一种龙珠果的遗传转化方法

1.本发明涉及植物转基因技术领域，尤其涉及一种龙珠果的遗传转化方法。


背景技术：

2.龙珠果(passiflora foetida l.)，为西番莲科西番莲属草质藤本植物。龙珠果植株高数米，整株尤其是损伤的叶片常散发出辛辣的味道；茎具条纹且有平展柔毛；叶膜质，表面有柔毛，宽卵形或长圆状卵形，基部心形且有3～5个浅裂，边缘不规则，叶脉羽状；叶柄具平展柔毛；托叶半抱茎，深裂；聚伞花序，花白色或淡紫色，具白斑；苞片3枚；萼片5枚；花瓣5枚；浆果卵圆球形，无毛；种子多数，椭圆形，草黄色；花期7～8月，果期翌年4～5月。龙珠果花朵秀丽，颜色多变，具有一定的观赏价值；果实外形美观，香甜可食，具有一定的经济价值；全株可入药，具有一定的药用价值。主要含有黄酮类化合物，其主要成分有牡荆素、异牡荆素、荭草素、异荭草素等，具有清热解毒、清肺止咳之功效，临床多用于治疗肺热咳嗽、小便混浊、痈疮肿毒、外伤性眼角膜炎、淋巴结炎等症。
3.现有龙珠果的遗传转化技术多依赖于传统的遗传转化体系，先通过植物组织培养技术获得愈伤组织，然后通过农杆菌对愈伤组织侵染，再进行诱导筛选出阳性植株后实现转化过程。但是，该技术在一定程度上依赖无菌环境和转化周期长等问题。


技术实现要素：

4.本发明为解决上述问题，提供一种龙珠果的遗传转化方法。
5.本发明目的在于提供一种龙珠果的遗传转化方法，将处于子叶期的龙珠果幼苗去除子叶和生长点，通过农杆菌侵染伤口，再通过抗生素筛选，筛选后在自然光下培养。
6.优选的，具体包括如下步骤：s1、实生苗的培养：将种子从果实中取出、剥离干净，在25-30℃下用赤霉素和磷酸二氢钾浸泡20-30h，清洗；播种前，用杀菌剂浸泡20-40min，清洗5-10次，播种到蛭石和营养土混合基质的穴盘中培养至子叶陆续破土，得到处于子叶期的龙珠果幼苗；s2、非离体植株处理：去除所述步骤s1的幼苗的子叶和生长点；s3、遗传转化方法：以所述步骤s2处理好的幼苗为侵染材料，将所述侵染材料的伤口用浸泡过农杆菌侵染液的试纸浸染40-50 min，期间保持充足的侵染液在所述伤口处；用封口膜包裹伤口，保湿，在黑暗下共培养3-5天；用所述的农杆菌侵染液进行第二次侵染，操作步骤同第一次侵染相同；s4、抗生素筛选：第二次侵染后，用含有50-200mg/l卡那霉素的抗生素对所述伤口进行2-3次筛选，并用封口膜再次包裹所述伤口，在黑暗中培养7天；s5、温室培养：将筛选后的幼苗转移至温室中，在自然光下培养。
7.优选的，卡那霉素的浓度为100mg/l。
8.优选的，步骤s3中的农杆菌侵染液的制备方法为：挑取农杆菌的单菌落放于yeb液体培养基中，摇床培养、活化；活化后的菌液再次加入yeb液体培养基中，摇床培养、二次活
化；活化后的菌液离心、弃上清，加入ms液体培养基，重悬至od值=1.0-1.2，在室温下静置2.5-3.5h，得到农杆菌侵染液。
9.优选的，ms液体培养基按体积计每升中包括100μm的乙酰丁香酮as、0.1-0.5ml silwet-77、4~6ml蔗糖。
10.优选的，摇床培养的条件为：温度25-30℃、转速200-250rpm、时间6-10h；所述的离心，其转速为3500-4500rpm、时间为8-15min。
11.优选的，步骤s1中的赤霉素浓度为90-110mg/l、磷酸二氢钾浓度为1-2g/l；所述用赤霉素和磷酸二氢钾浸泡的时间为24h，温度28℃。
12.优选的，步骤s1中的杀菌剂为45%的甲霜恶霉灵600倍液或50%的多菌灵600倍液。
13.优选的，步骤s1中的基质提前用水浸透，当所述基质的表面微干时用水喷洒；所述蛭石和营养土的重量比为1:3；所述清洗为用水清洗。
14.优选的，步骤s3所述的共培养时间为3天。
15.与现有技术相比，本发明能够取得如下有益效果：本发明则克服了对无菌环境的依赖，同时能够实现转化周期缩短、出苗快和操作简单等优点，建立了龙珠果的非离体遗传转化体系。
附图说明
16.图1是根据本发明实施例提供的龙珠果再生芽示意图。
17.图2是根据本发明实施例提供的转化阳性苗的鉴定结果。
具体实施方式
18.在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。
19.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
20.实施例1一种龙珠果的遗传转化方法，包括如下步骤：s1、实生苗的培养：将种子从果实当中取出、剥离干净，在25-30℃的温度下将种子用100 mg/l赤霉素和1.25 g/l磷酸二氢钾浸泡24 h，用清水清洗；播种前，用45%甲霜恶霉灵600倍液或50%多菌灵600倍液浸泡30min，然后用清水清洗5-10次；随后播种到蛭石和营养土混合基质（配土按照一份蛭石和三份营养土的重量份比例进行配制）的穴盘中；播种前要将所述的基质提前用水浸透，然后基质表面微干时用水喷洒；2周后子叶陆续破土，得到处于子叶期的龙珠果幼苗；所述幼苗用于植物遗传转化；s2、非离体植株处理：在进行转化前，将步骤s1所述的幼苗用手术刀在子叶下部去除子叶和生长点；s3、遗传转化方法：以步骤s2中处理好的幼苗为侵染材料，将侵染材料的伤口用浸泡过农杆菌侵染液试纸浸染40-50min，期间保持充足的侵染液在伤口处；然后用封口膜包
裹伤口，用闷养盖保湿，黑暗下共培养3天；然后再用农杆菌侵染液侵染，步骤同第一次侵染步骤相同；再次侵染是为了提高侵染效率进行的；s4、抗生素筛选：侵染后，用含有100mg/l卡那霉素kn的抗生素对伤口进行2-3次筛选，并用封口膜再次包裹伤口，并在黑暗中培养7天；s5、温室培养：最后将侵染的幼苗转移至温室中进行自然光下培养。
21.本实施例中所述的卡那霉素kn，筛选标记基因nptⅱ，其编辑的蛋白是新霉素磷酸转移酶ⅱ。
22.本实施例中所述的农杆菌侵染液每升中包括农杆菌、ms液体培养基、100μm as、0.01%-0.05% silwet-77、5%蔗糖（体积百分比）。
23.所述农杆菌侵染液制备方法，包括：挑农杆菌单菌落放于yeb液体培养基（发根农杆菌液体培养基）中，在28℃、220rpm的摇床中，培养8h进行农杆菌活化；然后放入100ml的yeb液体培养基中，在28℃、220rpm的摇床中，进行农杆菌二次活化；将活化后的菌液置于灭菌过的离心管中在4000rpm下离心10 min，倒掉上清液，使用含有5%蔗糖+100 μm as + 0.01%-0.05% silwet-77的ms液体培养基重悬至od值=1.0-1.2，然后室温下静置3h，得到农杆菌侵染液。
24.图2示出了转化阳性苗的鉴定结果；其中，m代表marker，1-11为转化植株的阳性苗，+代表阳性对照（农杆菌的菌液），-代表阴性对照。结果表明样品1-11全部转化成功。
25.传统的组培过程获得不定芽需要的时间在30天左右，而通过本方式可以在30天内就能够直接获得完整的阳性植株，不需要额外的诱导生根和炼苗，再生出的阳性芽长势健壮，成活率高，生长速度快。采用本实施例方法，实现整体再生率超过90%，阳性率为17.78%。
26.实施例2本实施例研究抗生素浓度对植株转化的影响，具体操作过程如下：分别配制含有50、100、150mg/l卡那霉素kn的抗生素，标记1-5组；分别按实施例1的方法进行龙珠果的遗传转化（仅卡那霉素的浓度不同），比较各组对植株转化的影响；结果如表1所示。
27.表1从表中可以看出，采用含100mg/l卡那霉素的抗生素植株再生率和阳性率最高，卡那霉素的浓度太高或太低时植株的转化效果都不好。
28.综上，本发明采用龙珠果的非离体转化，有效提高了转化效率，缩短转化周期，摆脱了转化过程对于无菌环境的依赖，降低转化成本。
29.应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发明公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本发明公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。
30.上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，根据设计要求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

技术特征：
1.一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于：将处于子叶期的龙珠果幼苗去除子叶和生长点，通过农杆菌侵染伤口，再通过抗生素筛选，筛选后在自然光下培养；具体包括如下步骤：s1、实生苗的培养：将种子从果实中取出、剥离干净，在25-30℃下用赤霉素和磷酸二氢钾浸泡20-30h，清洗；播种前，用杀菌剂浸泡20-40min，清洗5-10次，播种到蛭石和营养土混合基质的穴盘中培养至子叶陆续破土，得到处于子叶期的龙珠果幼苗；s2、非离体植株处理：去除所述步骤s1的幼苗的子叶和生长点；s3、遗传转化方法：以所述步骤s2处理好的幼苗为侵染材料，将所述侵染材料的伤口用浸泡过农杆菌侵染液的试纸浸染40-50 min，期间保持充足的侵染液在所述伤口处；用封口膜包裹伤口，保湿，在黑暗下共培养3-5天；用所述的农杆菌侵染液进行第二次侵染，操作步骤同第一次侵染相同；s4、抗生素筛选：第二次侵染后，用含有50-200mg/l卡那霉素的抗生素对所述伤口进行2-3次筛选，并用封口膜再次包裹所述伤口，在黑暗中培养7天；s5、温室培养：将筛选后的幼苗转移至温室中，在自然光下培养。2.根据权利要求1所述的一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于：所述卡那霉素的浓度为100mg/l。3.根据权利要求2所述的一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤s3中的农杆菌侵染液的制备方法为：挑取农杆菌的单菌落放于yeb液体培养基中，摇床培养、活化；活化后的菌液再次加入yeb液体培养基中，摇床培养、二次活化；活化后的菌液离心、弃上清，加入ms液体培养基，重悬至od值=1.0-1.2，在室温下静置2.5-3.5h，得到农杆菌侵染液。4. 根据权利要求3所述的一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于：所述ms液体培养基按体积计每升中包括100μm的乙酰丁香酮as、0.1-0.5ml silwet-77、4~6ml蔗糖。5.根据权利要求4所述的一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于：所述摇床培养的条件为：温度25-30℃、转速200-250rpm、时间6-10h；所述的离心，其转速为3500-4500rpm、时间为8-15min。6.根据权利要求5所述的一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s1中的赤霉素浓度为90-110mg/l、磷酸二氢钾浓度为1-2g/l；所述用赤霉素和磷酸二氢钾浸泡的时间为24h，温度28℃。7.根据权利要求6所述的一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s1中的杀菌剂为45%的甲霜恶霉灵600倍液或50%的多菌灵600倍液。8.根据权利要求7所述的一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s1中的基质提前用水浸透，当所述基质的表面微干时用水喷洒；所述蛭石和营养土的重量比为1:3；所述清洗为用水清洗。9.根据权利要求8所述的一种龙珠果的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s3所述的共培养时间为3天。

技术总结
本发明涉及植物转基因技术领域，尤其涉及一种龙珠果的遗传转化方法。方法包括：将处于子叶期的龙珠果幼苗去除子叶和生长点，将伤口用浸泡过农杆菌侵染液的试纸浸染40-50min，期间保持充足的侵染液在所述伤口处；用封口膜包裹伤口，保湿，在黑暗下共培养3-5天；第二次侵染，操作步骤同第一次侵染相同；用含有50-200mg/L卡那霉素的抗生素对所述伤口进行2-3次筛选，并用封口膜再次包裹所述伤口，在黑暗中培养7天；将筛选后的幼苗转移至温室中，在自然光下培养。本发明采用龙珠果的非离体转化，有效提高了转化效率，缩短转化周期，摆脱了转化过程对于无菌环境的依赖，降低转化成本。降低转化成本。降低转化成本。


技术研发人员：房传营 王瑞 吴紫薇 罗杰
受保护的技术使用者：海南大学三亚研究院
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/7/22