一种C型产气荚膜梭菌产毒培养基及其制备方法与应用与流程

一种c型产气荚膜梭菌产毒培养基及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物制品技术领域，具体地说，涉及一种c型产气荚膜梭菌产毒培养基及其制备方法与应用。


背景技术：

2.羊梭菌性疾病（clostridial diseases of sheep）是由梭状芽胞杆菌属（clostridium）微生物所致的一类疾病。包括羊快疫（braxy, bradsot，由腐败梭菌cl.septicum引起）、羊肠毒血症（enterotoxaemia，由魏氏梭菌cl.perfringens，也称产气荚膜杆菌d型引起）、羊猝狙（struck，由c型魏氏梭菌cl.perfringens引起）、羔羊痢疾(lamb dysentery，由b型魏氏梭菌cl.perfringens引起)、羊黑疫（black disease，由诺维氏梭菌clostridium novyi引起）、肉毒梭菌中毒症（botulism，由c型、d型肉毒梭菌clostridium botulinum引起）、羊猝死症（由a型产气荚膜梭菌引起）。
3.梭菌是一类厌氧性细菌，有60余种，常见的致病性菌仅10余种，多存在于土壤、污水以及人和各种动物的粪便中。革兰氏染色均为阳性，除少数菌种外，都有鞭毛，能运动和形成芽孢。多数菌种能产生剧烈的外毒素，它既是致病的主要因子，又是主要抗原，转变成类毒素后能刺激动物产生抗毒素，可用于预防相应的梭菌病。梭菌病发病迅速、病程短、死亡率高。家畜中多见于牛、羊、猪及禽类等。
4.c型产气荚膜梭菌（clostridium perfringens type c）是引起动物出血性、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌。特别对新生幼畜和幼禽(尤其是新生仔猪)，易引起高致病性和高死亡率。其主要的毒力因子为α、β1和β2毒素，常引起羊猝狙。幼龄羊和成年羊均可发生，但以成年羊居多，常突然发病，在数小时内死亡，表现急性中毒的毒血症症状，给养殖业带来重大损失。
5.在牧草返青、大量补饲精饲料、突然更换日粮、外伤、管理调整、寄生虫或者其它不正常的情况出现时会创造出适宜梭菌生长的环境，梭菌会大量繁殖并分泌强外毒素。通常梭菌感染预后很差，往往发现时动物就已经死亡。由于治疗成功率很低，所以该病的重点在于预防，大范围的免疫接种能够有效的降低该疾病造成的损失。
6.目前业内使用的疫苗普遍以牛肉、鱼肉、牛肝等动物性原材料来制备厌气肉肝胃酶消化汤、鱼肝肉胃酶消化汤培养基，但使用这种方法制备培养基，多因原材料质量参差不齐、批间差异大，常常出现产毒性能不稳定的现象，尤其是随着乳品业的发展，奶牛饲养量急速增加，随之而来大量的淘汰奶牛肉充斥市场更造成制备疫苗培养基的原材料质量下降；同时，牛肉、牛肝中残留的药物也常常会抑制细菌生长，以上种种情况严重影响了疫苗的质量，并且近年来牛、羊梭菌病流行加剧也反应了疫苗整体质量的下降。另外，传统培养基制备过程繁琐、耗时长、需要人力多，价格高昂、回收率低，也给疫苗生产带来了极大的浪费和高额的成本，给疫苗生产企业造成极大困扰。业界急需一种取材方便，质优价廉，性能稳定的培养基与培养方法与之相适应。


技术实现要素：

7.本发明的目的之一是提供一种性能稳定、成本低的c型产气荚膜梭菌产毒培养基及其制备方法与应用。
8.为了实现该目的，本发明的技术方案如下：一种c型产气荚膜梭菌产毒培养基，其由水、单糖、蛋白胨、酵母浸粉、nacl、na2hpo4·
12h2o、kh2po4和多糖组成；所述单糖为葡萄糖，所述多糖为糊精或粗糊精。
9.本发明研究发现，在培养c型产气荚膜梭菌时，以特定单糖和多糖配合其他蛋白、缓冲体系及微量元素组分，生产的c型产气荚膜梭菌毒素毒力高，且各批次培养效果稳定、成本低，以其制备的疫苗质量高且稳定。
10.b型与c型产气荚膜梭菌是两个生长发育、产生外毒素类别及免疫原性方面特别相近的菌株，本发明人团队在获得了b型产气荚膜梭菌的新培养方法后，进一步研究了加入葡萄糖会不会对产毒效果有所提升，最终发现在b型产气荚膜梭菌的培养基中加入葡萄糖后会使产毒水平显著下降。但意外地，在进行常规认为最适培养基条件与b型产气荚膜梭菌一致的c型产气荚膜梭菌的培养时，在培养基中加入葡萄糖却能显著提升产毒效果，这打破了常规对两种菌培养的认知（现行国标中两种菌的培养基就是一样的），获得了预料不到的好效果。
11.此外，本发明培养基中还特别加入了kh2po4，它与na2hpo4·
12h2o形成了强大的磷酸盐缓冲体系，能使培养液中的基础菌数达到较大值后才会引起ph下降（c型产气荚膜梭菌发育快，在发育过程中会产气、产酸），从而保证了高产毒水平的实现。
12.本发明的c型产气荚膜梭菌产毒培养基，所述c型产气荚膜梭菌产毒培养基由组分a和组分b组成，每1000ml所述组分a由以下重量配比的原料制成：蛋白胨 15-25g；酵母浸粉 2-4g；nacl 2-4g；na2hpo4·
12h2o 5-10g；kh2po
4 5-10g；糊精或粗糊精 5-10g；余量为水；所述组分b为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖在所述c型产气荚膜梭菌产毒培养基中的终浓度为0.9-1.1%（优选为0.98%）。
13.优选，每1000ml所述组分a由以下重量配比的原料制成：蛋白胨 20g；酵母浸粉 3g；nacl 3g；na2hpo4·
12h2o 10g；kh2po
4 10g；糊精 10g；余量为水；所述组分b为浓度为50%的葡萄糖的水溶液。
14.本发明中糊精指生物试剂糊精，粗糊精指药用糊精。本发明经研究发现，当在培养基中采用糊精（生物试剂）作为多糖时，产毒培养效果更佳。
15.本发明配方中所用水为注射用水。
16.本发明的c型产气荚膜梭菌产毒培养基的ph值为7.8-8.2。
17.本发明还提供一种制备上述c型产气荚膜梭菌产毒培养基的方法，其包括：将蛋白胨、酵母浸粉、nacl、na2hpo4·
12h2o、kh2po4与配方量总体积80%的水混合，调节ph值后，与多糖混合后加余量水定容，灭菌，得到培养基组分a；将单糖配制为水溶液，灭菌，得到培养基组分b。
18.本发明的方法中，采用氢氧化钠调节ph值；和/或，所述培养基组分a的灭菌条件为：116℃高压蒸汽灭菌30分钟；所述培养基组分b的灭菌条件为：110℃高压蒸汽灭菌30分钟。
19.本发明中，调节ph值可以采用2mol/l的氢氧化钠溶液进行，根据本发明的公开，本
领域技术人员还可以采用其他合适的试剂来调节上述培养基的ph值，这些都在本发明的保护范围之内。
20.作为一个具体实施方式，本发明提供一种上述c型产气荚膜梭菌产毒培养基的制备方法，所述方法包括以下步骤：将制备所述培养基的原料蛋白胨、酵母浸粉、nacl、na2hpo4·
12h2o、kh2po4按重量配比加入总体积80%的注射用水中溶解，并调节ph值为7.8-8.2后加入重量配比的糊精或粗糊精定容，高压灭菌，再将无水葡萄糖单独配制成50％（v/v）水溶液灭菌，使用前加入至所需浓度，得到所述培养基。
21.通过以上方法制备c型产气荚膜梭菌产毒培养基具有以下有益效果：该培养基配制加样顺序有效地保证了营养物质在可见状态下进行溶解完全；将原料中除糊精或粗糊精及无水葡萄糖外的物质进行溶解后调节ph值，调节ph值之后定容不会改变最终获得的培养基的ph值，此时获得的溶液有强大的缓冲能力，这样不仅可以确保最终配比体积的准确，便于ph值的精确调节并利于在培养基使用过程中的ph相对稳定；同时由于糊精或粗糊精属于淀粉类试剂，对ph计有粘附作用，因此选择在加入糊精或粗糊精之前进行调节ph，有利于ph计的保护及精准调节ph值。同时，葡萄糖对高温敏感，灭菌温度太高会引起碳化，采用单独配制及灭菌保证了葡萄糖的使用效能。
22.本发明另提供一种制备c型产气荚膜梭菌外毒素的方法，其以上述c型产气荚膜梭菌产毒培养基或上述方法制备得到的c型产气荚膜梭菌产毒培养基进行c型产气荚膜梭菌的发酵。
23.本发明的方法中，所述发酵的接种量为1-1.5%（v/v），条件为：在36-37℃下静置培养12-14h。
24.本发明人在发酵培养过程中意外发现，如果采用现有技术教导的发酵培养时间为10-16h，最终获得的10h发酵培养时间和16小时发酵培养时间条件下的c型产气荚膜梭菌毒素毒力测定不理想，10h发酵培养后不能满足《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版规定羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗中c型产气荚膜梭菌毒素0.001-0.0025ml规定的毒力标准，16h发酵培养虽能达到0.0025ml毒力标准下限，但加上灭活及纯化、浓缩损失，免疫效果会有损失。因此，本发明人通过试验筛选出发酵培养时间为12-14h，获得的c型产气荚膜梭菌毒素毒力均达到甚至超过规定的标准。
25.所述发酵时，采用c型产气荚膜梭菌的一级种子液、二级种子液或三级种子液作为发酵菌；所述一级种子液制备时采用无糖厌气肉肝汤作为培养基，所述二级种子液制备时采用厌气肉肝汤作为培养基，所述三级种子液制备时采用上述c型产气荚膜梭菌产毒培养基或上述方法制备得到的c型产气荚膜梭菌产毒培养基作为培养基；和/或，所述方法还包括在发酵完成后，对获得的发酵液进行离心，取离心上清液进行过滤的步骤；优选，所述离心的条件为3000-4000rpm，20-30min，所述过滤采用0.22μm滤膜进行。
26.作为一个具体实施方式，本发明提供一种c型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法，所述方法包括以下步骤：种子液培养：将c型产气荚膜梭菌接种于无糖厌气肉肝汤中，在36-37℃下静置培养10-16h，制得c型产气荚膜梭菌的种子液；发酵培养：将所述种子液接种于上述的c型产气荚膜梭菌产毒培养基中进行培养，
收集培养物并离心，然后收集上清液并过滤，所得滤液即为所述c型产气荚膜梭菌外毒素。
27.上述c型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法中，c型产气荚膜梭菌的种子液可以为一级种子液，也可以为二级种子液；其中一级种子液的制备方法为：将c型产气荚膜梭菌接种于无糖厌气肉肝汤中，置36-37℃静止培养10-16h，随后进行纯检，纯粹者为一级种子液；二级种子液的制备方法为：将上述一级种子液按接种量1-1.5%（v/v）接种于350ml/500ml瓶厌气肉肝汤中，置36-37℃静置培养10-16h，随后经纯粹检验合格者为二级种子液；也可以继续对上述二级种子液接种到所述c型产气荚膜梭菌产毒培养基组分a中，同时无菌加入培养基组分a体积2%的50%浓度的无菌葡萄糖溶液（组分b）后置37℃静置培养12-16h，随后经纯粹检验合格者为三级种子液。继续扩大培养得到的种子液也可以作为发酵培养产生c型产气荚膜梭菌外毒素的种子液，也在本发明的保护范围之内。
28.上述c型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法中，c型产气荚膜梭菌接种的接种量和所述种子液接种的接种量均为1-1.5%（v/v）。
29.上述c型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法中，发酵培养可以在500ml瓶或发酵罐中进行。
30.本发明再提供一种上述方法在制备含有c型产气荚膜梭菌外毒素的疫苗中的应用。
31.本发明的又一目的是提供一种c型产气荚膜梭菌外毒素，其利用上述c型产气荚膜梭菌产毒培养基，根据上述c型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法制备而成。可用于羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗，羊梭菌病多联干粉疫苗及仔猪红痢灭活疫苗效力检验中血清中和效价测定及动物攻毒保护试验。
32.上述c型产气荚膜梭菌外毒素在制备用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用也属于本发明保护内容。所述c型产气荚膜梭菌外毒素经灭活脱毒制成的类毒素在制备用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用也属于本发明保护内容。所述相关疾病选自羊快疫、猝狙、肠毒血症，仔猪红痢，禽坏死性肠炎中的任一种或其组合，所述疫苗选自羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗、仔猪红痢灭活疫苗的至少一种。
33.本发明的又一目的是提供一种由上述c型产气荚膜梭菌培养方法获得的培养物经灭活脱毒后制备得到的c型产气荚膜梭菌灭活疫苗。
34.上述疫苗是由c型产气荚膜梭菌培养菌液经灭活脱毒后与氢氧化铝胶按体积比为5:1均匀混合而成。
35.上述疫苗是由经灭活脱毒的培养物（按1:1:1的比例含d型产气荚膜梭菌灭活脱毒菌液、c型产气荚膜梭菌灭活脱毒菌液及腐败梭菌灭活脱毒菌液）与无菌氢氧化铝胶按体积比为5:1均匀混合而成。上述d型产气荚膜梭菌的菌液灭活脱毒前外毒素毒力为1 mld≤0.00025ml，c型产气荚膜梭菌的菌液灭活脱毒前外毒素毒力为1 mld≤0.0008ml，腐败梭菌的菌液灭活脱毒前外毒素毒力为1 mld≤0.005ml。
36.采用以上方案，本发明制备得到的c型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒性能稳定且由于不含有传统培养基原料所携带的药物残留等，对培养产毒细菌无抑制作用，同时其制备方法简单、取材方便、质优价廉，通过其获得的c型产气荚膜梭菌外毒素相对于传统培养
基制备得到的毒素毒力效果更加稳定，利用其制备得到的疫苗质量更高。具体有以下优点：（1）本发明以商品化蛋白胨、酵母浸粉等成品作为原材料替代原有质量不可控的牛肉、牛肝等原材料，通过筛选培养基配方及各组分最佳含量，并优化产毒培养条件，使培养基的产毒能力达到甚至超过原有规程标准，并几乎无批间差，可用以制备兽用c型产气荚膜梭菌类毒素。
37.（2）本发明通过筛选获得的培养基无论用500ml瓶或发酵罐培养，均具有较强的产毒能力，并且产毒性能稳定，质量可控，另外配制使用方便，价格低廉。
38.（3）本发明在家兔及绵羊上对本发明制备的c型产气荚膜梭菌灭活疫苗的效果进行了评价。结果用本发明制备的羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，血清中和效价达到甚至超过了规程的相应标准。
39.（4）本发明所使用的产毒培养基及其配制方法，取材方便、配制简单、省去了厌气肉肝胃酶消化汤、鱼肝肉胃酶消化汤的消化过程，大大缩短了制备时间，成本降低为传统厌气肉肝胃酶消化汤的1/5。按本发明方法制备得到的c型产气荚膜梭菌外毒素毒力最高可提至《中国兽用生物制品规程》制苗标准的4.165倍。并且，用其制备的灭活疫苗在家兔及绵羊的相应血清中和效价也提高至规程标准的3-4倍。同时本发明的产毒培养基由于不含有动物性原材料残渣和药物残留，降低了研制、生产低免疫剂量类毒素灭活疫苗在纯化浓缩时的压力。本发明可用于替代现有厌气肉肝胃酶消化汤、鱼肝肉胃酶消化汤培养基，用于羊梭菌多联灭活疫苗的生产，具有广阔的前景。
40.（5）依本发明方法制备的c型产气荚膜梭菌外毒素或灭活后转化成类毒素后，离心液通过3-5kd的超滤浓缩系统进行浓缩，可达到90%以上的回收率，用于制备低免疫剂量的疫苗。
具体实施方式
41.本发明针对现有技术中适用于c型产气荚膜梭菌的厌气肉肝胃酶消化汤等培养基原料取材不便、制备过程繁琐、耗时耗力，成本较高，并且产毒能力低、产毒效果不稳定等缺点，通过试验摸索，提供了一种更加适用于c型产气荚膜梭菌培养的产毒培养基，其取材方便、制备方法简单快捷、成本也较低，并且发酵培养获得的c型产气荚膜梭菌外毒素毒力高、产毒效果稳定，可以大范围推广使用。
42.同时，基于本发明提供的c型产气荚膜梭菌产毒培养基，本发明提供了一种毒力水平较高的c型产气荚膜梭菌外毒素，并基于该外毒素经灭活脱毒后获得一种c型产气荚膜梭菌灭活疫苗，其血清中和效价达到甚至超过了规程的相应标准。
43.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
44.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
45.本发明中所采用的c型产气荚膜梭菌菌株为兽用c型产气荚膜梭菌c59-2菌株，菌种编号cvcc60102，2006.09.29，购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心。
46.实施例中采用的糊精为生物试剂，具体为购自北京奥博星生物技术有限公司的生
物试剂糊精，货号01-034，为白色或类白色无定形粉末，无臭味微甜。技术标准：水不溶物合格，乙醇溶解度≤1.0%，干燥失重≤10%，炽灼残渣≤0.5%，氯化物（cl）≤0.002%，磷酸盐（so4）≤0.002%，草酸盐（c2o4）≤0.05%，铁盐（fe）≤0.005%，重金属（以pb计）≤0.001%，还原糖≤5.0%，分子式:(c6h
10
o5)a
·
xh2o，执行标准:qb/abx 01-034-2005。
47.实施例中采用的粗糊精为药用糊精，执行标准：《中国药典》2015年版四部（具体为购自山东聊城阿华制药股份有限公司的药用糊精）。
48.本发明中提及的厌气肉肝汤按《中国兽用生物制品规程》的组成及制备方法制备，具体组成如下表1所示：表1 厌气肉肝汤组成
49.制法：1. 取牛肉除去脂肪和筋膜，用绞肉机绞碎，与切成100g左右的肝块混合，加蒸馏水，充分搅拌后，冷浸20-24小时。
50.2. 煮沸20-60分钟，补足失去的水份，用白布滤过，弃去肉渣，取出肝块。
51.3. 滤液加入蛋白胨和氯化钠，加热融化，用氢氧化钠溶液调整ph 7.8-8.0，加热煮沸10-20分钟。
52.4. 用滤纸或绒布滤过，加入葡萄糖搅拌，使其融化。
53.5. 将滤过的肝块洗净，切成小方块，用蒸馏水充分冲洗后，分装于试管或中性玻璃瓶内，其量约为预计分装肉肝汤量的1/10。
54.6. 将滤液分装于含有肝块的中性容器中（如为试管，还应加入适量液体石蜡），以116℃高压蒸汽灭菌30-40分钟。
55.7. 用途：供一般厌气菌培养及检验用。用于菌种保存时，不加葡萄糖。
56.实施例中所采用的稀释液（蛋白胨水）组分及配制方法参见《中国兽用生物制品规程》，具体如下表2所示：表2 蛋白胨水组分
57.制法：1. 将以上材料混合，加热溶解，用氢氧化钠溶液调整ph值6.8-7.2。
58.2. 煮沸滤过，分装于中性容器中。
59.3. 116℃高压蒸汽灭菌20分钟。
60.4. 用途：供无菌检验稀释液（含蛋白胨1g），及细菌计数稀释液和糖发酵（含蛋白胨10g）。
61.本发明中所提及的厌气肉肝胃酶消化汤根据《中国兽用生物制品规程》的组成及制备方法制备，具体组成如下表3所示：表3 厌气肉肝胃酶消化汤组成
62.制法：1. 在65℃左右温水内加入盐酸和绞碎的牛肉、肝，充分搅匀，再加入胃蛋白酶充分搅拌，混合后的温度应在56-58℃。
63.2. 置53-55℃条件下消化22-24小时，前10小时每小时充分搅拌一次。
64.3. 提取上清液，加热至80℃，然后加入蛋白胨煮开，调ph至7.6-7.8。煮沸10分钟，滤过或经沉淀后取上清液，按量加入糊精溶解后分装。
65.4. 116℃高压蒸汽灭菌40分钟。
66.5. 用途：供制造梭菌疫苗用。
67.比较例 c型产气荚膜梭菌在传统厌气肉肝胃酶消化汤中培养效果评价
68.一、菌种培养及毒素制备：将真空度良好的含有冻干c型产气荚膜梭菌菌种的安瓶，以无菌炸裂的方法打开，抽取适量无菌营养肉汤溶解冻干菌块，接种于无糖厌气肉肝汤6分试管中，接种量为1-1.5%
（v/v），置36-37℃静止培养10-16h，将培养物进行纯检，纯粹者为一级种子液。
69.将一级种子液按接种量1-1.5%（v/v）接种于350ml/500ml瓶厌气肉肝胃酶消化汤培养基中，置36-37℃静置培养12-16h，随后收集培养物并离心，离心的转速可以为3000rpm，时间可以为30min；收集上清液并过滤，采用0.22μm滤膜进行过滤，所得滤液取样无菌检测符合规定，之后进行测毒。
70.二、毒素效果测定本发明人应用传统厌气肉肝胃酶消化汤制备c型产气荚膜梭菌毒素共进行了28批次实验，测毒方法参见实施例3中的记载，测毒效果如下表4所示：表4 c型产气荚膜梭菌在传统厌气肉肝胃酶消化汤中测毒结果
71.由上表4可知，通过毒力测定，由传统厌气肉肝胃酶消化汤培养制备c型产气荚膜梭菌毒素效果较差，在进行的28批次实验中，仅合格4批，不合格者多达24批，证明传统厌气肉肝胃酶消化汤培养基产毒效果不稳定且效果较差。本发明人采用合格批次灭活脱毒菌液配制羊三联灭活疫苗2批。检测结果：其中1批c型血清中和效价为1 mld，判定符合规定。另1批c型血清中和效价＜1 mld，判定不符合规定（疫苗配制和检测方法参见实施例4的记载）。因此也证明了由传统厌气肉肝胃酶消化汤培养基制备得到的疫苗质量不够稳定。
72.实施例1 c型产气荚膜梭菌产毒培养基筛选
73.一、制备c型产气荚膜梭菌产毒培养基配方1：c型产气荚膜梭菌产毒培养基的配制1. 注射用水800ml，加入蛋白胨20g，酵母浸粉3g，氯化钠3g，na2hpo4·
12h2o 10g，kh2po
4 10g，使溶解。
74.2. 用2mol/l naoh调节ph 7.8-8.2。
75.3. 加入10g粗糊精后，注射用水定容至1000ml。以116℃高压蒸汽灭菌 30分钟，得到培养基组分a，备用。
76.4. 另取无水葡萄糖适量，配制50%葡萄糖溶液（v/v），110℃高压蒸汽灭菌 30分钟，得到培养基组分b，备用。
77.配方2：c型产气荚膜梭菌产毒培养基的配制1. 注射用水800ml，加入蛋白胨20g，酵母浸粉3g，氯化钠3g，na2hpo4·
12h2o 10g，kh2po
4 10g，使溶解。
78.2. 用2mol/l naoh调节ph 7.8-8.2。
79.3. 加入10g糊精（生物试剂）后，注射用水定容至1000ml。以116℃高压蒸汽灭菌 30分钟，得到培养基组分a，备用。
80.4. 另取无水葡萄糖适量，配制50%葡萄糖溶液（v/v）,110℃高压蒸汽灭菌 30分钟，得到培养基组分b，备用。
81.二、菌种培养及毒素制备将真空度良好的含有冻干c型产气荚膜梭菌菌种的安瓶，以无菌炸裂的方法打开，抽取适量无菌营养肉汤溶解冻干菌块，接种于无糖厌气肉肝汤6分试管中，置37℃静止培养16h。同时纯检，纯粹者为一级种子液。
82.将一级种子液按接种量1%（v/v）接种于350ml/500ml瓶中的c型产气荚膜梭菌产毒培养基组分a中，同时无菌加入7.0ml 50%浓度的无菌葡萄糖溶液（组分b）后置37℃静置培养12h，随后收集培养物并离心，离心的转速可以为3000rpm，时间可以为30min；收集上清液并过滤，采用0.22μm滤膜进行过滤，所得滤液取样无菌检测符合规定，之后进行测毒。
83.三、两种c型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果对比结果见下表5。
84.表5 两种c型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果对比
85.表5数据表明，无论是配方1的粗糊精组，还是配方2的糊精(生物试剂)组，通过配比终浓度1%的无菌葡萄糖，获得的产毒效果均能达到《兽用生物制品规程》规定的小鼠1 mld≤0.0025ml的水平，相对于比较例中的结果，本发明的培养基产毒效果更加稳定，并使得该实施例在制备培养基原料的选择方面扩宽了思路，无需局限于传统厌气肉肝胃酶消化汤培养基使用的牛肉、牛肝等不易储存且成本高昂、取材不便的原料，该实施例选择使用市场上容易获得的产品作为制备c型产气荚膜梭菌产毒培养基，不仅原料易得，制备过程简单方便，并且大大节约制备培养基的时间，成本降低为传统厌气肉肝胃酶消化汤的1/5。另外，采用粗糊精的配方1与采用糊精(生物试剂)的配方2相比，根据上表5数据，三次实验中有两次两者产毒效果相当，一次配方2较配方1更好，因此配方2糊精(生物试剂)组的效果相对较好，确定配方中采用糊精(生物试剂)为优选实施例，后续扩大培养试验均采用糊精(生物试剂)作为培养基的组分进行制备本发明的c型产气荚膜梭菌产毒培养基。
86.实施例2 制备c型产气荚膜梭菌产毒培养基
87.采用与实施例1中配方2相同的制备方法，按下表6所列配方制备c型产气荚膜梭菌产毒培养基，并对其产毒效果进行评价。
88.表6 c型产气荚膜梭菌产毒培养基配方(1000ml)
89.注：另取无水葡萄糖适量，配制50%葡萄糖溶液（v/v），110℃高压蒸汽灭菌 30分钟，备用。
90.在该实施例中，本发明人按照上表6中所列配方利用上述实施例1中所述的方法制备c型产气荚膜梭菌产毒培养基备用，随后将真空度良好的含有冻干c型产气荚膜梭菌菌种
的安瓶，以无菌炸裂的方法打开，抽取适量无菌营养肉汤溶解冻干菌块，接种于无糖厌气肉肝汤6分试管中，置37℃静止培养16h。同时纯检，纯粹者为一级种子液。
91.将一级种子液按接种量1%（v/v）分别接种于350ml/500ml三角瓶中的根据配方3、4和5制备的c型产气荚膜梭菌产毒培养基组分a中，同时分别无菌加入7.0ml 50%浓度的无菌葡萄糖溶液（组分b）后置37℃静置培养12h，取样无菌检测符合规定，之后对其产毒效果进行评价。结果表明上表6中所列培养基配方3、4、5制备得到的培养基的产毒效果均能达到与上述实施例1中配方2类似的产毒效果，具体两次平行实验的结果参见表7。
92.表7 c型产气荚膜梭菌产毒培养基配产毒结果（350ml/500ml）
93.实施例3 c型产气荚膜梭菌外毒素的制备及产毒效果评价
94.一、采用实施例1中的配方2进行c型产气荚膜梭菌二级种子液外毒素的制备及产毒效果评价将一级种子液按接种量1-1.5%（v/v）接种350ml/500ml瓶厌气肉肝汤中，置37℃静置培养16h小时，经纯粹检验合格者作为二级种子液。
95.将合格的二级种子液按接种量1.5%（v/v）接种于c型产气荚膜梭菌产毒培养基组分a 40000ml中，同时无菌加入800ml 50%浓度的无菌葡萄糖溶液（组分b）后置37℃静置培养10-16h。
96.分别于培养10h、12h、14h、16h取样，将样品菌液3000rpm/min离心30min，抽取上清用0.22μm滤器过滤，即作为c型产气荚膜梭菌外毒素，稀释后测毒，并测定培养不同时间段菌液中毒素对小白鼠的毒力，以确定最佳产毒时间。
97.取过滤后毒素，用1%蛋白胨水按如下表8所示方法稀释后尾静脉注射16-20g km小白鼠，每滴度注射2只，每只注射0.2ml，观察小鼠在注射后24h内的死亡情况。能使小鼠发生2/2死亡的最小毒素量即为c型产气荚膜梭菌毒素对小鼠的mld。第1次和第2次实验（第1次和第2次为两次平行试验，用于验证产毒稳定性）产毒结果如下表9和表10所示，其中0/2+表示注射2只小白鼠，有0只死亡；1/2+表示注射2只小白鼠，有1只死亡。2/2+表示注射2只小白鼠，有2只死亡。
98.表8 毒素稀释路径
99.表9 第1次实验产毒结果（40000ml规模）
100.由上表9可知：培养10h测定毒力1mld≤0.01ml；培养12h取样测定毒力1 mld≤0.0006ml；培养14h取样测定毒力1 mld≤0.001ml；培养16h取样测定毒力1 mld≤0.002ml。
101.表10 第2次实验产毒结果（40000ml规模）
102.由上表10可知，培养10h测定毒力1mld≤0.01ml；培养12h取样测定毒力1 mld≤0.0006ml；培养14h取样测定毒力1 mld≤0.002ml；培养16h取样测定毒力1mld≤0.0025ml。
103.二、c型产气荚膜梭菌三级种子液外毒素的制备及产毒效果评价将一级种子液按接种量1%接种350ml/500ml瓶厌气肉肝汤，置37℃静止培养16h，经纯粹检验合格者作为二级种子液。
104.将二级种子液按接种量1.5%接种8000ml/10000ml瓶c型产气荚膜梭菌产毒培养基组分a中，同时无菌加入160ml 50%浓度的无菌葡萄糖溶液（组分b）后置37℃静置培养12h，随后经纯粹检验合格者为三级种子液。
105.将合格的三级种子液按接种量1.5%接种于c型产气荚膜梭菌产毒培养基组分a 400000ml中，同时无菌加入8000ml 50%浓度的无菌葡萄糖溶液（组分b）后置37℃静置培养10-16h。
106.分别于培养10h、12h、14h、16h取样，将样品菌液3000rpm/min离心30min，抽取上清用0.22μm滤器过滤，即作为毒素，稀释后测毒。并测定培养不同时间段菌液中毒素对小白鼠的毒力，以确定最佳产毒时间。
107.取过滤后毒素，用1%蛋白胨水按上表8所示的方法稀释后尾静脉注射16-20gkm小白鼠，每滴度注射2只，每只注射0.2ml，观察小鼠在注射后24h内的死亡情况。能使小鼠发生2/2死亡的最小毒素量即为c型产气荚膜梭菌毒素对小鼠的mld。第3次实验产毒结果见下表
11。
108.表11 第3次实验产毒结果（400000ml规模）
109.由上表11可知，培养10h测定毒力1mld≤0.01ml；培养12h取样测定毒力1mld≤0.0008ml；培养14h取样测定毒力1mld≤0.002ml；培养16h取样测定毒力1mld≤0.0025ml。
110.由以上结果可知，本发明采用c型产气荚膜梭菌产毒培养基分别经3次重复扩大培养进行发酵培养c型产气荚膜梭菌，当发酵培养时间为12h时，发酵培养获得的c型产气荚膜梭菌毒素的毒力为1mld≤0.0008ml，均超过了《中华人民共和国兽用生物制品规程》（以下简称《规程》）2000年版规定羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗中c型产气荚膜梭菌毒素0.001-0.0025ml 规定的毒力标准。当发酵培养时间为14h及16h时，发酵培养获得的c型产气荚膜梭菌毒素的毒力为1mld≤0.0025ml，均达到了《规程》2000年版规定羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗中c型产气荚膜梭菌毒素0.001-0.0025ml 规定的毒力标准。结合后续毒素生产利用的情况，在发酵培养c型产气荚膜梭菌时优选发酵培养时间为12-14h，不仅可以达到或超过《规程》规定的毒力标准，还证明了利用本发明的c型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果稳定，得到的c型产气荚膜梭菌毒素毒力稳定且较强，能够有效用于c型产气荚膜梭菌灭活脱毒疫苗的制备。
111.实施例4 羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗的制备及效力评价
112.一、羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗的制备：取事先培养完成的各型菌（d型产气荚膜梭菌、c型产气荚膜梭菌、腐败梭菌）培养物（c型产气荚膜梭菌培养物由实施例3中制备获得），按体积加入0.8%甲醛溶液（40%浓度），置37℃灭活脱毒3-4日（搅拌4次/日）。取灭活脱毒菌液接种厌气肉肝汤、tsb、酪胨琼脂斜面，观察5日均无菌生长，表明灭活完全；同时各灭活菌液3000rpm/min离心30min，弃菌体沉淀吸取上清，将上清用0.22μm滤膜滤过，分别尾静脉注射16~20gkm小白鼠2只，每只注射0.4ml，观察24h均健活表明脱毒完全。
113.取灭活脱毒完全的各型菌液，过滤于装有200目铜纱的灭菌容器内，置2~8℃保存备用。
114.取适量氢氧化铝胶置玻瓶中，并补加适量注射用水（灭菌蒸发量），灭菌，备用。
115.取适量灭活、脱毒完全，2~8℃保存的d型产气荚膜梭菌菌液（d，1 mld≤0.00025ml）、c型产气荚膜梭菌菌液（c，1 mld≤0.0008ml）及腐败梭菌菌液（s，1 mld≤0.005ml），分别置灭菌玻瓶中，分别以2mol/l无菌氢氧化钠溶液调整ph至6.8-7.2。按d:c:s=1:1:1的比例加入装有灭菌氢氧化铝胶的玻瓶中。使菌液与铝胶比例为5:1。振摇混匀，配
制成羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗。置2~8℃保存备用。
116.二、羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗的安全、效力评价：准备16只1.5~2kg北京大耳白兔，其中4只用于采集阴性对照血清，另12只用于安全、效力评价。
117.在北京大耳白兔中的安全检验：取制备好的上述三联灭活疫苗，颈背部皮下注射1.5~2kg北京大耳白家兔4只，5ml/只。观察10日，结果见于下表12中。
118.表12 羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗的安全评价结果
119.由上表12可知，注射的4只北京大耳白兔在观察10日内均健活，并且注射部位未见坏死反应，说明配制的羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗的安全检验符合规定。
120.3ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗在北京大耳白兔上的效力评价：取制备好的上述三联灭活疫苗，颈背部皮下注射1.5~2kg北京大耳白家兔8只，3ml/只。免疫后21日分别对4只阴性对照兔及免疫家兔随机抽取4只进行耳中动脉采血并制备等量混合血清，分别取0.4ml混合血清，测定免疫家兔每0.1ml混合血清对各型产气荚膜梭菌毒素及腐败梭菌毒素的血清中和效价（0.1ml血清中和小鼠mld数）。阴性对照组取0.6ml混合血清进行检测。结果见于下表13中。
121.表13 3ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗在北京大耳白兔上的效力评价结果
122.根据《中国兽用生物制品规程》2000年版规定：免疫兔每0.1ml混合血清对c型产气荚膜梭菌毒素中和效价达到1 个小鼠mld，即判定合格。而根据表13中的数据，表明该实施例中使用利用产毒培养基发酵培养得到的c型产气荚膜梭菌灭活菌液配制的羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，家兔血清中和效价最高可达3个小鼠mld，达到或超过了《中国兽用生物制品规程》标准。且该培养基成本低廉、产毒性能稳定、减少或杜绝了大规模生产中不合格菌液的产生。
123.3ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗在绵羊上的效力评价：选用6-12月龄，体重30-40kg无相应中和抗体的健康绵羊10只，其中4只用于采集阴性对照血清，另6只用于免疫注射，颈部肌肉注射，3ml/只。免疫后21日，分别对4只阴性对照羊及随机抽取的4只免疫羊进行颈静脉采血并制备等量混合血清，分别取0.4ml混合血清，测定免疫羊每0.1ml混合血清对各型产气荚膜梭菌毒素及腐败梭菌毒素血清中和效价（0.1ml血清中和小鼠mld数）。阴性对照组取0.6ml混合血清进行检测。结果见于下表14中。
124.表14 3ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗在绵羊上的效力评价结果
125.上表14中数据结果显示，免疫羊每0.1ml混合血清对c型产气荚膜梭菌及腐败梭菌毒素血清中和效价均不低于1 mld，对d型产气荚膜梭菌毒素血清中和效价不低于3mld。
126.根据《中国兽用生物制品规程》2000年版规定：羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，5ml/只免疫剂量，c型、s型血清中和效价不低于1 mld、d型不低于3 mld即判定合格。而根据上表14中的数据可知，利用本发明的产毒培养基制备的c型产气荚膜梭菌灭活菌液配制的羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，3ml/只免疫剂量即达到或超过了规程标准，证明本发明的c型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果较强，经其配制的疫苗质量较高，能够有效用于大规模的疫苗生产应用，且质量稳定可控。
127.5ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗在绵羊上的效力评价：选用6-12月龄，体重30-40kg无相应中和抗体的健康绵羊10只，其中4只用于采集阴性对照血清，另6只用于免疫注射，颈部肌肉注射，5ml/只。免疫后21日，分别对4只阴性对照羊及随机抽取的4只免疫羊进行颈静脉采血并制备等量混合血清，分别取0.4ml混合血清，测定免疫羊每0.1ml混合血清对各型产气荚膜梭菌毒素及腐败梭菌毒素血清中和效价(0.1ml血清中和小鼠mld数)。阴性对照组取0.6ml混合血清进行检测。结果见于下表15中。
128.表15 5ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗在绵羊上的效力评价
129.上表15中数据结果显示，免疫羊每0.1ml混合血清对c型产气荚膜梭菌毒素血清中和效价不低于1 mld，对腐败梭菌毒素血清中和效价不低于1mld，对d型产气荚膜梭菌毒素血清中和效价不低于3mld。
130.根据《中国兽用生物制品规程》2000年版规定：羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，5ml/羊免疫剂量， c型、s型血清中和效价不低于1 mld、d型不低于3 mld即判定合格。由上表15中数据可知，利用本发明的产毒培养基制备的c型产气荚膜梭菌灭活菌液配制的羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，5ml/只免疫剂量即达到或超过了规程标准。且该培养基成本低廉、产毒性能稳定、减少或杜绝了大规模生产中不合格菌液的产生。证明本发明的c型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果较好，经其配制的疫苗质量较高，能够有效用于大规模的疫苗生产应用，且质量稳定可控。
131.同时，本发明的c型产气荚膜梭菌产毒培养基的制备方法与现有技术内的培养基的制备方法相比还具有下表16中所示的优点，其中以制备10000ml培养基为例进行对比说明。
132.表16 本发明方法与传统工艺相关参数对比（10000ml）
133.对比例1
134.经研究发现在厌氧菌的培养中，加入麦芽糖，可利于其发酵生产。进而本对比例提供一种c型产气荚膜梭菌产毒培养基及其效果验证。具体c型产气荚膜梭菌产毒培养基的配方和制备方法与实施例1中记载的配方2基本相同，区别仅在于，以麦芽糖替换葡萄糖。以该
培养基采用实施例3记载的方法进行菌种培养及毒素制备，并测试产毒效果。最终结果见表17。
135.表17 产毒结果（350ml/500ml瓶规模）
136.由上表17可知：培养10h测定毒力1mld》0.01ml；培养12h取样测定毒力1 mld≤0.0025ml；培养14h取样测定毒力1 mld≤0.01ml；培养16h取样测定毒力1 mld》0.01ml。
137.对比例2
138.本对比例提供一种c型产气荚膜梭菌产毒培养基及其效果验证。具体c型产气荚膜梭菌产毒培养基的配方和制备方法与实施例1中记载的配方2基本相同，区别仅在于，不含组分b——葡萄糖溶液。以该培养基采用实施例3记载的方法进行菌种培养及毒素制备，并测试产毒效果。最终结果见表18。
139.表18 产毒结果（350ml/500ml瓶规模）
140.由上表18可知：培养10h、12h、14h、16h取样测定毒力1mld均》0.01ml。
141.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种c型产气荚膜梭菌产毒培养基，其特征在于，由水、单糖、蛋白胨、酵母浸粉、nacl、na2hpo4·
12h2o、kh2po4和多糖组成；所述单糖为葡萄糖，所述多糖为糊精或粗糊精。2.根据权利要求1所述的c型产气荚膜梭菌产毒培养基，其特征在于，所述c型产气荚膜梭菌产毒培养基由组分a和组分b组成，每1000ml所述组分a由以下重量配比的原料制成：蛋白胨15-25g；酵母浸粉2-4g；nacl2-4g；na2hpo4·
12h2o5-10g；kh2po45-10g；糊精或粗糊精5-10g；余量为水；所述组分b为葡萄糖的水溶液，所述葡萄糖在所述c型产气荚膜梭菌产毒培养基中的终浓度为0.9-1.1%。3.根据权利要求2所述的c型产气荚膜梭菌产毒培养基，其特征在于，每1000ml所述组分a由以下重量配比的原料制成：蛋白胨20g；酵母浸粉3g；nacl3g；na2hpo4·
12h2o10g；kh2po410g；糊精10g；余量为水；所述组分b为浓度为50%的葡萄糖的水溶液。4.根据权利要求1-3任一项所述的c型产气荚膜梭菌产毒培养基，其特征在于，所述c型产气荚膜梭菌产毒培养基的ph值为7.8-8.2。5.一种制备权利要求1-4任一项所述的c型产气荚膜梭菌产毒培养基的方法，其特征在于，所述方法包括：将蛋白胨、酵母浸粉、nacl、na2hpo4·
12h2o、kh2po4与配方量总体积80%的水混合，调节ph值后，与多糖混合后加余量水定容，灭菌，得到培养基组分a；将单糖配制为水溶液，灭菌，得到培养基组分b。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用氢氧化钠调节ph值；和/或，所述培养基组分a的灭菌条件为：116℃高压蒸汽灭菌30分钟；所述培养基组分b的灭菌条件为：110℃高压蒸汽灭菌30分钟。7.一种制备c型产气荚膜梭菌外毒素的方法，其特征在于，以权利要求1-4任一项所述的c型产气荚膜梭菌产毒培养基或权利要求5或6所述的方法制备得到的c型产气荚膜梭菌产毒培养基进行c型产气荚膜梭菌的发酵。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的接种量为1-1.5%（v/v），条件为：在36-37℃下静置培养12-14h。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵时，采用c型产气荚膜梭菌的一级种子液、二级种子液或三级种子液作为发酵菌；所述一级种子液制备时采用无糖厌气肉肝汤作为培养基，所述二级种子液制备时采用厌气肉肝汤作为培养基，所述三级种子液制备时采用权利要求1-4任一项所述的c型产气荚膜梭菌产毒培养基或权利要求5或6所述的方法制备得到的c型产气荚膜梭菌产毒培养基作为培养基；和/或，所述方法还包括在发酵完成后，对获得的发酵液进行离心，取离心上清液进行过滤的步骤；所述离心的条件为3000-4000rpm，20-30min，所述过滤采用0.22μm滤膜进行。10.权利要求7-9任一项所述的方法在制备含有c型产气荚膜梭菌外毒素的疫苗中的应用。

技术总结
本发明涉及生物制品技术领域，具体公开了一种C型产气荚膜梭菌产毒培养基及其制备方法与应用。本发明的C型产气荚膜梭菌产毒培养基，其由水、单糖、蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、Na2HPO4·


技术研发人员：史文瑞 李劼 赵明治 赵丽霞 魏学峰 关平原 韩四娥 张贵刚 闫聪 舒秋婷 李化生 金鹰 杨富贵 刘志龙 狄国栋 罗湘蜀 石明伟 王岩 王婷 孟凯 刘瑞明
受保护的技术使用者：内蒙古金宇生物疫苗股份有限公司
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/7/22