮作选择有限和设施卫生管理的问题方面、同时增加更广的消费者接受度和满意度的前景上都是有用和有利的。使用掺入了来自非栽培种群的dna的新品系，满足了对用于生产栽培的双孢菇蘑菇作物的菌株库提供重要遗传多样化的需要。甚至更特别地需要通过菌株开发技术产生多样化和新型育种品系，使其能够用于产生多样的、商业上可接受的新型杂交种菌株。相应地，对于在这种用途中产生的新杂交种菌株存在很大的需求。两个菌株之间观察到的基因型差异的每1％代表约120个可以不同的功能性基因。
19.如今，大多数商业化生产的棕色菌盖的双孢菇蘑菇仅采用以下两种菌株中的一种：br06/heirloom(pta-6876)或b14528/tuscan(nrrl50900)。蘑菇产业需要其他菌株：其
(1)产生可接受产量的蘑菇，例如，目前商业菌株(如br06/“heirloom”或b14528/“tuscan”)的产量的至少95％，优选至少100％，(2)按照期望的商业生产规划进行，换句话说，收获规划使成本最小化和使作物价值最大化，甚至更平均地优于heirloom菌株，同时(3)还为消费者生产出外观良好、质量上乘的蘑菇，并且与br06/heirloom菌株相比，其在收获后销售链中在较长天数内保留了更多的蘑菇初始重量。相应的，需要蘑菇品系，其可以向其杂交传代菌株传递能够提供这些性状、以及其他商业上可接受特征的遗传物质。
20.本发明通过提供在遗传上不同于所有现有技术菌株的新品系和菌株来满足这种需要，以及满足蘑菇生产商、销售商和消费者的期望，包括提供具有上述具体表现和保质期改良的商业上可接受的菌株。


技术实现要素：

21.本发明总体涉及双孢菇培养物，其至少包含双孢菇品系n-s34的染色体组，所述品系的代表性培养物已经于2020年6月30日，以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(collection nationale de cultures de microorganismes)(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，其中所述染色体组优选地包含表i中列出的序列特征性等位基因标志物。其进一步涉及如上所述的培养物，其特征在于其选自：(a)品系n-s34，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，以及(b)通过将品系n-s34与第二品系交配(mate)产生的f1杂交种菌株，以及(c)如在(b)中定义的所述f1杂交种菌株的同核体(homokaryon)，优选地，其特征在于所述第二品系是从菌株bp-1获得的同核体，以及更优选地特征在于其是菌株la3782，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日，以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。
22.本发明的另一个方面涉及双孢菇蘑菇培养物，其包含菌株la3782的染色体组的至少一个单倍体，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，所述染色体组优选地包含表ii中列出的序列特征性等位基因标志物，更优选地，其特征在于其选自：(a)菌株la3782的同核体，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，以及(b)通过将所述同核体(a)与第二品系交配产生的f2杂交种。
23.本发明的另一个方面涉及f2、f3、f4或f5代的双孢菇蘑菇菌株培养物，其传代自如上定义的f1杂交种，优选传代自f1杂交种la3782，或传代自菌株la3782衍生的菌株，并且其分别包含双孢菇菌株la3782的基因组中存在的单核苷酸多态性(snp)的至少40-60％、至少20-30％、至少10-15％或至少4-8％，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。
24.本发明的又另一个方面涉及衍生自初始培养物的双孢菇蘑菇培养物，其中所述初始培养物选自：(a)菌株la3782，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登
录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，(b)双孢菇品系n-s34，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，以及(c)上文定义为本发明培养物的任何培养物；以及其特征可以在于，其包含表i中列出的n-s34或表ii中列出的la3287的203个序列特征性等位基因标志物中的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少100个标志物，或其特征可以在于，其包含表i中列出的n-s34或表ii中列出的la3287的序列特征性等位基因标志物中至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
25.在本发明的一个优选的实施方案中，如上所述的本发明培养物特征在于：(a)所述培养物的作物的产量表现等于或超过双孢菇的br06/heirloom菌株的作物的产量表现，(b)所述培养物的作物的第三次出菇潮产量显著超过br06/heirloom菌株的第三次出菇潮产量，以及(c)与br06/heirloom菌株的蘑菇产品相比，所述培养物的作物的蘑菇产品在收获后在4摄氏度下储存数天后保留更多的重量，天数选自3、4、5、6、7和8天。
26.本发明还涉及从本发明的培养物获得的细胞、菌丝、菌丝体、蘑菇、萌发的孢子、未萌发的孢子、同核体和异核体(heterokaryon)，包括snp、nsnp和非整倍体，以及掺入了本发明的培养物的产品，包括菌种体、接种物、蘑菇、蘑菇部分、蘑菇片、加工食品。
27.本发明还涉及一种用于开发新的双孢菇培养物的方法，所述方法包括将至少一种蘑菇菌株开发技术应用至同核体品系n-s34，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，或者应用至菌株la3782的同核体，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，或应用至其后代，以提供新的培养物。优选的，所述新培养物特征在于：(a)所述培养物的作物的产量表现等于或超过双孢菇的br06/heirloom菌株的作物的产量表现，(b)所述培养物的作物的第三次出菇潮产量显著超过br06/heirloom菌株，以及(c)与br06/heirloom菌株的蘑菇产品相比，所述培养物的作物的蘑菇产品在收获后在4摄氏度下储存数天后保留更多的重量，天数选自3、4、5、6、7和8天。在一个优选的实施方案中，所述新培养物是传代自n-s34的f1杂交种、或是传代自菌株la3782衍生的菌株的f2、f3、f4或f5杂交种，并且具有包含表i中列出的n-s34或表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少100个标志物的表型，或具有包含双孢菇品系n-s34的基因组中存在的单核苷酸多态性(snp)的至少40-60％、至少20-30％、至少10-15％或至少4-8％的表型，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。
具体实施方式
28.如在本发明的培养物中，遗传同一性(例如，基因型)、系谱(genealogy)和谱系(pedigree)在菌种开发或育种过程中都密不可分地相互关联。以下关于生命周期以及异核和同核基因型的信息，以及关于亲本、后代、杂交种和传代菌株以及衍生的菌株的信息可以有助于阐明关系和预期。
29.形成蘑菇的真菌表现出世代交替，从异核(n+n，具有两个单倍体核，功能上类似于2n二倍体状态)到同核(1n)，并在进一步通过交配后再次成为异核。在大多数真核生物中，亲本通常被认为是二倍体或异核的。单倍体“世代”通常，但不总是称为配子(例如，花粉、精子)。在作为微生物的真菌中，单倍体世代可以无限期地独立生存和生长，例如，在实验室细胞培养中；虽然这些单倍体同核体在交配中起着配子的作用，但其等同于近亲繁殖品系(例如，植物的近亲繁殖品系)，更容易被称为品系(或杂交种的“同核体亲本”)。在此，根据上下文，独立术语“亲本”指的是异核培养物，其是单倍体品系培养物的直接祖代，或者是属于至少一个这样的品系交配获得的后来的异核世代(移除了祖代)的菌株。因此，术语“品系”狭义地指生命周期内的单倍体(n)同等位基因的(homoallelic)培养物。通过交配产生的、或包含育种种群的、或包含用于生产蘑菇作物的培养物的n+n异核体可以称为“菌株”。
30.现在，对于本发明以及如上所述，本发明至少涉及同核品系，以及更具体地，涉及包含命名为n-s34的双孢菇品系的至少一组染色体的培养物，以及使用命名为n-s34的品系的方法。n-s34品系是同核体，其基因组和基因型是单倍体，因此完全是同等位基因的(尽管其基因组中可以存在一些有限的重复dna区域)。
31.在第一个方面，本发明涉及双孢菇培养物，其至少包含双孢菇品系n-s34的染色体组，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。
32.如本文所公开的，双孢菇品系n-s34的培养物已经由索米赛尔公司(somycel，4rue carnot
–
zi sud,37130langeais)保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)。保藏的培养物是取自受让人索米赛尔公司(somycel，langeais，法国)在本技术的申请日之前维护的同一培养物，并且发明人和受让人已获得授权在任何和所有专利申请中提及该保藏的生物材料。保藏后所有限制已被取消，保藏旨在满足布达佩斯条约下的所有保藏要求。保藏日期为2020年6月30日。此外，该保藏将在保藏机构维持30年，或在最后一次请求后维持5年，或在任何专利的有效期限中维持(以较长者为准)，并将在此期间根据需要进行更换。在提交专利申请或颁发专利(以适用专利法的要求为准)时起，该保藏的培养物将不可撤销且不受条件限制地向公众公布。
33.基于全基因组测序，双孢菇蘑菇品系n-s34是一种单倍体、同核的丝状担子菌培养物，其在营养生长中产生菌丝的分支网络，即菌丝体。生长可以在固化(例如，基于琼脂的)介质表面产生基本上是二维的菌落，或在液体或固体基质材料中产生三维的团块。
34.包含命名为n-s34的双孢菇品系的至少一组染色体的培养物可以是同核体或异核体。其可以是(a)品系n-s34本身，(b)与n-s34具有完全的基因型同一性的培养物，与表i中呈现的n-s34等位基因的基因型一致，(c)具有至少一组基因型标志物的培养物，所述基因型标志物是n-s34的基因型标志物的子集，其代表n-s34中存在的标志物中的至少65％、70％、75％或80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或包含表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少100个标志物，(d)与n-s34具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％基因型同一性的培养物，和(e)具有n-s34作为直接亲本的f1杂交种，所述杂交种显示表i中列出的所有等位基因标志物(在其两个等位基因中的至少一个上)。
35.本发明的培养物包括与培养物n-s34具有至少一种系谱关系(genealogical relationship)的培养物，其中该系谱关系选自(1)同一性：即自身、克隆、亚培养物，(2)后代：即近亲繁殖后代、远缘交配后代、回交后代、f1杂交种、f2杂交种、f3杂交种、f4杂交种、f5杂交种，以及(3)衍生物：即衍生的培养物、体细胞选择(somatic selection)、组织选择、诱变培养物、转化培养物。请注意，当关系仅涉及单一亲本的后代时，所得的培养物也可以被认为是“衍生”自亲本培养物。
36.在一个优选的实施方案中，本发明的双孢菇培养物选自：
37.(a)品系n-s34，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，
38.(b)通过将品系n-s34与第二品系交配产生的f1杂交种菌株。
39.本发明还针对(b)中定义的所述f1杂交种菌株的同核体，所述同核体的基因组包含n-s34中存在的标志物的至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，其中至少一种标志物在n-s34中存在而在第二品系中不存在。
40.在一个优选的实施方案中，所述第二品系是从菌株bp-1(也称为aa0096或arp023或pta-6903)获得的同核体。
41.la3782是f1杂交的异核体菌株的一个示例，具有来自同核品系n-s34的远缘交配后代。其也被称为tuscan820。更准确地说，其是通过将品系n-s34与菌株bp-1的同核体(也称为aa-0096和arp-023)交配获得的。该菌株bp-1已根据管理生物保藏的布达佩斯条约保藏在美国马里兰州rockville的美国典型培养物保藏中心(atcc)，atcc登录号为pta-6903。
42.菌株la3782在3期系统中的3次出菇潮中生产的作物蘑菇约为39kg/m2(s.d.
±
1.98)，通常每个中等尺寸的蘑菇重量约为20-45克。当使用minolta比色计对30个蘑菇进行测量时，la3782蘑菇的菌盖颜色测量产生l-a-b颜色，l：71,49(s.d
±
2,9)，a:7,12(s.d.
±
1,02)，b:23,28(s.d.
±
1,28)。
43.在一个优选的实施方案中，本发明的培养物是菌株la3782，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。如本文所公开的，双孢菇菌株la3782的培养物已经由索米赛尔公司(somycel，4rue carnot
–
zi sud,37130langeais)保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)。保藏的培养物是取自受让人索米赛尔公司(somycel，langeais，法国)在本技术的申请日之前维护的同一培养物，并且发明人和受让人已获得授权在任何和所有专利申请中提及该保藏的生物材料。保藏后所有限制已被取消，保藏旨在满足布达佩斯条约下的所有保藏要求。保藏日期为2020年6月30日。此外，该保藏将在保藏机构维持30年，或在最后一次请求后维持5年，或任何专利的有效期限中维持(以较长者为准)，并将在此期间根据需要进行更换。在提交专利申请或颁发专利(以适用专利法的要求为准)时起，该保藏物的培养物将不可撤销且不受条件限制地向公众公布。
44.蘑菇培养物最可靠地是通过其基因型鉴定，这部分是因为市场需要的成功的栽培品种菌株符合狭窄的表型范围。基因型可以通过遗传标志物谱来表征，其可以识别同一品系、菌株或培养物的分离物(克隆或亚培养物)，或系谱相关的培养物，包括初始培养物的后
代或完全源自初始培养物的培养物，或者另外可以用于确定或验证累代的菌种发展谱系。
45.根据发明人评估数十种不同双孢菇品系和菌株的全基因组序列的经验，区分任何两个不相关的同核体的snp标志物的通常数量约为300,000个。这意味着，在一个系谱中，即使是1％的染色体组或基因型标志物传递，仍然表示与n-s34相关的约3000个独特的识别标志物。200个标志物、或者甚至6个高度多态性的标志物可以毫无疑问地确定培养物之间的同一性、父系来源和衍生关系，而数千个可用的snp标志物可以累积起来为建立多代之间的系谱相关性提供强有力的支持方法。
46.使用包括全基因组测序(wgs)加单核苷酸多态性(snp)标记和序列特征性扩增区域(scar)标记在内的多种技术，获得遗传标志物谱的方法是本领域众所周知的。由于这两种方法都可以分析特定基因座的序列，因此两者都为任何基因座提供相同的结果(请注意，在异核体分析中，wgs可以更深入地了解snp在单倍体序列上的分布；即等位基因序列的确认)。
47.已经获得了品系n-s34的整个基因组序列，因此，受让人肯定地知道品系n-s34的整个dna序列基因型的约95％(约30.2mb)。将参考基因组h97与品系n-s34区分开来的snp标志物总数(受让人已知)至少为141,923。在将n-s34与其他同核体区分开来时，该数字预计会更高。在表i和表ii中提供了在沿n-s34和la3782的13条染色体中的每条染色体中间隔分布的许多序列特征性标志物基因座中的品系n-s34和菌株la3782的基因型的简要描述。仅供参考，提供了wo2018/102990中公开的同核品系j147566s3的相同标志物基因座的序列。
48.表i&ii＝相关品系和菌株的203个snp标志物基因型
49.50.51.52.53.[0054][0055]
表i和ii包含分别存在于n-s34和la3782中的snp标志物组中，描述为9聚体。位置信息是指h97 v.2.0基因组序列汇集(jgi)的17个实质重叠群。因为异核体包含两组染色体，每组染色体来自每种单倍体亲本，所以在la3782的每个标志物基因座处有两个等位基
因拷贝(基因型的两个特征或元素)。iupac核苷酸和所谓的“歧义”代码(另见，如handbook on industrial property information and documentation的st25标准(wipo)(2009年12月)所示的核苷酸和氨基酸标识符，附件c，附录2，表i)，当用于表示异核体或二倍体基因型时，其实际上是异等位性(heteroallelism)代码，在表i和ii中用于代表异等位基因dna序列位置，其中在上面报道的观察到的9碱基dna标志物序列中，两个等位基因中的每一个在特定位置掺入了不同的核苷酸，其中每一个代表基因型标志物基因座。由源自美国能源部联合基因组研究所(u.s.department of energy joint genome institute)公开的h97 v2.0标准参考基因组序列(morin等人，2012)的支架和snp位置信息，指定每个标志物基因座的身份标识，通过引用并入本文。
[0056]
然而，应当理解，使用本领域公知的设计方法和使用合适的pcr引物，可以使用任何合适的跨越限定标志物区域的聚合酶链式反应(pcr)引物来识别等位基因。品系n-s34和品系h97的同等位基因的基因型之间的区别很明显，f1杂交种菌株la3782的示例异等位基因基因型的复合性质也是如此，如预期地，其中n-s34基因组的存在是明显的，因为其与la3782中明确已知的等位基因的存在完全一致，没有冲突。菌株la3782的基因型是品系n-s34和bp-1同核体基因型的复合体，表明可以在f1杂交基因型中观察到n-s34染色体组。以下提供了使用这些和其他标志物来确定培养物之间的系谱关系的方法。
[0057]
或者，可以使用6个scar标志物基因座p1n150、its、mfpc-1-elf、as、an和ff，如美国专利7,608,760、9,017,988及以下所述。每个都有约10个(或更多个)已知的等位基因，因此可能的异核基因型数量约为一万亿(10
12
)级别。这六个标志物是产业中六个最常引用的标志物基因座，并且被认为是在本领域标准命名的，因为在至少一个公开来源的出版物中，所有这六个标志物基因座都以一种形式或另一种形式用于表征伞菌属菌株的基因型。表iii中提供了这六个未连锁标志物基因座上相关等位基因的简要描述。这六个基因座上的基因型通过全基因组测序和scar-pcr确定，如以下的实验部分所述。
[0058]
表iii：本发明的n-s34品系和la3782菌株中的等位基因标志物
[0059]
支架id参考位置h97 2.0版n-s34la3782p1n150-g3-2(支架_1)8686151t22/5its(支架_10)1612110i1i1i1/i5mfpc-elf(支架_8)829770e1e1e1/e3an(支架_9)1701712n1n2n2/n3as(支架_4)752867sdsdsa/sdff(支架_12)281674ff1ff1ff1/ff3
[0060]
例如，表i至表iii的标志物可以用于凭经验确定范围内是否包含培养物。基因型分析，包括基于聚合酶链反应(pcr)的多态性区域分析或全基因组测序，通常用于确定与初始培养物的遗传同一性的程度和性质，以定义直接或间接衍生自双孢菇中初始培养物的培养物类别。衍生的菌株或培养物中的所有标志物将对应于初始菌株或培养物中的标志物，或者在衍生的菌株或培养物中标志物的代表性通常高于90％，但不低于65或70％，优选不低于75％。使用足够数量的遗传标志物，尤其是表iiii中的6个高度多态性标志物，可以明确确定衍生菌株或培养物的状态，并且在统计学上无可挑剔。类似的分析可以确定两种培养物之间关系的性质，所述培养物包括自身、克隆、亚培养物、体细胞选择、组织选择、近亲
繁殖后代、远缘交配后代、回交后代、转化培养物、诱变培养物、f1杂交种和杂交种的下代，具有很高的统计置信度。
[0061]
在一些实施方案中，本发明的培养物可以使用至少一种选自以下的菌株开发技术获得：近亲繁殖，包括内源杂交(intramixis)、外杂交(outbreeding)，即异源杂交(heteromixis)、自交、回交、内渗性状转换(introgressive trait conversion)、衍生、体细胞选择、组织选择、单孢子选择、多孢子选择、谱系辅助育种、标志物辅助选择、诱变和转化，以及将所述至少一种菌株开发技术应用于第一蘑菇培养物或其部分，所述第一培养物包括至少一个双孢菇品系n-s34的染色体一组。
[0062]
如果一种亲本品系在特定基因座携带等位基因“p”，而另一种亲本品系携带等位基因“q”，则由这两个品系交配产生的f1杂交种将携带两个等位基因，该基因座的基因型可以表示为“p/q”(或“pq”或“p+q”)。序列特征性标志物通常是共显性的，当对杂交种的细胞dna执行合适的测序方案时，两个等位基因将是明显的。在确定菌株或杂交种的基因型谱后，因此，参考品系n-s34的基因型谱可用于识别包含品系n-s34作为亲本或亲本品系的杂交种，因为此类杂交种将包含两组等位基因，其中一组将来自品系n-s34、以及将与品系n-s34相匹配。可以通过从基因型中减去第二等位基因以证明匹配，在每个基因座留下明显的n-s34等位基因。由于杂交种中存在的异核体(n+n)情况，可能用双孢菇的杂交种对这种方法进行改良。两个(减数分裂前，非重组的)单倍体细胞核可以通过各种已知技术(例如，原生质体技术)物理分离成活的“新合子(neohaplont)”亚培养物，然后每个都可以独立地表征。来自f1杂交种的两个新合子细胞核基因型之一是品系n-s34的基因型，证明其之前用在该方法的交配步骤中，并且其在杂交种中存在。通过使用原生质体、片段化、菌丝尖端切除或其他技术重新分配单个单倍体细胞核，从异核体(包括本发明的异核培养物)获得去异核化的新合子同核体，是一种培养物衍生的方法。
[0063]
如下文实验部分所述，与主要的商业菌株heirloom/br06相比，la3782具有更高的产量、更平衡的产量(由于提高了第三次爆发的产量)以及蘑菇具有提高的保藏质量。凭借着与其他已知棕色菌盖菌株有着超过30％的差异的新型基因型，la3782实现了这些改良(参见表vi)。该基因型还赋予与其他主要棕色菌盖菌株不亲和的表型，为内源性病毒的感染提供屏障，这一性状可以被农场卫生方案利用。此外，遗传差异性提供了全球蘑菇作物的遗传多样化，这将为应对可食用双孢菇蘑菇种植和销售的多样化市场中现有和出现的挑战提供新的机会。
[0064]
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的菌株培养物的特征在于所述培养物的作物的总产量表现等于或超出双孢菇的br06/heirloom或j15051菌株的作物的总产量表现。总产量表现可以在大规模试验中按以下定义进行测量。在这样的试验期间，孵育期可以是，例如批量三期通道(tunnel)的18天，菌种体接种率可以是8升/吨二期堆肥。托盘可以填装135千克孵育堆肥，填装率为90kg/m2。可按1.33kg/m2的比率添加mc基质补充物。供应商euroveen的carbo 9覆盖可与1200g/m2堆肥覆盖一起预混使用。可在覆盖后第4天开始通气。为了收集产量，可以每天采摘蘑菇并称重，至少重复三次。可以通过多次出菇潮收集数据。应比较相同出菇潮的总产量。
[0065]
在本发明的另一个实施方案中，本发明的菌株培养物的特征在于所述培养物的作物的第三次出菇潮产量显著超出br06/heirloom菌株的产量。产量表现可以如上定义地测
量。优选地，通过至少三次出菇潮来收集数据。在一个优选的实施方案中，当在相同的条件下培养和采摘时，本发明的菌株的第三次出菇潮的产量超出br06/heirloom第三次出菇潮的产量，比其多15％以上，优选多20％以上，更优选多30％以上。以下的实施例表明，la3782的第三次出菇潮的产量还高于现有技术的两种其他菌株(即tuscan和j15051)所测量的第三次出菇潮的产量(表viii)。在一个优选的实施方案中，当在相同的条件下培养和采摘时，本发明的菌株的第三次出菇潮的产量超出tuscan和j15051第三次出菇潮的产量，比其多15％，优选多20％，更优选多30％。
[0066]
在另一个实施方案中，本发明的培养物是双孢菇菌株，其生产的蘑菇的单重显著高于br06/heirloom生产的蘑菇。可以在蘑菇生产的第一次和第二次出菇潮中，对几种中等尺寸的蘑菇(通常直径为4-5厘米)评估这种性状。每个重复都单独称重。在一个优选的实施方案中，当在相同的条件下培养和采摘时，在第一次出菇潮之后，本发明的菌株的蘑菇单重超出br06/heirloom和tuscan蘑菇单重，比其多10％以上，优选多20％以上，更优选多30％以上(下表x)。
[0067]
在另一个实施方案中，与br06/heirloom菌株的蘑菇产品相比，所述培养物的作物的蘑菇产品在收获后在4摄氏度下储存数天后保留更多的重量，天数选自3、4、5、6、7和8天。该测量可以如以下实验部分中所公开的那样进行。可如以下实施例部分中所公开的那样进行单重收集。优选在第一次出菇潮中评价单重，例如对每个菌株评价三到五个重复的发泡聚乙烯抽屉(styrofoam till)。简而言之，记录空抽屉的重量，然后将规定数量的蘑菇放入每个抽屉中，间距足够大，使其不会相互接触。将其茎向上放置，并立即称重。这个重量对应于“初始重量”。然后将抽屉放在4℃的步入式冷库中放置8天。每天记录抽屉重量。减去空抽屉的重量后，可以计算重量保留的百分比。
[0068]“显著”在本文中是指，根据比较来自两种或更多种处理的一系列定量结果的t检验或其他参数统计检验，本发明的菌株的第三次出菇潮的产量/蘑菇重量优于参考菌株的产量/蘑菇重量，其中概率/p值低于或等于0.05或更小。
[0069]
在另一个实施方案中，本发明的菌株培养物能够产生与la3782菌盖颜色相似的蘑菇，如下表xi中所述。
[0070]
在本发明的一个优选的实施方案中，如上所述的本发明培养物的特征在于：(a)所述培养物的作物的产量表现等于或超过双孢菇的br06/heirloom菌株的作物的产量表现，(b)所述培养物的作物的第三次出菇潮产量显著超过br06/heirloom菌株，以及(c)与br06/heirloom菌株的蘑菇产品相比，所述培养物的作物的蘑菇产品在收获后在4摄氏度下储存数天后保留更多的重量，天数选自3、4、5、6、7和8天。菌株br06/heirloom已根据管理生物保藏的布达佩斯条约，以atcc登录号pta-6876保藏在美国马里兰州rockville的美国典型培养物保藏中心(atcc)。
[0071]
双孢菇和其他担子菌真菌表现出的另一种基因决定的现象是营养不亲和性。根据经验，经常观察到在物理接触中，第一菌株无法与其他任何遗传上不同的菌株(换句话说，与第一菌株具有不完全遗传同一性的任何其他菌株)自由融合(吻合)并在一起生长。对于“模型”担子菌的遗传学，只是部分了解，但已知涉及多个基因和等位基因提供如此大量的组合，出于实践目的，每个基因型(和每个独立菌株，包括野生菌株、栽培品种和杂交种)极不可能在第二菌株中再次出现，因此实际上是独一无二的。营养不亲和表型具有两个重要
的商业和技术意义。首先，通过使用在作物测试中使两种菌株配对的操作方案，并评估它们的相互作用，这提供配对的菌株之间独立于“遗传指纹”的同一性或非同一性的实用测试。其次，不同菌株之间的营养不亲和性延缓甚至阻止有害病毒在不同菌株之间的传播，这可以改善设施卫生和提高盈利。
[0072]
在本发明的优选的实施方案中，本发明的培养物与现有技术的菌株，特别是与菌株br06/heirloom或b14528/tuscan在营养上不亲和，如下所示。
[0073]
在一个优选的实施方案中，本发明的培养物是双孢菇菌株的培养物，其与以下菌株的遗传相似性少于99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、75％、70％或60％，所述菌株是br06/heirloom和b14528/tuscan，优选的，是具有商业销售历史并且现有技术的专利案记录中存在的任何棕色菌盖菌株群，该群具体包括s600/x618、bs526、fr24、brawn、j15051、br06/heirloom和b14528/tuscan。
[0074]
在其他实施方案中，本发明的培养物获自菌株开发技术并且是从本发明的品系/菌株培养物衍生的、传代的或以其他方式获得的培养物。因此，由此产生的培养物与初始培养物具有至少一种谱系关系，其中该系谱关系选自(1)同一性，即自身、克隆、亚培养物，(2)后代，即近亲繁殖后代、远缘交配后代、回交后代、f1杂交种、f2杂交种、f3杂交种、f4杂交种、f5杂交种，以及(3)衍生物，即衍生的培养物。
[0075]
la3782是f1杂交种菌株，其具有n-s34作为一亲本，以及来自菌株bp-1的同核体作为第二亲本。在掺入来自n-s34的染色体组和基因型标志物的f1代菌株中，由于是来自n-s34亲本的直接后代，50％的异核菌株的基因型标志物将是来自n-s34的那组的基因型标志物。传代自n-s34的该系谱的f2杂交种将在其基因型标志物中具有平均25％，通常约20-30％的来自n-s34的基因型标志物。传代自n-s34的该系谱的f3杂交种将在其基因型标志物中具有平均12.5％，通常约10-15％的来自n-s34的基因型标志物。传代自n-s34的该系谱的f4杂交种将在其基因型标志物中具有平均6.25％，通常约4-8％的来自n-s34的基因型标志物。传代自n-s34的该系谱的f5杂交种将在其基因型标志物中具有平均3.13％，通常约1.5-4.5％的来自n-s34的基因型标志物。换句话说，n-s34的f1后代将包含表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的约100个，f2后代将包含表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的约50个，n-s34的f3后代将包含表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的约25个，以及f4后代将包含表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的约10个。
[0076]
本发明的培养物是双孢菇菌株，其与(a)品系n-s34或(b)菌株la3782具有同一性的系谱关系、或是其后代或由其衍生。更准确地说，本发明的培养物可以具有以下培养物之一作为其来源的初始培养物：双孢菇单倍体品系培养物n-s34、包含至少一组双孢菇品系n-s34的染色体的单倍体品系培养物、通过将n-s34与第二培养物交配产生f1代获得的杂交异核培养物、任何f2、f3、f4、f5代的培养物(包括从发明的f1代获得的)、通过使用至少一种菌株开发技术从品系n-s34获得的培养物、n-s34的近亲繁殖后代、n-s34的远缘交配后代，以及通过使用至少一种菌株开发技术从n-s34获得的任何培养物的衍生品种。
[0077]
在一个特定方面，本发明涉及双孢菇蘑菇菌株培养物的f2、f3、f4或f5代，其传代自如上定义的f1杂交种，优选的是传代自f1杂交种la3782，或者其传代自菌株la3782衍生的菌株。所述菌株优选地分别包含双孢菇菌株la3782的基因组中存在的单核苷酸多态性
(snp)的至少40-60％、至少20-30％、至少10-15％或至少4-8％，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。
[0078]
更准确地说，la3782的f1后代(n-s34的f2后代)将包含表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约100个等位基因标志物、以及表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约50个等位基因标志物；f2后代将包含表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约50个、以及表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约25个；la3782的f3后代将包含表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约25个、以及表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约10个。
[0079]
换句话说，本发明的菌株培养物优选包含表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约100个(la3782的f1后代)，表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约50个(la3782的f2后代)、或表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约25个(la3782的f3后代)。
[0080]
本发明的菌株培养物不是bp-1，其已根据管理生物保藏的布达佩斯条约，以atcc登录号pta-6903保藏在美国马里兰州rockville的美国典型培养物保藏中心(atcc)。在一个优选的实施方案中，本发明的菌株培养物在其至少10％、20％、30％、40％或至少50％的等位基因标志物上不同于bp-1。换言之，本发明的菌株培养物与bp-1的同一性不超过90％、80％、70％、60％或50％。
[0081]
在一个实施方案中，本发明的培养物具有的染色体组与品系n-s34的培养物、优选与品系n-s34与第二种不同的双孢菇培养物交配产生的f1杂交种的培养物、更优选与菌株la3782的染色体具有至少65％、至少70％或至少75％的基因型和基因组同一性。
[0082]
在一个具体实施方案中，本发明的菌株是f2杂交种，其具有f1杂交种异核体培养物la3782作为至少一个亲本，以及具有包含f1杂交种基因型中存在的等位基因标志物的50％的至少一个单倍体染色体组；f3杂交种，其具有所述f2杂交种作为至少一个亲本，以及具有包含f2杂交种基因型中存在的等位基因标志物的50％的至少一个单倍体染色体组；f4杂交种，其具有所述f3杂交种作为至少一个亲本，以及具有包含f3杂交种基因型中存在的等位基因标志物的50％的至少一个单倍体染色体组；以及f5杂交种，其具有所述f4杂交种作为至少一个亲本，以及具有包含f4杂交种基因型中存在的等位基因标志物的50％的至少一个单倍体染色体组。
[0083]
双孢菇品系n-s34基因组中存在的snp可以通过全基因组测序或使用常规标志物(如美国专利7,608,760或9,017,988中描述的标志物)容易地识别。表i给出一些表征本发明品系n-s34的有用的序列。然而，可以使用任何其他snp以识别本发明品系的后代。
[0084]
双孢菇菌株la3782基因组中存在的snp可以通过全基因组测序或使用常规标志物(如美国专利7,608,760或9,017,988中描述的标志物)容易地识别。表ii和表iii给出一些表征本发明的菌株la3782的有用的序列。然而，可以使用任何其他snp以识别本发明菌株的后代。
[0085]
在一个优选的实施方案中，本发明的双孢菇蘑菇菌株培养物传代自品系n-s34，并且包含双孢菇品系n-s34基因组中存在的snp(优选表i中公开的snp)中的约50％、约25％、
约12.5％、约6.25％或约3.13％。在另一个优选的实施方案中，本发明的双孢菇蘑菇菌株培养物传代自品系n-s34，并且包含表i中列出的n-s34的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约100个、在50至100个之间、在25至50个之间或在10至25个之间的等位基因标志物。
[0086]
在一个优选的实施方案中，本发明的双孢菇蘑菇菌株培养物传代自菌株la3782，并且包含双孢菇菌株la3782基因组中存在的snp(优选表ii和表iii中公开的snp)中的约50％、约25％、约12.5％、约6.25％或约3.13％。在另一个优选的实施方案中，本发明的双孢菇蘑菇菌株培养物传代自菌株la3782，并且包含表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约100个、在50至100个之间、在25至50个之间或在10至25个之间的等位基因标志物。
[0087]
本文中的术语“约(approximately)”或“约(about)”包括高于或低于规定值的正负20％的范围。
[0088]
为计算两个菌株之间的snp百分比，可以比较每个基因座的复合9聚体基因型，并指定值，如果完全匹配，则指定为1，或者对于任何不完全匹配，指定为0。然后可以对菌株之间的每个成对比较中的所有基因座的值进行总计，除以比较的基因座总数。所得小数最终可以转换为％。
[0089]
在另一个实施方案中，本发明的培养物包含至少一组染色体，其与n-s34的染色体具有至少65％、70％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的遗传同一性。在进一步的实施方案中，本发明的培养物包含至少一组染色体，其具有的基因型含有至少65％、70％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的n-s34的染色体中存在的标志物代表。
[0090]
更准确地说，本发明的双孢菇蘑菇培养物可以衍生自选自以下的初始培养物：
[0091]
a)菌株la3782，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，
[0092]
b)双孢菇品系n-s34，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，以及
[0093]
c)上述定义的任何培养物。
[0094]
优选的，所述培养物的特征在于其包含至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的表i中列出的n-s34或表ii中列出的la3782的序列特征性等位基因标志物。
[0095]
另一个方面，本发明涉及获自上述后代和衍生的培养物的细胞、菌丝、菌丝体、蘑菇、萌发的孢子、未萌发的孢子、同核体和异核体，包括snp、nsnp和非整倍体。
[0096]
本发明还涉及产生本发明的品系和菌株的方法。特别地，本发明涉及一种用于开发新的双孢菇培养物的方法，所述方法包括将至少一种蘑菇菌株开发技术应用至同核体品系n-s34，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，或应用至其后代，以提供新的培养物。
[0097]
本发明还涉及一种用于开发新的双孢菇培养物的方法，所述方法包括将至少一种
蘑菇菌株开发技术应用至菌株la3782的同核体，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，或应用至其后代，以提供新的培养物。
[0098]
优选的，所述新培养物具有本发明菌株的上述任何特征。
[0099]
具体而言，所述新培养物将优选具有以下任何期望的性状：(a)提高的总产量表现，(b)提高的第三次出菇潮产量，(c)良好的重量和/或(d)棕色。
[0100]
在优选的实施方案中，所述新培养物将具有：
[0101]
(a)作物的产量表现等于或超过双孢菇br06/heirloom菌株的作物的产量表现，和/或
[0102]
(b)作物的第三次出菇潮产量超过br06/heirloom菌株，
[0103]
和/或
[0104]
(c)与br06/heirloom菌株的蘑菇产品相比，作物的蘑菇产品在收获后在4摄氏度下储存数天后保留更多的重量，天数选自3、4、5、6、7和8天。
[0105]
以上已经详细描述了这些特征。菌株br06/heirloom已根据管理生物保藏的布达佩斯条约，以atcc登录号pta-6876保藏在美国马里兰州rockville的美国典型培养物保藏中心(atcc)。
[0106]
在一个特别优选的实施方案中，该新培养物将是传代自f1杂交种la3782或传代自菌株la3782衍生的菌株的f2、f3、f4或f5代。因此，其可以分别包含双孢菇菌株la3782的基因组中存在的单核苷酸多态性(snp)的至少40-60％、至少20-30％、至少10-15％或至少4-8％，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。
[0107]
优选的，所述snp是所述杂交种的整组snp或其子集，例如，在表ii或表iii中公开的子集。
[0108]
许多菌株开发技术是本领域已知的。其中一些详述在以下本技术的定义部分中。可以使用任何已知的技术。
[0109]
将期望的性状引入培养物，例如引入双孢菇品系n-s34中，可以包括以下步骤：(1)将双孢菇品系n-s34的培养物与具有期望性状的双孢菇的第二所得培养物进行物理(physically)交配，以产生杂交种；(2)获得后代，其携带至少一个决定来自该杂交种中的期望性状的基因；(3)将所述杂交种的后代与双孢菇品系n-s34的培养物交配，以产生新的杂交种；(4)重复步骤(2)和(3)至少一次，以产生后续(subsequent)杂交种；(5)获得来自步骤(4)的后续杂交种的杂核品系，其携带至少一个决定期望性状的基因，并且包含品系n-s34的等位基因的至少75％，例如在表i中描述的序列特征标志物基因座。
[0110]
回交(back-mating)(回交(backcross))中数量“亲本dna的75％”是近似值，因为在f1杂交种中发生的减数分裂中，重组或未重组染色体的随机分类(assortment)将导致单倍体/同核细胞核具有或多或少的来自两个亲本中每一个的dna，平衡在约50％的平均值(在回交中变成25％的平均值)。
[0111]
在另一个方面，本发明涉及产生蘑菇培养物的方法，包括步骤：
[0112]
(a)使本发明的培养物(通常为n-s34或la3782)与第二双孢菇培养物交配而产生
的后代培养物生长；
[0113]
(b)将后代培养物与自身、或不同的培养物交配以产生后续代的后代培养物；
[0114]
(c)使后续代的后代培养物生长，并将后续代的后代培养物与自身、或不同的培养物交配；以及
[0115]
(d)对另外的0至5代重复步骤(b)和(c)，以产生蘑菇培养物。
[0116]
在一个具体实施方案中，所述方法包括步骤：
[0117]
(a)获得双孢菇蘑菇品系n-s34或la3782的分子标志物谱；
[0118]
(b)获得f1杂交种培养物，其包含双孢菇品系n-s34或菌株la3782的至少一组染色体；
[0119]
(c)将从f1杂交种培养物(b)获得的培养物与不同的蘑菇培养物交配；以及
[0120]
(d)选择具有品系n-s34或菌株la3782的所述分子标志物谱的表征的后代。
[0121]
在另一个方面，本发明涉及生产可食用蘑菇的方法，包括用本发明的异核培养物接种堆肥以生产蘑菇作物的步骤。本发明的又一个实施方案是提高农场卫生的方法，包括用本发明的培养物接种堆肥的步骤。本发明的又另一个实施方案是作物多样化的方法，包括用本发明的培养物接种堆肥的步骤。
[0122]
另一个方面，本发明还涉及任何掺入了本发明的培养物的产品，包括菌种体、接种物、蘑菇、蘑菇部分、蘑菇片、加工食品。所有这些术语都在以下的“定义”中限定。
[0123]
定义
[0124]
最初，为了提供对说明书和权利要求的清楚和一致的理解，包括赋予这些术语的范围，提供以下定义。
[0125]
等位基因：由突变产生的并在染色体上的同一位置发现的基因的两种或更多种替代形式之一；位于限定的基因座中的基因组的可遗传单位，最终由其dna序列(或通过其他方式)识别。
[0126]
同宗异宗配合(amphithallism)：其中异源杂交(heteromixis)和内源杂交(intramixis)都活跃的生殖综合征。
[0127]
吻合：实现细胞质连续性的两个或更多个菌丝的融合。
[0128]
担子菌：在担子上产生减数孢子的单系真菌群；真菌相应分支，如担子菌目(basidiomycetales)或担子菌亚门(basidiomycotina)的成员。
[0129]
担子果：减数孢子囊细胞，其中发生核配合(karyogamy)和减数分裂，并在其上形成担孢子。
[0130]
生物效率：对于蘑菇作物，对于任何给定的采样作物面积或堆肥重量，收获作物的净鲜重除以菌种体接种时堆肥基质的干重。
[0131]
育种：使用强调有性交配的方法开发菌种、品系或培养物。
[0132]
菌盖：菌盖(pileus)；蘑菇的部分，含有菌褶的结构。
[0133]
菌盖圆度：严格地说，是在纵向对切的蘑菇上，测量菌盖最上部和最下部之间的最大距离除以穿过菌盖的最大距离的比率；通常对许多样本取平均；主观上，菌盖形状的“圆形”特性。
[0134]
载体基质：适合实现培养物的生长和分散的兼具营养和物理特性的介质；示例是为蘑菇菌种体、覆盖接种物和其他接种物配制的基质。
[0135]
覆盖层、覆土、覆盖：施加至大量定殖(colonized)堆肥的上表面以允许蘑菇作物发育的非营养物质层，如泥炭或土壤。
[0136]
覆盖接种物(ci)：掺入了蘑菇培养物(通常是限定的异核菌株)的接种物材料制剂，适合混合到覆盖层。
[0137]
克隆：未经选择的体细胞繁殖；产生克隆，其是系谱关系中的一个类别(即“身份”)。
[0138]
组合(combining)能力：个体将卓越表现传递给其后代的能力。一般组合能力是个体在特定系列交配中的平均表现。
[0139]
亲和性：参见异核亲和性、营养亲和性、性亲和性；不亲和性与亲和性相反。
[0140]
培养物：真实的活的生物体；生物体在各种生长介质和基质上繁殖；一种物理上的菌株、品系、同核体或异核体的部分或全部；培养物所有部分的总和，包括菌丝、蘑菇、孢子、细胞、原生质体、细胞核、线粒体、细胞质、dna、rna和蛋白质、细胞膜和细胞壁。
[0141]
衍生：通常使用性交配以外的方法开发菌株、品系或培养物，和/或仅从或主要从初始菌株或培养物进行开发；参见衍生的菌株、衍生的培养物。
[0142]
衍生的培养物：通过上述定义的衍生获得的培养物，例如，但不限于“衍生的菌株”或“衍生品系”；一类系谱关系。
[0143]
衍生的谱系群：仅源自单一初始菌株或培养物(这是该群中最早的成员)的菌株或培养物组。
[0144]
衍生的菌株/品系：仅从或主要从单一初始菌株/品系开发的菌株/品系。用于从初始菌株/品系获得衍生菌株/品系的方法包括体细胞选择、组织培养物选择、单孢子萌发、多孢子萌发、自交、重复地与初始培养物回交、诱变和转化以提供一些示例。在双孢菇中，衍生菌株的特性包括对初始菌株的基因型和表型的高度保真度。在体细胞选择和组织培养物选择中，衍生的培养物可能是初始培养物的克隆、或实际上的克隆，并且用于具有诱变，可能无法确定与初始菌株的实际差异；与初始菌株的可测量的遗传同一性可以达到100％。在转化的衍生菌株中，99.99+％的遗传组成是初始菌株的遗传组成；一小部分引入的dna通常是可识别的。在单孢子萌发和多孢子萌发中，衍生菌株的遗传组成的100％是初始菌株的遗传组成；然而，由于异等位性(“杂合性”)的重组损失，在衍生的菌株中可以缺少平均约1％(范围在约0-5％)的初始遗传物质，因此“衍生的基因型”是初始菌株的“主要集合”的子集。在来自初始菌株的两个亲和的单倍体同核后代之间的自交同胞交配中，衍生菌株的遗传组成的100％是初始菌株的遗传组成；然而，初始异等位性的平均损失约为20％，这低于孟德尔预期的近25％，这是由于在存在交配的亲和性基因座mat的大染色体1上强制保留了异等位性。只有在f1杂交种与初始菌株的回交交配中，衍生的基因型的很大一部分(平均约25％)不存在于初始培养物中；随着与初始培养物的反复回交交配，非初始遗传物质的百分比会降低并接近于零。当目标是保留初始菌株中不存在的特定性状时，回交可称为“单一性状转换”。
[0145]
后代：有限数量(例如，10或更少)的有性世代的系谱后代；一类系谱关系。
[0146]
二倍体：在单个细胞核包膜内有两个单倍体染色体互补。
[0147]
定向诱变：改变至少一个具体基因基因座的dna序列的方法。
[0148]
肉厚度：在纵向对切的蘑菇上测量的茎的最上方与菌盖的最上部分之间的最大距
离除以穿过菌盖的最大距离的比率；通常对许多样本进行平均；主观上，称为“多肉性”。
[0149]
出菇潮：在收割周期内由非生产期间隔分隔开的蘑菇生产期；术语出菇潮包括术语“爆发(break)”和“波(wave)”，可以理解为这些术语中的任何一个。
[0150]
真菌：分类为真菌界成员的微生物。
[0151]
系谱关系：一个或多个祖代的身份、传代或衍生的亲缘关系，例如亲本与后代之间的关系。
[0152]
遗传同一性：区分个体的遗传信息，包括所述遗传信息的代表，如，包括：基因型、基因型指纹、基因组序列、遗传标志物谱；“遗传上相同”＝100％的遗传同一性，“x％遗传相同”＝具有x％的遗传同一性等。当该百分比小于100时，可以使用遗传相似性％代替遗传同一性％。
[0153]
基因型指纹：一组定义的标志物基因座上的基因型描述；已知的基因型。
[0154]
遗传相似性(或基因型相似性)：一组遗传标志物(即，一种基因型)与另一组相似程度的表达。可以使用遗传标志物(例如snp标志物)的任何代表性组(set)。两个个体或培养物的基因型中共有的标志物的比例可以表示为定量两种培养物之间的相似程度，并且是其独特性的反比例测量值。这些术语可以与(百分比)遗传或基因型同一性互换使用。相似性百分比可以基于任何标志物组的基因型。
[0155]
菌褶：薄片(lamella)；蘑菇的部分，含有子实层体和担子果的结构。
[0156]
单倍体：只有细胞核染色体的单一互补物；参见同核体。
[0157]
异等位基因：在一个基因座上有两个不同的等位基因；类似于杂合子。
[0158]
异等位性：异核基因型中同源染色体之间的差异；类似于杂合性。
[0159]
异核体：作为本领域的术语，其指的是有性异核体：一种培养物，其在共同的细胞质中具有两个互补(即，在mat基因座处必然是异等位基因的)类型的单倍体细胞核，因此在功能和生理上类似于二倍体个体(但细胞遗传学上表示为n+n而不是2n)，以及其具有生殖能力(在除mat之外的基因座上没有任何罕见的干扰性遗传缺陷)，并且其表现出与其他异核体的营养不亲和反应；在菌株开发的上下文中也称为菌株或种群。
[0160]
异核体亲和性：在两个遗传不同的异核体之间的物理接近或接触期间没有观察到拮抗作用；参见异核体不亲和性。
[0161]
异核体不亲和性：在两个遗传不同的异核体之间在物理接近或接触期间观察到拮抗现象；多基因座自身/非自身识别系统；即，允许一种异核体培养物区分和识别另一种培养物是自身还是非自身的遗传系统，该系统在担子菌异核体中作用以限制吻合(菌丝融合)和细胞质接触；营养不亲和性。
[0162]
异核的：具有异核体的特征：两个单倍体细胞核在共同的细胞质中；通常被认为是指两个性互补细胞核，但也有例外。
[0163]
异源杂交：涉及在两个不同的非同胞的单倍体个体或配子之间交配的生命周期；外杂交。
[0164]
同等位基因：在一个基因座上具有不超过一个等位基因。二倍体生物中的等效术语是“纯合子”。根据定义，单倍体品系在所有非复制基因座处定义为完全同等位基因。
[0165]
同核体：具有单一类型(或体细胞谱系)的单倍体细胞核的单倍体培养物(细胞遗传学上表示为n)，通常无生殖能力，并且与异核体不表现出典型的自我/非自我不亲和反
应，可以作为有性互补吻合中的配子；与近亲繁殖的植物品系一样，将一致的基因型传递给后代的“品系”；交配良好但结果较差的主要同等位基因的品系是用于菌株开发目的推定同核体；参见以下的讨论。
[0166]
同核的：具有同核体特征的；单倍体。
[0167]
杂交种：双亲起源的，通常应用在受控交配中产生的异核菌株和培养物。
[0168]
杂交：物理关联，例如，在含有基于无菌琼脂营养介质的培养皿上的两种培养物(通常是同核体)试图实现吻合、胞质融合和形成有性异核体(＝交配)；延续上述。
[0169]
菌丝：菌丝体的线状成分，由细胞状区室组成。
[0170]
近亲繁殖：交配，包括同胞品系的交配(
‘
自交’)、与亲本品系或菌株的回交交配以及内源杂交；涉及遗传相关的亲本的生殖。
[0171]
诱导的诱变：改变至少一个基因座的dna序列的非自发的方法。
[0172]
初始菌株、初始培养物：在菌株衍生过程中用作唯一或主要起始材料的菌株或培养物；更特别地，从中获得衍生菌株或衍生培养物的菌株或培养物；衍生的谱系群的最早成员。
[0173]
不亲和性：参见异核体不亲和性。
[0174]
接种物：处于允许培养物在例如新介质上传递和繁殖的形式的培养物；专门的商业接种物类型包括菌种体和ci，其中培养物存在于载体基质上。
[0175]
内源杂交：单一亲本的有性生命周期，涉及在担子或单个孢子内的减数分裂后的细胞核中的互补“交配”对形成；表面上看起来是无性过程。
[0176]
内渗性状转换：将杂交种的后代与亲本品系或菌株交配，从而将来自一个菌株的期望性状引入另一亲本品系或菌株的优势遗传背景中。
[0177]
薄片：见
‘
菌褶’。
[0178]
品系：用在交配中以产生杂交种菌株的培养物；通常是同核体，因此是同等位基因的，否则是高度同等位基因的非异核(非nsnpp)的培养物；实际上，是一种功能性同核的，以及完全或主要是同等位基因的培养物；类似于在植物育种中的主要或完全纯合的近亲繁殖品系。
[0179]
谱系群：参见
‘
衍生的谱系群：仅衍生自单一初始菌株或培养物的菌株或培养物组。
[0180]
基因座(locus)：基因组中的确定的连续部分，虽然在不同基因型之间经常不同，但具有同源性；复数：基因座(loci)。
[0181]
标志物辅助选择：使用包括分子标志物在内的连锁遗传标志物以在后代中和通过谱系追踪感兴趣的决定性状的基因座。
[0182]
mat：决定有性亲和性和异核状态的交配类型的基因座。
[0183]
交配：通过吻合和胞质融合的两种培养物的有性结合；获得蘑菇培养物之间受控交配的方法是本领域众所周知的。
[0184]
菌丝体：蘑菇生物体的营养体或菌体，由线状菌丝组成。
[0185]
蘑菇：伞菌真菌的生殖结构；伞菌；同名的栽培食品。
[0186]
新合子：将异核体通过物理去异核化(还原为单倍体组分)获得的单倍体培养物或品系；由体细胞获得的同核体；衍生的同核体。
[0187]
后代(offspring)：单代内(例如亲本异核体)的后代(descendant)；最常用于描述从蘑菇菌株的孢子获得的培养物。
[0188]
外杂交：在不相关的或远源相关的个体之间的交配。
[0189]
亲本：个体的直系祖代；亲本菌株是异核体；亲本品系是同核体；异核体可以通过中间亲本品系/同核体后代成为f1异核体的亲本。
[0190]
谱系辅助的育种：使用系谱信息以识别受控交配计划中的期望的品系组合。
[0191]
表型：在环境中表达和表现的菌株或品系的可观察的表征。
[0192]
胞质融合：通过吻合建立的细胞质连续性，导致有性异核体的形成。
[0193]
祖代：包括亲本(即直接祖代)在内的上代。
[0194]
后代(progeny)：见后代(offspring)。
[0195]
自交：兄弟姐妹品系之间的交配；还参见内源杂交。
[0196]
性亲和性：在mat基因座处具有等位基因非同一性的不同品系之间的情况，使得两种品系能够交配以产生稳定且具有生殖能力的异核体。当两个品系在mat基因座上各自具有相同的等位基因时发生相反的情况(性不亲和性)。
[0197]
体细胞的：“营养菌丝体的”。
[0198]
菌种体：蘑菇培养物，通常是异核体的纯培养物，通常在易碎和可分散的颗粒物质的无菌基质(在某些情况下是谷粒)上；用于堆肥的商业接种物；提及菌种体，包括提及基质上的培养物。
[0199]
孢子：蘑菇的一部分，生殖繁殖体。
[0200]
茎(stem)：菌柄(stipe)；蘑菇的部分，支撑菌盖的结构。
[0201]
无菌生长介质：通过高压灭菌或其他方法灭菌的支持生物体生长的营养介质；示例包括基于琼脂的固体营养介质，如马铃薯葡萄糖琼脂(pda)、营养肉汤和许多其他材料。
[0202]
菌柄：见
‘
茎’。
[0203]
菌株：具有限定的表征或具体身份或上代的异核体。
[0204]
靶向诱变：改变至少一个具体基因基因座的dna序列的方法。
[0205]
组织培养：从蘑菇的分化组织的繁殖中获得的去分化(de-differentiated)的营养菌丝体。
[0206]
性状转换：一种将一个(即，单基因座转换)或多个期望性状的遗传决定簇选择性引入初始菌株的遗传背景，同时保留初始菌株的大部分遗传背景的方法。参见“内渗性状转换”和“转化”。
[0207]
转化：通过将外来(外源)dna掺入个体细胞的基因组或细胞质中，以改变该个体细胞携带的遗传物质的方法；获得性状转换(包括单基因座转换)或新的性状的方法。
[0208]
营养亲和性：在两个遗传不同的异核体之间在物理接近或接触期间没有观察到拮抗现象，这是由多基因座自我/非自我识别系统决定的，其在担子菌异核体中运行以限制吻合(菌丝融合)和胞质接触；异核体亲和性；与营养不亲和性相反。
[0209]
营养不亲和性：在两个遗传不同的异核体之间在物理接近或接触期间观察到的拮抗现象，这是由多基因座自我/非自我识别系统决定的，其在担子菌异核体中运行以限制吻合(菌丝融合)和胞质接触；异核体不亲和性。
[0210]
病毒破坏(virus-breaking)：在蘑菇生产设施内的计划的菌株轮换项目中，连续
使用多种不亲和菌株(即表现出异核体不亲和性的菌株)，以减少病毒从原位的病毒贮主传递到新种植的作物中。
[0211]
产量：收获作物的净鲜重，通常以每平方米的千克表示。
[0212]
产量模式：每次出菇潮内和所有出菇潮之间的产量分布；影响作物和产品的尺寸、质量、采摘成本以及相对疾病压力。
[0213]
关于上述同核体的定义，需要注意的是，同核体和同等位基因品系受技术和实践考虑：经典术语中的同核体是单倍体培养物，其在公理上完全是同等位基因的。在实践中，为了真菌菌株开发的目的，通过将所有主要同等位基因品系视为同核体，将定义有所扩大以适应技术限制和细胞变异。技术限制包括这样的事实，即基因组包括复制的dna区域(包括重复元件(如转座子))，还可以包括由于历史易位事件而导致的染色体片段的大复制。美国联邦机构联合基因组研究所(joint genome institute，jgi)对两种不同的双孢菇基因组进行测序，估计的长度相差4.4％，基因数相差8.2％，这表明不同菌属的菌株中存在大量的dna复制或重排。目前可用的双孢菇基因组不能完全解释这些元件的物理排列和易位，因此单倍体品系的组装基因组序列可以具有使用当前可用的基因分型方法显示为异等位基因的区域。在细胞学上，同核后代将通常是接受一个单倍体的经减数分裂后细胞核的孢子。然而，接受来自担子果的三分之二的分裂细胞核的孢子(third-division nuclei)在遗传上等同于同核体。接受三分之二的分裂“姐妹”减数分裂后细胞核的孢子将是功能性的同核体，即使由于减数分裂期间的交叉，可以存在一些异等位性的远端“岛”。此外，具有同源物不对称分离的减数分裂可以产生非整倍的、功能性同核孢子，其中存在产生异等位性区域的额外染色体。所有这些培养物都是高度同等位基因的，并且都作为同核体发挥作用。技术限制使得区分这些培养物变得不切实际，并且排除dna区段复制也是不切实际的，解释是似乎是异等位基因的基因组序列组装的有限、分离的区域。因此，在本技术中，使用术语“同等位基因的”来表征这样的品系，其包括完全或主要是同等位基因的品系，以这种方式描述的培养物是功能性同核体、推定为同核的，以及在本技术中都被定义为同核体。
[0214]
双孢菇有一种称为同宗异宗配合的生殖综合征，其中两个不同的生命周期(即异源杂交和内源杂交)同时运作。与其他真菌一样，生殖繁殖体是孢子。伞菌属在称为担子果的减数分裂孢子囊上以减数分裂方式产生孢子。在第一个生命周期中，双孢菇的每个孢子都接受一个单倍体减数分裂后的核；这些孢子能够交配，但不能产生蘑菇。这些单倍体孢子萌发产生同核后代或品系，它们可以与其他性亲和的同核体交配以产生能够产生蘑菇的新型杂合异核体。与同核体相比，异核体通常表现出更少的交配能力。这种生命周期被称为异源杂交，或者更常见的是称为外杂交。可以在菌株开发计划中执行该生命周期以获得新的杂交种菌株，该生命周期在双孢菇变种双孢(agaricus bisporus var.bisporus)的菌株中运行，但通常不会占主导地位。
[0215]
第二个近亲繁殖生命周期称为内源杂交，在大多数双孢菇变种双孢菌株中占主导地位。大多数孢子(通常为90％-99.9％)接受两个减数分裂后的细胞核，并且大多数此类细胞核对(通常至少为90％)由非姐妹细胞核对(non-sister nuclear pairs，nsnp)组成，其在大多数或全部着丝粒连锁的基因座(包括mat(＝交配型)基因座)上具有异等位基因基因型。mat基因型决定这些后代的异核表型的表达，这些后代是具有生殖能力的菌株，可以生产蘑菇作物。在真核生物中不常见的是，在双孢菇减数分裂后的后代中观察到相对较低量
的染色体交叉(以u1菌株为亲本，每代每个单倍体后代有3.9次交叉，根据wei gao，2014)；根据经验，根据sonnenberg等人(2011)的说法，在异核菌株的异核后代中丢失的异等位性(类似于杂合性)非常少，通常平均不超过1％。因此，如上所述，亲本和异核后代的基因型和表型倾向于彼此相似。换句话说，双孢菇的异核后代通常在功能上等同于其亲本，并且通常无法与其亲本区分开来，尽管可以存在亲本基因组的轻微的遗传重排。
[0216]
f1杂交种的异核自交后代本身在假设基因座处具有“p/q”基因型，在实施例中将具有“p/p”、“q/q”或“p/q”的基因型。两种类型的自交，导致对n-s34交配获得的下一代异核世代的f1杂交种中存在的品系n-s34等位基因的代表具有不同期待。当来自同一f1杂交种的两个随机获得的单倍体后代(衍生自不同减数分裂的四分体的单个孢子)交配时(即，在四分体之间自交)，在每个重组的单倍体亲本品系和在每个同胞交配的异核体中，品系n-s34标志物谱的代表性平均为50％，在f1杂交种中存在的异等位性略高于75％(至约85％)，将平均保留在同胞交配的异核体中(注意，预期超过75％是由于，异等位性所需要的交配亲和性位于大染色体1上的交配型基因座(mat)，该染色体包含核基因组的约10％)。此外，独特的是，双孢菇定期经历第二特征性的自发的四分体内自交的形式(称为内源杂交)，这产生携带两个不同的重组单倍体细胞核(其几乎总是具有互补的异等位基因mat等位基因)的异核的减数分裂后的孢子。从这些孢子中的任何一个发育而来的后代是减数分裂后的自交交配的异核体，具有单个f1亲本中所有13对着丝粒周围存在的异等位性的约100％保留。理论上，对于与其着丝粒不连锁的远端标志物而言，该值将降低到f1异等位性的平均保留66.7％；然而，经验观察表明，即使对于此类远端标志物，结合有限量的交叉，保留率也更高。申请人通常在此类异核后代中观察到异等位性的95％-100％保留；sonnenberg等人(2011)报道了u1菌株的此类后代平均保留了99％。由于不常见的减数分裂交叉的影响，此类自交后代中的品系n-s34标志物谱的传递可以是小百分比不完整的(通常为0-5％)，但是来自n-s34的dna(和基因型标志物)仍代表所得的异核基因组的平均50％。这两种类型的自交后代都被认为是从初始f1杂交种衍生而来的菌株，而后一种类型包含f1杂交种初始基因型的大部分(通常[95-]99[-100]％)，可以表达与f1杂交种非常相似的表型，以及在功能上与其等同。
[0217]
当这种关系是通过后代同核体来自异核体的近亲繁殖后代之一时，两种培养物将具有一定程度的遗传同一性，平均约有85％的代表性和100％的起源共性(相对于亲本培养物)。当这种关系是通过单个异核孢子来自异核体的近亲繁殖后代之一时，两种培养物将具有一定程度的遗传同一性，平均约95％-99％-100％的代表性和100％的起源共性(相对于亲本的培养物)。当这种关系是通过将后代同核体与亲本同核体(如n-s34)交配来自f1异核体的回交后代之一时，回交异核体中亲本同核体基因型的代表性和起源共性将是平均约为75％。体细胞选择的培养物和组织选择的培养物将有效地与初始培养物具有100％的遗传同一性，可能具有表观遗传改变、重排或罕见突变(通常与未选择的克隆亚培养物以相同的速率出现，实际上不可能检测到)。诱变培养物与其初始培养物同样具有有效的100％的遗传同一性，除了一个或多个无法检测到的随机点突变。转化后的培养物通常将与其初始培养物具有至少99.99％至100％的遗传同一性，外加一小段可以或可以不整合到伞菌属基因组中的外源dna。
[0218]
实施例
bisporus fruit bodies.”fungal genet.biol.23,181
–
188(1998)。已经使用了等效的连锁标志物，如描述在loftus等人，“use of scar marker for cap color in agaricus bisporus breeding programs.”mush.sci.15,201
–
205(2000)。虽然可以并且已经使用几种不同的引物来扩增其中存在mfpc-1-elf标志物的dna区段，并且可以对其进行测序、消化、电泳表征或以其他方式进行分析，但是本发明人使用的用于开发公开数据的引物序列是：正向：5
’‑
aytcrcaamaacataccttcaac-3’(seq id no:5)；反向：5
’‑
cattcggcgattttctca-3’(seq id no:6)，35个pcr循环，55℃退火温度，0.5分钟延伸时间。
[0227]
根据使用robles等人(美国专利号7,608,760)公开的引物产生的pcr产物获得的序列和/或连续或重叠的基因组序列设计an、as和ff标志物，与robles等人最初描述的标志物相比，这提高了结果的表现性、可靠性和一致性；其在基因型上和基因组学上是等同的。虽然，可以并且已经使用几种不同的引物来扩增其中存在an、as或ff标志物的dna区段，并且可以对其进行测序、消化、电泳表征或以其他方式进行分析，但是本发明人使用的用于开发公开数据的引物序列是：
[0228]
an：正向：5'-gacgatgcgggactggtggat-3'(seq id no:7)；反向：5
’‑
ggtctggcctacrggagtgttgt-3’(seq id no:8)，35个pcr循环，64c退火温度，2分钟延伸时间。
[0229]
as：正向：5
’‑
ccgccagcacaaggaatcaaatg-3'(seq id no:9)；反向：5
’‑
tcagtcggccctcaaaacagtcg-3’(seq id no:10)，35个pcr循环，64c退火温度，2分钟延伸时间。
[0230]
ff：正向：5
’‑
tcgggtggttgcaactgaaaag-3’(seq id no:11)；反向：ttcctttccgccttaattgtttct(seq id no:12)，35个pcr循环，64℃退火温度，2分钟延伸时间。
[0231]
将现有技术中所有市售的棕色菌株(heirloom、tuscan、s-600、bs526、fr24和brawn)进行比较，表明本发明的菌株是不同的。wo2018102290中公开的棕色现有技术蘑菇菌株j15051(nrrl登录号67316)也包括在内。
[0232]
下表iv总结了本发明培养物和许多其他现有技术菌株在这6个基因座处的等位基因标志物。
[0233]
表iv：各种菌株的等位基因scar标志物
[0234]
[0235]
使用lasergene软件包(dnastar,inc.)的seqman ngen模块，参考h97 v2.0参考序列通过重叠群比对全基因组序列。通过检查两个或更多个培养物的比对序列，已经直接确定和比较各个基因座的snp。
[0236]
下表v和vi显示了在表i和ii中使用的203个snp标志物基因座的相关菌株的基因型，以及在每个菌株与la3782之间的整体遗传相似性计算。
[0237]
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246][0247]
使用这些标志物以确定两种异核培养物或菌株之间计算的遗传相似性(同一性)％，如表vi所示。
[0248]
含有表中报告的snp的9聚体已被视为两个单一等位基因的复合(在异核体比较中)。
[0249]
比较每个基因座的复合9聚体基因型，并指定值，如果完全匹配，则指定为1，或者对于任何不完全匹配，则指定为0。然后，可以对菌株之间的每个成对比较中的所有基因座的值进行总计，除以比较的基因座总数，所得小数转换为％。
[0250]
表vi：计算菌株la3782与其他七种异核菌株之间的相似性(同一性)％
[0251][0252]
对于snp标志物的完全组(n＝203)和snp标志物的较小组(n＝170)(排除在六个scar标志物基因座定义等位基因(以及具有较短的间隔分布)的snp)，结果是相似的。与其他七种菌株的异核基因型相比，观察到的la3782最高遗传相似性或同一性百分比为67％。两个la3782克隆的同一性为100％。
[0253]
b.营养不亲和性
[0254]
已知实质性的遗传差异(即，100％-％的遗传同一性)与异核体或“营养的”不亲和性有关。不亲和性干扰菌丝融合和蘑菇生产。根据表vi中的数据，预计la3782将与其他主要的商用棕色菌盖的双孢菇菌株不亲和。表vii从经验上证明了该点。
[0255]
表vii：在la3782、tuscan和heirloom之间的营养不亲和性：
[0256]
栽培16天后收获的蘑菇数量。
[0257][0258]
在三个重复(a-c)中的一般t检验分析；在所有情况下，亲和和不亲和组合之间的差异非常显著，p值a≤0,05。在每种处理中，将三种菌株之一接种到堆肥中，定植后，将接种
三种菌株之一的覆土施于堆肥上。在标准生长条件下，使用表面为0.07平方米的栽培容器。请注意，只有评分为亲和的组合(标记有*)才产生蘑菇。
[0259]
c.作物产量
[0260]
产量表现在大规模试验中测量。在这些试验中，在批量三期通道(iii)中孵育期是18天，菌种接种率是8升/吨二期堆肥。托盘填装135kg孵育堆肥，填装率为90kg/m2。可按1.33kg/m2的比率添加mc基质补充物。供应商euroveen的carbo 9覆盖可与1200g/m2堆肥覆盖预混施用。在生长室中，我们测试了菌株的分布在5个生长水平上的12个重复。在覆盖后的第4天开始通风。为了收集产量，可以每天对12个重复进行蘑菇采摘并称重。收集3次出菇潮的数据。
[0261]
发现在第三次出菇潮时，以及在第1、2和3次出菇潮上累积时，菌株la3782的蘑菇作物产量比br06/heirloom菌株的产量更高(更好)，如表viii所示。
[0262]
表viii：la3782与heirloom、tuscan和j15051菌株的产量比较
[0263][0264]
在1、2和3次出菇潮之后的la3782、heirloom、tuscan和j15051的出菇潮产量和累计作物产量，以kg/m2表示。使用标准的培养和收获程序。一般t检验分析：在p值≤0.05时，与la3782的差异显著。
[0265]
从表viii中可以看出，与所有已测试的现有技术菌株相比，菌株la3782显示出高产性，并且由于更高的第三次出菇潮产量，还具有提高的出菇潮产量平衡。
[0266]
d.重量保留
[0267]
与heirloom菌株相比，菌株la3782生产的蘑菇在收获后储存期间也具有提高的重量保留，如表ix所示。
[0268]
使用在蘑菇生产的“出菇潮”期间的收获峰当天收集蘑菇样本的方法，进行性状数据收集。一次出菇潮持续四天或五天，通常在第二天达到峰值生产率；通常，以周为间隔发生三次出菇潮。评价在第1次出菇潮中性状的表达。在此测试期间，评价每种菌株五个重复的发泡聚乙烯抽屉。抽屉是可以容纳超过1kg的托盘。记录空抽屉的重量。将三十个直径约4-5cm、具有紧闭的菌幕的蘑菇放入每个抽屉中。使其间距足够大，不会相互接触，将其茎向上放置，并对其立即称重。记录初始重量。将抽屉放在4℃的步入式冷库中放置8天。从第3天开始，每天记录填充的抽屉重量。减去空抽屉的重量后，如上所述计算重量保留的百分比。
[0269]
表ix：收获后在4℃储存3-8天后保留的初始重量的百分比
[0270][0271]
e.蘑菇片重量
[0272]
表x显示来自la3782的作物的单重(平均单个收获的蘑菇重量)显著大于heirloom或tuscan菌株的单重，尤其是在第一次出菇潮时。更大的单重可以降低收获作物的成本。
[0273]
使用在蘑菇生产的第一次和第一次出菇潮期间收集蘑菇样本的方法，进行性状数据收集。评价在第1次和第2次出菇潮中性状的表达。在此测试期间，对每种菌株的20个重复的中等尺寸蘑菇(直径4-5厘米)在四个不同水平上进行评价。每个重复都单独称重。
[0274]
表x：收获的单个蘑菇的重量(即，单重)
[0275][0276]
在第一次出菇潮和第二次出菇潮中的中等尺寸蘑菇类的平均单重以克表示。一般t检验分析：与la3782的差异显著，p值《α＝0,05。
[0277]
在第一次出菇潮和第二次出菇潮中的蘑菇的平均单重以克表示。一般t检验分析：在p为α≤0.05阈值时，与la3782的差异显著。
[0278]
f.菌盖颜色
[0279]
使用minolta chroma meter cr-200(mfd.japan)测量蘑菇颜色。从测试中收获30个商业上成熟(具有封闭的菌幕)的中等尺寸的蘑菇的样本尺寸，测量以获得l*a*b参数的值。比色计读数是在蘑菇菌盖的顶部随机获取的。在l*a*b系统中，“l”是一个亮度变量，0代表完全黑暗，100代表完全白，“b”值代表蓝色(-300)/黄色(+299)。换句话说，蘑菇菌盖颜色越深，l值越低，蘑菇菌盖颜色越黄，b值越高。
[0280]
表xi：la3782、heirloom和tuscan菌株的比色计值l、a、b
[0281][0282]
最后，应当理解，任何明显的变化都落入要求保护的发明的范围内，因此，在不背离本文公开的本发明的精神和描述的情况下，可以确定同核体和异核体的具体选择的特征、技术和来源。此外，应当理解，本发明的范围不一定限于生产具有本文所述所有特征的蘑菇菌株和培养物的方法，还有涉及由具有衍生自品系n-s34或菌株la3782的至少一个亲本的培养物产生的、传代的或由其他方法来源的那些菌株、品系或培养物。因此，本发明的范围应包括可以落入所附权利要求范围内的所有修改和变化。
[0283]
[0284]

技术特征：
1.一种双孢菇(agaricus bisporus)培养物，其至少包含双孢菇品系n-s34的染色体组，所述品系的代表性培养物已经于2020年6月30日，以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，其中所述染色体组包含表i中列出的序列特征性等位基因标志物。2.根据权利要求1所述的双孢菇培养物，其特征在于其选自：(a)品系n-s34，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，以及(b)通过将品系n-s34与第二品系交配产生的f1杂交种菌株。3.根据权利要求2所述的双孢菇培养物，其特征在于，所述第二品系是从菌株bp-1获得的同核体。4.根据权利要求1至3中任一项所述的双孢菇培养物，其特征在于其是菌株la3782，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。5.一种双孢菇蘑菇培养物，其包含菌株la3782的染色体组的至少一个单倍体，所述菌株的代表性培养物已经于2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，所述染色体组包含表ii中列出的序列特征性等位基因标志物，前提是其不是根据管理生物保藏的布达佩斯条约，以atcc登录号pta-6903保藏在美国马里兰州rockville的美国典型培养物保藏中心(atcc)的菌株bp-1。6.根据权利要求5所述的双孢菇菌株培养物，其特征在于其选自：(a)菌株la3782的同核体，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，以及(b)通过将所述同核体(a)与第二品系交配产生的f2杂交种。7.一种f2、f3、f4或f5代的双孢菇蘑菇菌株培养物，其传代自权利要求2至4中的f1杂交种，优选传代自f1杂交种la3782，或是传代自菌株la3782衍生的菌株，并且其分别包含双孢菇菌株la3782的基因组中存在的单核苷酸多态性(snp)的至少40-60％、至少20-30％、至少10-15％或至少4-8％，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。8.根据权利要求7所述的双孢菇菌株培养物，其传代自f1杂交种la3782，或者传代自菌株la3782衍生的菌株，并且其包含表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约100个等位基因标志物、表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约50个等位基因标志物或表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约25个。9.根据权利要求7所述的双孢菇菌株培养物，其传代自f1杂交种la3782，或者传代自菌株la3782衍生的菌株，并且其包含表ii或表iii中列出的la3782的序列特征性等位基因标志物中的至少40-60％、至少20-30％、至少10-15％或至少4-8％。
10.一种衍生自初始培养物的双孢菇蘑菇培养物，其中所述初始培养物选自：a)菌株la3782，所述菌株的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，b)双孢菇品系n-s34，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，以及c)权利要求1至7中限定的任何培养物。11.根据权利要求10所述的双孢菇蘑菇培养物，其特征在于其包含表i中列出的n-s34或表ii中列出的la3287的序列特征性等位基因标志物中的至少65％。12.根据权利要求2、4、6、7或8-9所述的蘑菇菌株培养物，其特征在于：(a)所述培养物的作物的总产量表现等于或超过双孢菇的br06/heirloom菌株的作物的产量表现，以及(b)所述培养物的作物的第三次出菇潮产量显著超过br06/heirloom菌株的第三次出菇潮产量，以及(c)与br06/heirloom菌株的蘑菇产品相比，所述培养物的作物的蘑菇产品在收获后在4摄氏度下储存数天后保留更多的重量，天数选自3、4、5、6、7和8天。13.从权利要求1至12中任一项所述的培养物中获得的细胞、菌丝、菌丝体、蘑菇、萌发的孢子、未萌发的孢子、同核体和异核体，包括snp、nsnp和非整倍体。14.一种掺入了权利要求1至12中任一项的培养物的产品，包括菌种体、接种物、蘑菇、蘑菇部分、蘑菇片、加工食品。15.一种用于开发新的双孢菇培养物的方法，所述方法包括将至少一种蘑菇菌株开发技术应用至同核体品系n-s34，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5528保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，或者应用至菌株la3782的同核体，其代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号，或应用至其后代，以提供新培养物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述新培养物的特征在于：(a)所述培养物的作物的产量表现等于或超过双孢菇的br06/heirloom菌株的作物的产量表现，以及(b)所述培养物的作物的第三次出菇潮产量超过br06/heirloom菌株的第三次出菇潮产量，以及(c)与br06/heirloom菌株的蘑菇产品相比，所述培养物的作物的蘑菇产品在收获后在4摄氏度下储存数天后保留更多的重量，天数选自3、4、5、6、7和8天。17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于所述培养物是传代自f1杂交种la3782、或传代自菌株la3782衍生的菌株的f2、f3、f4或f5代，并且其分别包含双孢菇菌株la3782的基因组中存在的单核苷酸多态性(snp)的至少40-60％、至少20-30％、至少10-15％或至少4-8％，所述品系的代表性培养物已经在2020年6月30日以cncm登录号i-5527保
藏在法国国家微生物保藏中心(cncm)，巴斯德研究所，巴黎邮政编码75724，邮箱15，docteur roux路25号。18.根据权利要求15至16所述的方法，其特征在于，所述培养物包含表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约100个等位基因标志物、表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约50个等位基因标志物、或表ii中列出的la3782的203个序列特征性等位基因标志物中的至少约25个。19.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于所述培养物包含表ii或表iii中列出的la3782的序列特征性等位基因标志物中的至少40-60％、至少20-30％、至少10-15％或至少4-8％。

技术总结
本发明涉及命名为N-s34的同核的双孢菇(Agaricus bisporus)(Lange)Imbach蘑菇真菌品系培养物的开发，以及从品系N-s34获得的、传代的或以其他方式衍生的培养物。更特别地，本发明涉及掺入至少一组染色体的培养物，该染色体具有在品系N-s34中发现的染色体的基因型中存在的基因型。本发明还涉及F1杂交种，以及特别的传代自N-s34的F1杂交种菌株(命名为LA3782)。该特定的菌株确实显示出收获作物，尤其是在第三次出菇潮中的极佳产量重量，以及蘑菇产品的非常好的保质期。本发明还涉及从品系N-s34或从所述杂交种菌株LA3782衍生的、或传代的、或以其他方式开发的或获得的后代、品系和菌株。本发明还涉及使用上述培养物的方法。本发明还涉及使用上述培养物的方法。


技术研发人员：A
受保护的技术使用者：索米赛尔公司
技术研发日：2021.07.26
技术公布日：2023/7/22